兩面針質(zhì)量控制及基于斑馬魚模型評價(jià)兩面針和蒼耳子初步毒性研究

兩面針質(zhì)量控制及基于斑馬魚模型評價(jià)兩面針和蒼耳子初步毒性研究目的:1.建立兩面針?biāo)幉谋由V鑒別、超高效液相色譜法(UltraPerformanceLiquidChromatography,UPLC)指紋圖譜結(jié)合3個(gè)活性成分定量測定方法,旨在為兩面針質(zhì)量控制提供更為全面、有效的評價(jià)方法,為提高兩面針質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù);2.采用斑馬魚模型評價(jià)兩面針?biāo)崛∥锏陌l(fā)育毒性,提供兩面針?biāo)崛∥锏陌l(fā)育毒性數(shù)據(jù);3.采用斑馬魚模型評價(jià)蒼耳子水提取物的發(fā)育毒性和肝毒性,為其臨床用藥的安全性提供參考,旨在驗(yàn)證斑馬魚模型用于快速評價(jià)中藥肝毒性的適用性。方法:1.以乙酸乙酯-甲醇-濃氨(25:1:0.2)為展開劑,采用薄層色譜法鑒別兩面針及其偽品;2.采用UPLC法結(jié)合相似度評價(jià)、聚類分析和主成分分析,建立兩面針?biāo)幉腢PLC指紋圖譜,并進(jìn)行精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性考察。3.采用UPLC法同時(shí)測定兩面針中氯化兩面針堿、乙氧基白屈菜紅堿和芝麻素3個(gè)活性成分的含量,并進(jìn)行方法學(xué)考察;4.以正常發(fā)育受精后6小時(shí)(hourspost-fertilization,6hpf)斑馬魚為模型,評價(jià)兩面針?biāo)崛∥锏陌l(fā)育毒性,在不同時(shí)間點(diǎn)觀察兩面針暴露處理后斑馬魚胚胎的發(fā)育情況,并對相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行測定;5.以正常發(fā)育受精后6小時(shí)(hourspost-fertilization,6hpf)斑馬魚為模型,評價(jià)蒼耳子水提取物的發(fā)育毒性;以正常發(fā)育受精后4天(dayspost-fertilization,4dpf)斑馬魚為模型,利用表型篩選、生理生化指標(biāo)評價(jià)、油紅O染色、吖啶橙染色和組織病理學(xué)等方法評價(jià)蒼耳子水提取物對斑馬魚的肝毒性。結(jié)果:1.薄層色譜鑒別實(shí)驗(yàn)中,展開劑乙酸乙酯-甲醇-濃氨(25:1:0.2)能較好地將毛兩面針?biāo)?、氯化兩面針堿和乙氧基白屈菜紅堿實(shí)現(xiàn)分離,表明實(shí)驗(yàn)所用的薄層色譜法可對兩面針的真?zhèn)芜M(jìn)行有效鑒定。2.首次建立了兩面針?biāo)幉腢PLC指紋圖譜,并得到25個(gè)共有色譜峰,其中指認(rèn)出氯化兩面針堿、乙氧基白屈菜紅堿和芝麻素3個(gè)色譜峰,相似度評價(jià)結(jié)果表明12批兩面針?biāo)幉牡南嗨贫葹?.807～0.959;聚類分析和主成分分析結(jié)果表明12批兩面針?biāo)幉目煞譃閮深?其中S1、S2、S4、S7和S9為一類,S3、S5、S6、S8、S10、S11和S12為一類。此外,偽品的色譜圖與兩面針指紋圖譜的共有模式存在較大差異,表明所建立的指紋圖譜方法能較好地區(qū)分兩面針?biāo)幉呐c其偽品。3.建立了UPLC同時(shí)測定兩面針中氯化兩面針堿、乙氧基白屈菜紅堿和芝麻素含量的方法,并通過了方法學(xué)考察,結(jié)果氯化兩面針堿、乙氧基白屈菜紅堿和芝麻素的含量分別為1.2946～2.4975mg·g-1、0.8972～4.4132mg·g-1、0.2694～2.0540mg·g-1該方法可作為兩面針中氯化兩面針堿、乙氧基白屈菜紅堿和芝麻素的含量測定方法。4.兩面針發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)中,低濃度(≤50μg·L-1)兩面針?biāo)崛∥锉┞短幚淼陌唏R魚胚胎發(fā)育正常,與對照組無顯著差異(P>0.05);而高濃度(≥100μg·mL-1)暴露處理時(shí),引起斑馬魚胚胎發(fā)育畸形,包括頭尾部發(fā)育遲緩、自主運(yùn)動(dòng)缺失、心率降低,黑色素減少、心包腫大、卵黃囊腫大等,甚至出現(xiàn)心跳停止或死亡。在一定濃度范圍內(nèi),隨著兩面針?biāo)崛∥餄舛鹊脑黾?斑馬魚胚胎心率和孵化率不斷降低,體長不斷變短,畸形率和死亡率不斷增加。5.蒼耳子發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)中,40μg·mL-1蒼耳子水提取物暴露處理的斑馬魚胚胎發(fā)育正常,與對照組無顯著差異(P>0.05),280μg·mL-1蒼耳子水提取物暴露能導(dǎo)致斑馬魚胚胎發(fā)育完全被抑制;蒼耳子水提取物濃度為160μg·L-1時(shí)會(huì)顯著降低48hpf斑馬魚胚胎的心跳次數(shù)(P<0.05),并在72hpf時(shí)出現(xiàn)心包水腫、卵黃囊吸收延遲等畸形發(fā)育。蒼耳子肝毒性實(shí)驗(yàn)中,800μg·mL-1蒼耳子水提取物暴露處理24h后斑馬魚肝臟面積顯著增加(P<0.05),透明度降低,卵黃囊吸收延遲,部分魚體肝臟輪廓不清晰;病理切片結(jié)果顯示肝臟細(xì)胞出現(xiàn)空泡、細(xì)胞排列松散等現(xiàn)象;油紅O染色結(jié)果顯示肝臟區(qū)域出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)累積;吖啶橙染色結(jié)果顯示在肝臟區(qū)域存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象;此外,蒼耳子水提取物暴露處理后顯著降低斑馬魚體內(nèi)超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)活性、升高丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alaninetransaminase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartatetransaminase,AST)活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量(P<0.05)。而600μg·mL-1蒼耳子水提取物暴露處理斑馬魚與對照組無顯著差異(P>0.05)。綜上,蒼耳子可能通過氧化應(yīng)激進(jìn)而造成細(xì)胞凋亡來誘導(dǎo)斑馬魚肝毒性。結(jié)論:本課題建立了基于薄層色譜鑒別、UPLC指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)成分定量測定的兩面針質(zhì)量控制方法,為兩面針質(zhì)量控制提供更為全面、有效的評價(jià)方法,為提高兩面針質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù);毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表