佛手散化學(xué)成分分析及其抗腦缺血作用的研究

佛手散化學(xué)成分分析及其抗腦缺血作用的研究佛手散,又名芎勞湯,出自宋·許叔微《普濟本事方》卷十,由當(dāng)歸和川芎兩味中藥組成,既是古方,又是一著名藥對。該方組方精良,配伍嚴(yán)謹(jǐn),具有活血化瘀、氣血兼顧、祛風(fēng)止痛之功效。古時主治婦女月經(jīng)不調(diào)、胎前產(chǎn)后血虛頭暈、頭痛,心腹諸痛等病證?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)該方具有抗血小板聚集、抑制血管平滑肌增生、改善血液循環(huán)、抗腦缺血及抗氧化等多種功效。近年臨床上多用于治療腦中風(fēng)、腦動脈硬化、深靜脈血栓等心腦血管疾病,療效確切。盡管佛手散及其單味藥、有效成分等已在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用,組方單味藥當(dāng)歸和川芎的物質(zhì)基礎(chǔ)研究也取得了相當(dāng)?shù)倪M展,但從方劑整體水平上研究佛手散的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)、抗腦缺血的藥理作用卻鮮有報道。本課題以佛手散水煎劑為研究對象,建立其指紋圖譜分析方法及指標(biāo)成分測定方法,從定性定量的角度檢測佛手散水煎劑的內(nèi)在質(zhì)量,獲得湯劑中所含的化學(xué)成分信息。結(jié)合體內(nèi)和體外不同層次的腦缺血損傷模型,分別從整體動物和細(xì)胞兩個水平上研究佛手散水煎劑對缺血性腦損傷的保護作用,在此基礎(chǔ)上,進一步對復(fù)方佛手散全方及不同萃取部位進行體外抗腦缺血藥效篩選實驗,探討其抗腦缺血的有效部位及有效成分。采用優(yōu)選的水提工藝對佛手散水煎劑進行制備,以10批佛手散水煎劑樣品為研究對象,運用HPLC法建立該方水煎劑指紋圖譜,利用“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)”軟件對10批樣品的相似度進行評價,建立佛手散水煎劑指紋圖譜的共有模式,測得各批次樣品與共有模式的相似度,結(jié)果表明各批樣品中共有峰的相對保留時間基本一致,RSD均小于1%,相似度均大于0.94,符合中藥指紋圖譜的技術(shù)要求,所建立的共有模式能較好地反映出全方化學(xué)成分質(zhì)與量的分布情況,并通過復(fù)方與組方藥味指紋圖譜的相關(guān)性分析,對其化學(xué)物質(zhì)組成進行初步表征,研究結(jié)果可為該方的質(zhì)量控制和化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考依據(jù)。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用超高效液相色譜-電噴霧-質(zhì)譜(UPLC-ESI-MS)技術(shù)對佛手散的化學(xué)成分進行了定性鑒別,通過對質(zhì)譜和光譜數(shù)據(jù)的解析,結(jié)合部分對照品和參考文獻的比對,對標(biāo)定的16個色譜峰進行了分析鑒定,成功鑒定了其中的11個組分,分別是綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、川芎酚、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、丁烯基苯酞、丁基苯酞、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯以及鄰苯二甲酸二丁酯,初步明確了佛手散水煎劑的主要化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。據(jù)文獻報道,阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯被證實是對心腦血管發(fā)揮作用的有效成分,因此本研究運用UPLC法首次建立了佛手散水煎劑中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A及藁本內(nèi)酯4種有效成分的含量測定方法。結(jié)果表明該方法操作簡便、精密度高,可為其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。為進一步確證佛手散抗缺血性腦損傷的療效,本研究結(jié)合體內(nèi)和體外不同層次的腦缺血損傷模型,分別從整體動物和細(xì)胞兩個水平上研究該方湯劑對缺血性腦損傷的保護作用。首先采用線栓法建立大鼠大腦中動脈阻塞局灶性腦缺血再灌注(middlecerebralarteyocclusion,MCAO)模型,從整體動物水平上考察佛手散水煎劑對實驗性腦缺血損傷的保護作用,結(jié)果顯示,佛手散對實驗性腦缺血所致的大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙、腦水腫程度以及腦梗死體積均有明顯的改善作用,且作用呈劑量依賴性,表明佛手散水煎劑對腦缺血再灌注損傷具有良好的保護作用,其機制可能通過增加腦組織中抗氧化酶活力、降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等發(fā)揮效應(yīng)。此外,本研究采用連二亞硫酸鈉合并缺糖建立體外PC12細(xì)胞氧糖剝奪(oxygen-glucosedepriviation,OGD)損傷模型,從細(xì)胞水平上考察該方對PC12神經(jīng)細(xì)胞缺氧缺糖損傷的保護作用,結(jié)果顯示,相比于模型組,佛手散水煎劑預(yù)處理組對缺氧缺糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有明顯的保護作用,可劑量依賴性的減少細(xì)胞中MDA和NO含量,提高SOD活性,此可能是佛手散水煎劑發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制之一。在體內(nèi)外實驗證實佛手散水煎劑具有抗腦缺血作用的基礎(chǔ)上,本課題借助傳統(tǒng)植化手段,采用不同溶劑對佛手散全方進行梯度萃取,分別得到乙酸乙酯、正丁醇和殘余水三個萃取部位,通過UPLC指紋圖譜對不同部位的化學(xué)成分進行表征,同時以體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞建立氧糖剝奪(OGD)損傷模型,直接在細(xì)胞水平上考察佛手散各部位對神經(jīng)細(xì)胞缺血樣損傷的影響,以篩選佛手散水煎劑抗腦缺血的有效部位及有效成分。藥效篩選結(jié)果表明乙酸乙酯部位對PC12細(xì)胞OGD損傷的抑制作用較強,抑制率大于50%,與全方組藥效相近；殘余水部位的抑制作用次之；而正丁醇部位的抑制作用不明顯。推測乙酸乙酯部位和殘余水部位為佛手散抗缺血性腦損傷的有效部位,其藥效成分可能主要集中于上述兩個部位。綜合前期UPLC-ESI-MS分析結(jié)果,乙酸乙酯部位主要是阿魏酸和咖啡酸以及洋川芎內(nèi)酯A、H、I、丁基苯酞、丁烯基苯酞、藁本內(nèi)酯等苯酞類化合物。據(jù)此推測上述化合物可能是佛手散水煎劑抗腦缺血的