亞洲玉米螟幾丁質合酶基因表達與生理功能研究

亞洲玉米螟幾丁質合酶基因表達與生理功能研究幾丁質是昆蟲表皮,氣管,頭殼,前腸,后腸,胃,腺體分泌形成的外骨骼以及中腸上皮細胞形成的圍食膜中的重要成分。昆蟲幾丁質合酶催化N-乙酰葡萄糖胺多聚化形成不可溶的幾丁質,是昆蟲蛻皮和變態(tài)發(fā)育過程中幾丁質生物合成的關鍵酶。由于幾丁質并不存在于高等動物或高等植物中,因此幾丁質合酶是設計環(huán)境友好殺蟲劑的理想靶標,具有重要的研究價值。昆蟲幾丁質合酶可分為兩類,即A類和B類。其中A類幾丁質合酶(簡稱CHSA)在不同的發(fā)育時期和不同的組織中都發(fā)揮功能,目前已知編碼CHSA的基因CHSA存在一個可變剪切位點從而產生2個同工酶,分別定位于表皮與氣管。而B類幾丁質合酶(簡稱CHSB)主要在昆蟲進食期的中腸中表達,不存在可變剪切形式。因各個組織中的幾丁質組成不同,目前未知組織特異的幾丁質生物合成是如何實現的。本論文以重要農業(yè)害蟲亞洲玉米螟為對象,研究其編碼的兩類幾丁質合酶。重點對A類幾丁質合酶(CHSA)是否存在更多的可變剪切位點,其轉錄產物的表達模式和生理功能以及B類幾丁質合酶(CHSB)的重組表達和其表達產物的細胞定位進行深入研究。論文取得的主要結論包括：1)獲得亞洲玉米螟A類幾丁質合酶(OfCHSA)的cDNA序列(EU376026)和gDNA序列(EU563936)。序列分析表明其含有9個保守的基序,在催化過程中發(fā)揮不同的功能。首次發(fā)現OfCHSA除了19號外顯子存在可變剪切,其2號外顯子也存在可變剪切。這個新的可變剪切位點在其它昆蟲中尚未報道。依據這一線索,我們在同為鱗翅目的家蠶的基因組數據庫中也發(fā)現該可變剪切外顯子。序列分析發(fā)現2號外顯子產生的可變剪切產物各自具有獨立的啟動子,并對蛻皮激素20E的刺激具有不同的響應速度；2)Real-timePCR結果表明OfCHSA基因主要在新生成卵中,幼蟲-幼蟲蛻皮過程,幼蟲成蛹過程和蛹發(fā)育到成蟲的過程中表達,說明該基因參與這些過程的幾丁質生物合成。其表達具有很強的組織特異性,在表皮中的表達量要顯著高于中腸。RNA干擾結果表明A類幾丁質合酶在昆蟲蛻皮及成蛹過程中負責表皮中幾丁質的合成。注射蛻皮激素20E到亞洲玉米螟體內,Real-timePCR結果表明A類幾丁質合酶的表達水平顯著上調；3)通過real-timePCR和RNA干擾實驗進一步研究OfCHSA兩個可變剪切位點產生的四個可變剪切外顯子的功能。結果表明在不同的玉米螟發(fā)育過程中它們表達模式并不相同,具有各自的特點。它們的RNA干擾結果表明它們在昆蟲發(fā)育過程中發(fā)揮的功能并不相同；4)RT-PCR和20E誘導實驗表明OfCHSA通過兩個位置的可變剪切可以產生四種不同的轉錄產物,這四種轉錄產物在昆蟲的發(fā)育過程中發(fā)揮不同的功能。其中外顯子2a相關的轉錄產物作為主要的轉錄產物行使幾丁質合酶的功能,2b相關的轉錄產物能夠很快地響應20E的誘導作用；5)獲得了亞洲玉米螟中B類幾丁質合酶OfCHSB的cDNA序列(DQ294306)和gDNA序列(EU258740)。其轉錄起始位點之前同樣存在一個啟動子,并在啟動子核心區(qū)發(fā)現參與蛻皮激素調控的轉錄因子BR-C和E74a的結合位點。Real-timePCR研究表明獲得的OfCHSB主要在昆蟲進食期的中腸中發(fā)揮功能；6)對OfCHSB的重組表達研究表明,在釀酒酵母細胞中,OfCHSB及其突變體都能夠有效的表達。與GFP融合表達的重組蛋白在酵母細胞中大部分定位于類似內質網的結構中。在昆蟲中腸細胞CF203/2.5中,OfCHSB