位于microRNA結(jié)合位點(diǎn)的基因多態(tài)與心腦血管疾病的相關(guān)性研究

位于microRNA結(jié)合位點(diǎn)的基因多態(tài)與心腦血管疾病的相關(guān)性研究第一部分血管生成素-1基因多態(tài)性與出血性腦卒中相關(guān)心腦血管病是當(dāng)今威脅人類健康的嚴(yán)重疾病之一。據(jù)最新的統(tǒng)計資料顯示:在我國,心腦血管病是僅次于癌癥的第二大致死疾病。腦卒中是心腦血管疾病主要類型之一,存在著明顯三高(發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高)現(xiàn)象。引起腦卒中的原因眾多,如高齡、吸煙、飲酒、高血壓、高血脂、高血糖、心臟病、凝血機(jī)制障礙等,此外許多證據(jù)表明遺傳因素在腦卒中的發(fā)病中有顯著作用。尋找腦卒中的致病基因,從分子水平揭示腦卒中的發(fā)病機(jī)理,可為及早發(fā)現(xiàn)腦卒中的危險人群、預(yù)防腦卒中的發(fā)生提供幫助。腦卒中是一種復(fù)雜疾病,發(fā)病過程涉及動脈粥樣硬化病變。在動脈粥樣硬化和動脈疾病的病理生理學(xué)過程中,血管發(fā)生足研究的熱點(diǎn)。血管生成素-1(Angiopoietin1,ANGPT1)是一種特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子,足酪氨酸激酶受體Tie-2的特異性配體。血管生成素-1在血管發(fā)生過程中起到了重要作用,它可以促進(jìn)血管重塑、成熟、阻止內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,具有維持血管的完整性,促進(jìn)血管損傷修復(fù)的功能。血管生成素-1的功能提示我們,任何影響其表達(dá)的基因多態(tài)性,都可能會與血管性疾病相關(guān)。通過對文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫的查詢,我們發(fā)現(xiàn),血管生成素-1的3’-UTR區(qū)域存在SNP+1602A/T,該位點(diǎn)被預(yù)測位于microRNA的結(jié)合識別區(qū)域,可能會影響microRNA與mRNA的結(jié)合。因此我們假設(shè),+1602A/T可以影響血管生成素-1的表達(dá),可能與腦卒中相關(guān)。為了證明我們的假設(shè),我們設(shè)計了熒光素酶報告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn),通過檢測熒光素酶的表達(dá)來驗(yàn)證SNP是否影響基因表達(dá)。首先我們構(gòu)建了含有SNP的熒光素酶質(zhì)粒,然后與micorRNA或者對照一起共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞,最后通過雙熒光素酶檢測來確定基因表達(dá)的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí):在microRNA存在的條件下,與SNP位點(diǎn)為T的熒光素酶質(zhì)粒相比,SNP位點(diǎn)為A的熒光素酶質(zhì)粒表達(dá)下降超過50%(P＜0.01)。而在對照或者空白條件下,無論攜帶哪一種SNP位點(diǎn),熒光素酶的表達(dá)均不發(fā)生改變。這說明microRNA可以通過識別不同的SNP對表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。在驗(yàn)證了SNP的功能以后,我們進(jìn)一步采用病例對照的研究方法,以兩個獨(dú)立的中國漢族樣本為研究對象,探討了血管生成素-1的SNP+1602A/T在腦卒中患者各個亞型和正常對照中的分布,檢測SNP是否與腦卒中相關(guān)?；蛐丸b定采用聚合酶鏈反應(yīng)-連接酶檢測反應(yīng)(PCR-LDR)?；蛐皖l率的分布符合Hardy—Weinberg平衡。在第一個研究人群中,共計有腦?；颊?03例,腔梗患者499例,出血性腦卒中患者489例,正常對照1843例進(jìn)行了基因分型,各組間年齡、性別相匹配。結(jié)果顯示:在正常對照中該基因分布為AA型31.9%、AT型48.5%、TT型19.6%;等位基因A和T的頻率分別為0.561和0.439。在腦?；颊呓M中該基因分布為AA型34.9%、AT型46.9%、TT型18.2%;等位基因A和T的頻率分別為0.583和0.417。與對照組相比,腦?；颊呓M中三種基因型分布沒有顯著性差異。在腔梗患者組中該基因分布為AA型39.5%、AT型48.3%、TT型12.2%:等位基因A和T的頻率分別為0.636和0.364。與對照組相比,腔?；颊呓M中AA型和TT型分布存在顯著性差異(P＜0.01)。在出血性腦卒中組中該基因分布為AA型41.1%、AT型49.1%、TT型9.8%;等位基因A和T的分布頻率分別為0.656和0.344。與對照組相比,出血性腦卒中組中AA型和TT型分布存在顯著性差異(P＜0.01)。Logistic回歸分析結(jié)果證明:在校正了傳統(tǒng)危險因素以后,血管生成素-1的+1602AA基因型是引起出血性腦卒中的獨(dú)立危險因素(P＜0.01)。在第二個研究人群中,共計有缺血性腦卒中患者238例,出血性腦卒中患者157例,正常對照790例進(jìn)行了基因分型,各組間年齡、性別相匹配。結(jié)果顯示:在正常對照中該基因分布為AA型32.9%、AT型47.8%、TT型19.3%;等位基因A和T的頻率分別為0.568和0.432。在缺血性腦卒中組中該基因分布為AA型40.8%、AT型48.7%、TT型10.5%;等位基因A和T的頻率分別為0.595和0.405。與對照組相比,AA型和TT型分布存在顯著性差異(P＜0.01)。在出血性腦卒中組中該基因分布為AA型43.3%、AT型47.1%、TT型9.6%;等位基因A和T的頻率分別為0.669和0.331。與對照組相比,AA型和TT型分布存在顯著性差異(P＜0.01)。Logistic回歸分析結(jié)果證明:在校正了傳統(tǒng)危險因素以后,血管生成素-1的+1602AA基因型是引起缺血性腦卒中的獨(dú)立危險因素(P=0.047);同時血管,生成素-1的+1602AA基因型也是引起出血性腦卒中的獨(dú)立危險因素(P＜0.01)。通過分析兩個獨(dú)立樣本的研究結(jié)果,確認(rèn)血管生成素-1的+1602AA基因型可以增加出血性腦卒中的發(fā)病風(fēng)險,但對于缺血性腦卒中的發(fā)病影響尚存在不同的結(jié)果,需要進(jìn)一步研究。本研究選擇血管生成素-1的SNP+1602A/T作為研究對象,研究SNP的功能以及與腦卒中的相關(guān)性。結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)SNP+1602A/T可以通過影響microRNA與mRNA的結(jié)合來影響血管生成素-1的表達(dá)。進(jìn)一步的病例對照研究則顯示+1602AA基因型與出血性腦卒中明顯相關(guān),可以增加發(fā)病風(fēng)險。這一發(fā)現(xiàn)可以用于開發(fā)新的檢測方法,以便及早發(fā)現(xiàn)腦卒中的危險人群、預(yù)防腦卒中的發(fā)生。同時,這一發(fā)現(xiàn)也為治療腦卒中提供了新的治療靶點(diǎn)和思路。第二部分血管緊張素Ⅱ1型受體基因多態(tài)性與冠心病相關(guān)冠心病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病,是心血管疾病中最主要的死亡原因。腎素—血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensinsystem,RAS)作為心血管系統(tǒng)中最重要的調(diào)控通路,在冠心病的病理生理學(xué)過程中起到了非常重要的作用。血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)是RAS系統(tǒng)中的一個重要的成員,而AngⅡ1型受體(AT1R)作為AngⅡ最主要的受體,對于AngⅡ的功能發(fā)揮有著重要的影響。最新的研究報告,位于AT1R的3’-UTR上的SNPrs5186(A1166C)可以影響miR-155與mRNA的結(jié)合。當(dāng)1166位點(diǎn)為A時,miR-155可以結(jié)合AT1R的mRNA,下調(diào)AT1R的表達(dá),而當(dāng)1166位點(diǎn)為C時,miR-155不能結(jié)合。而AT1R的表達(dá)不一樣,對冠心病的發(fā)病也可能會產(chǎn)生影響。因此我們采用病例對照研究,來研究SNPA1166C與冠心病的發(fā)病是否相關(guān)。通過冠狀動脈造影檢查,我們共收集了455例冠心病患者和465例對照。提取被調(diào)查者的基因組DNA,采用等位基因特異性PCR對AT1RSNP位點(diǎn)rs5186(A1166C)進(jìn)行基因分型,最后進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在冠心病病人和對照之間,SNPrs5186基因型存在差異。冠心病病人中,AA基因型為229人(50.3%),AC基因型為188人(41.3%),CC基因型為38人(8.4%),而正常對