(全國百強校)江西上高第二中學高三二輪練習生物資料：血紅蛋白的提取和分離

課題3血紅蛋白的提取和分離羅軍輝思考蛋白質的分離和提取的原理是什么？根據(jù)蛋白質各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質和多少、溶解度和吸附的性質和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同蛋白質。一、基礎知識㈠凝膠色譜法（分配色譜法）：1、凝膠：一些微小多孔的球體（內含許多貫穿的通道，多數(shù)由多糖類構成：如葡聚糖、瓊脂糖）

2、概念：根據(jù)相對分子質量的大小分離蛋白質的有效方法。3、原理：當不同的蛋白質通過凝膠時，相對

的蛋白質容易進入凝膠內部的通道，路程

，移動速度

，而

的蛋白質無法進入凝膠內部的通道，只能在

移動，路程

，移動速度

，相對分子質量不同的蛋白質因此得以分離。較長較慢相對分子質量較大凝膠外部較短較快相對分子質量較小4、具體過程（二）緩沖溶液

1、概念在一定的范圍內，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液能夠抵制外界的酸或堿的對溶液的PH值的影響，維持PH基本不變2、作用3、緩沖溶液的配制通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內使用的緩沖液思考：在血紅蛋白整個實驗室中用的緩沖液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細胞內的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結構和功能，便于觀察(紅色)和科學研究(活性)（三）電泳：1、概念帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程2、原理②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團會帶上正電或負電

③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質的差異以及分子本身的大小，形狀的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離3、類型瓊脂糖凝膠電泳和聚丙稀酰胺凝膠電泳4、實例由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結構的凝膠十二烷基磺酸鈉（SDS）—聚丙稀酰胺凝膠電泳測定蛋白質分子量①應用②聚丙稀酰胺凝膠蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素③原理④SDS作用為了消除靜電荷對遷移率的影響可以在凝膠中加入SDSSDS能使蛋白質發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質復合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質形成蛋白質—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種電荷間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大?、軸DS作用機理二、實驗操作樣品處理——粗分離——純化——純度鑒定蛋白質提取和分離步驟血液組成操作過程血液血漿水分固體物質血漿蛋白無機鹽磷脂葡萄糖等血細胞白細胞血小板紅細胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個a-肽鏈兩個β-肽鏈四個亞鐵紅素基團①成分｛｛｛｛｛四個亞鐵紅素基團兩個a-肽鏈兩個β-肽鏈每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團，此基團可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色②組成及作用本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液來分離血紅蛋白③選材1、紅細胞的洗滌①洗滌紅細胞目的除去其中的雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化②洗滌操作A、采集血樣B、低速短時間離心（速度越高和時間越長會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀達不到分離的效果）（二）樣品處理C、吸出血漿：上層透明的黃色血漿；將下層暗紅色的紅細胞液體倒入燒杯D、鹽水洗滌：用五倍體積的質量分數(shù)為0.9％的氯化鈉溶液洗滌，攪拌E、低速離心（低速短時間）F、重復4、5步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，表明洗滌干凈。洗滌次數(shù)不可過少,過少無法除去血漿蛋白。2.血紅蛋白的釋放加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分攪拌10分鐘（加速細胞破裂）,細胞破裂釋放出血紅蛋白3.分離血紅蛋白溶液①過程將攪拌好混合液轉移到離心管內，以2000r/min的速度離心10min第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）第2層（中上層）：脂溶性物質沉淀層（白色薄層固體）第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）第4層（最下層）：雜質沉淀層（暗紅色）②試管中溶液層次用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體③分離取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時方法：透析除去樣品中分子量較小的雜質操作：透析目的:（二）粗分離（三）純化方法：凝膠色譜法1.凝膠色譜柱的制作①取長40厘米，內徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平②底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導致液體殘留，蛋白質分離不徹底注意事項：⑤安裝其他附屬結構③頂塞的制作打孔安裝玻璃管④組裝將上述三者按相應位置組裝成一個整體2凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇A、材料“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克B、代表意義：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液②凝膠的前處理③凝膠色譜柱的裝填方法A、固定B、裝填將色譜柱處置固定在支架上將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻注意：2、裝填凝膠柱時不得氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內的流動與最終生物大分子物質的分離效果注意：2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時④洗滌平衡3樣品加入與洗脫①調節(jié)緩沖液面②滴加透析樣品吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面打開下端出口，使柱內緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊關閉出口③樣品滲入凝膠床④洗脫加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內，等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口小心加入pH為7的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫⑤收集：待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml一試管，連續(xù)收集（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）討論：答：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內，維持結構和功能⑥注意：正確的加樣操作1、不要觸及破壞凝膠面2、貼壁加樣3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動1、在血紅蛋白的整個過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？2、與其他真核細胞相比，紅細胞有什么特點？這一特點對你進行蛋白質得分離有什么意義？答：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀