海洋細(xì)菌胞外多糖EPS11抗腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究

海洋細(xì)菌胞外多糖EPS11抗腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究癌癥作為世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題之一,嚴(yán)重威脅人類生命健康,并且其發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)持續(xù)攀升的趨勢。其中,轉(zhuǎn)移作為癌癥患者預(yù)后不良的重要因素,仍然是惡性腫瘤患者的主要死因之一。目前,針對腫瘤轉(zhuǎn)移的臨床治療手段主要是化學(xué)治療,然而市場上大多數(shù)化療藥物都存在一定的毒副作用。長期的化療會誘導(dǎo)癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性,將進(jìn)一步降低化療藥物在腫瘤臨床治療中的效果。海洋微生物多糖因其具有生物相容性好,低毒以及容易獲得等優(yōu)勢,已經(jīng)成為海洋科學(xué)研究的重點(diǎn)之一,能夠?yàn)檠邪l(fā)高效低毒的抗腫瘤轉(zhuǎn)移新藥提供候選化合物。EPS11是我們實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)的一種有抗腫瘤效果的海洋細(xì)菌多糖,具有潛在的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的潛力,但相應(yīng)的分子機(jī)制并不清晰。本論文結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等手段從體外和體內(nèi)兩個(gè)層次詳細(xì)研究了EPS11抗腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,為開發(fā)多糖類抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物提供了可靠的理論依據(jù)和藥物前體。本研究首先通過MTT法檢測EPS11對多種肝癌細(xì)胞的毒性,表明其能夠濃度和時(shí)間依賴性地抑制肝癌細(xì)胞Huh7.5、Bel-7402和HepG2的增殖。同時(shí),利用光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)EPS11能夠引起肝癌細(xì)胞Huh7.5、Bel-7402和HepG2的聚集成團(tuán)、脫黏附。進(jìn)而,我們通過結(jié)晶紫染色法定量檢測了EPS11對肝癌細(xì)胞黏附率的影響,并利用掃描電鏡(SEM)觀察了EPS11對細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的作用。結(jié)果顯示,EPS11能夠濃度和時(shí)間依賴性地降低肝癌細(xì)胞的黏附能力,破壞肝癌細(xì)胞表面的偽足狀結(jié)構(gòu)。細(xì)胞黏附率的降低與細(xì)胞偽足狀結(jié)構(gòu)數(shù)量的減少相一致,表明細(xì)胞表面?zhèn)巫銧罱Y(jié)構(gòu)在肝癌細(xì)胞黏附方面扮演著重要的角色。為了深入探究EPS11抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功能,本研究進(jìn)一步利用劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)證明了EPS11能夠通過降低肝癌細(xì)胞Huh7.5的黏附能力并破壞其表面結(jié)構(gòu)而抑制肝癌細(xì)胞Huh7.5的遷移。本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)全面分析了EPS11對肝癌細(xì)胞Huh7.5生物學(xué)的進(jìn)程影響,進(jìn)一步揭示EPS11抑制肝癌細(xì)胞Huh7.5生長增殖和轉(zhuǎn)移的機(jī)制。通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)EPS11作用Huh7.5細(xì)胞后,大量細(xì)胞黏附分子的表達(dá)水平顯著下調(diào)。其中,細(xì)胞黏附分子CD99下調(diào)最為顯著。由于CD99在細(xì)胞增殖、黏附、遷移以及分化等方面均發(fā)揮重要的作用,我們將其作為EPS11作用的關(guān)鍵效應(yīng)分子進(jìn)行深入研究。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)和Westernblotting對蛋白質(zhì)組的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)EPS11在mRNA和蛋白水平上均能夠顯著下調(diào)CD99的表達(dá),尤其是在蛋白水平。進(jìn)而我們在肝癌細(xì)胞Huh7.5中過表達(dá)CD99分子,并檢測此時(shí)EPS11對肝癌細(xì)胞Huh7.5增殖率、黏附能力和遷移能力的影響,進(jìn)而驗(yàn)證CD99在EPS11抑制肝癌細(xì)胞Huh7.5增殖和遷移進(jìn)程中的重要性。結(jié)果表明,過表達(dá)CD99能夠部分逆轉(zhuǎn)EPS11引起的肝癌細(xì)胞Huh7.5增殖率、黏附能力和遷移能力的降低,進(jìn)一步證實(shí)CD99在EPS11的抗肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)制中發(fā)揮著重要作用,同時(shí)也為CD99作為肝癌靶向治療的重要標(biāo)志分子提供了證據(jù)。為進(jìn)一步探究EPS11在體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的效果,本研究采用黑色素瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移小鼠模型進(jìn)行驗(yàn)證。與對照組相比,注射了EPS11后能夠顯著減少小鼠體內(nèi)黑