熒光定量PCR技術(shù)原理與結(jié)果分析-圖文

熒光定量PCR技術(shù)原理與結(jié)果分析_圖文.ppt一、含義二、優(yōu)越性三、應(yīng)用四、定量方法五、熒光材料六、結(jié)果分析一、含義實時熒光定量PCR技術(shù)(Real-TimeQuantitativePCR)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。二、優(yōu)越性特異性熒光定量PCR具有引物和探針的雙重特異性，故與傳統(tǒng)的PCR相比，特異性大為提高。敏感性熒光定量PCR的敏感度通常達E2拷貝/ml，對數(shù)期分析，線性范圍很寬，為0-E11拷貝/ml。一般來講臨床標本中病原體的數(shù)目為0-E10/拷貝，在此范圍內(nèi)熒光定量PCR定量較為準確，標本不需稀釋。重復(fù)性熒光定量PCR結(jié)果相當(dāng)穩(wěn)定，因為域值設(shè)置在指數(shù)擴增期.在此階段，各反應(yīng)組分濃度相對穩(wěn)定，沒有副作用，CT與熒光信號的對數(shù)呈線性關(guān)系。與終點法相比CT值能更穩(wěn)定，更精確地反映起始模板的拷貝數(shù)。自動化無PCR后續(xù)操作步驟，降低產(chǎn)物污染的風(fēng)險性。三、應(yīng)用用于核酸的定量如RNA、DNA的定量用于核酸定性分析如SNP分析，基因型分析，RNA變異分析，溶解曲線分析等。四、定量方法1.

標準曲線法的絕對定量2.

標準曲線法的相對定量

3.

比較CT法的相對定量

五、熒光材料熒光探針和熒光染料

SYBRgreenI

水解探針TaqMan

分子信標

雜交探針SYBRgreenI未結(jié)合的SYBRgreenI水解探針TaqMan熒光素淬滅劑

與目標序列互補FAMTETJOEHEXVIC

TAMRADABCYL探針與目標序列配對時，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)光能量轉(zhuǎn)移Taq游離的探針熒光基團

淬滅劑

延伸時，Taq酶水解探針，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離而發(fā)出熒光，形成熒光信號

Taq發(fā)出熒光光另一波長的熒光分子信標熒光基團莖由互補配對的序列組成環(huán)與目標序列互補

淬滅劑

莖(5-7bp)

環(huán)（15-30bp）FAMTexasRed探針雜交到DNA模板光發(fā)出熒光DNA模板淬滅劑

莖

環(huán)光淬滅雜交探針5’5’5’發(fā)出熒光5’5’5’5’六、結(jié)果分析基線（Baseline）指在PCR擴增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即基線。光域值threshold的設(shè)定一般將PCR反應(yīng)前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值是PCR3-15個循環(huán)熒光信號標準差的10倍，熒光域值設(shè)定在PCR擴增的指數(shù)期。CT值表示每個PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值