五種雞堆型艾美耳球蟲DNA疫苗免疫保護(hù)效果比較

五種雞堆型艾美耳球蟲DNA疫苗免疫保護(hù)效果比較雞球蟲病是一種寄生在細(xì)胞內(nèi)的原蟲疾病,給養(yǎng)禽業(yè)所帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失極為嚴(yán)重。堆型艾美耳球蟲屬于中等毒力的小腸感染的球蟲,其分布很廣各種年齡雞均可感染,感染后產(chǎn)生的免疫力弱,常引起亞臨床型球蟲病。受感染雞群增重受阻和產(chǎn)蛋量下降。這種亞臨床型球蟲病不易引起人們的重視,常引起飼料報(bào)酬降低和繼發(fā)感染,該球蟲實(shí)際引起的損失,比一般認(rèn)識(shí)要大的多,給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前,應(yīng)用藥物防治遇到了球蟲耐藥性和藥物殘留的問題,大大限制了養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展,球蟲防治需要尋求新的途徑。實(shí)踐證明,激發(fā)宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)來(lái)防治雞球蟲病是更有效的途徑之一。DNA疫苗的一個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)是刺激機(jī)體產(chǎn)生廣泛的細(xì)胞免疫反應(yīng)和持久的免疫記憶,尤其是聯(lián)合應(yīng)用一些細(xì)胞因子,構(gòu)建調(diào)節(jié)型疫苗,更有誘人的應(yīng)用前景。為此我們選擇堆型艾美耳球蟲3-1E抗原基因分別與雞細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-18基因,通過(guò)DNA彭耳技術(shù)串聯(lián)為一體,插入到相關(guān)真核表達(dá)載體當(dāng)中,分別構(gòu)建了pVAX1.0-3-1E、pVAX1.0-3-1E-IFN-γ、pVAX1.0-3-1E-IL-2、pVAX1.0-3-1E-IL-17、pVAX1.0-3.1E-IL-18五種DNA疫苗,進(jìn)行動(dòng)物免疫保護(hù)性試驗(yàn)比較這些DNA疫苗的免疫保護(hù)效果。實(shí)驗(yàn)具體分為以下幾個(gè)部分:1堆型艾美耳球蟲3-1E基因的克隆、鑒定及序列分析根據(jù)已發(fā)表的E.acervulina3-1E基因序列,利用電腦軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物,從E.acervulina孢子化卵囊中提取總RNA,然后應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出E.acervulina3-1E基因并與PMD18-T載體連接,對(duì)其進(jìn)行酶切鑒定、PCR鑒定和序列分析。結(jié)果表明,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為528bp,與GenBank上登錄的E.acervulina3-1E比較,其核苷酸序列同源性為99%。2堆型艾美耳球蟲3—1E基因的原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物純化將E.acervulina3-1E基因克隆至原核表達(dá)載體PET-28(a)中并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.ColiBL21,通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。SDS電泳顯示,表達(dá)的融合蛋白的分子量22kD左右,且在誘導(dǎo)表渤小時(shí)表達(dá)量最多。細(xì)菌經(jīng)超聲波裂解破碎,TritonX-100洗滌,得到的包涵體被純化,SDS電泳顯示,PET-28(a)-3-1E表達(dá)的重組蛋白大部分存在于上清中,包涵體中含量很少。3DNA疫苗的構(gòu)建利用重組DNA技術(shù),構(gòu)建了pVAX1.0-3-1E、pVAX1.0-3-1E-IFN-γ、pVAX1.0-3-1E-IL-2、pVAX1.0-3.1E-IL-17和pVAX1.0-3.1E-IL-18疫苗,酶切鑒定正確后,將重組質(zhì)粒按100ug/羽雞分別接種14日齡雛雞,7天后取注射部位肌肉、非注射部位肌肉,用RT-PCR和Western-blot檢測(cè)保護(hù)性抗原的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)情況。結(jié)果表明3-1E、IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-18基因均能在注射部位轉(zhuǎn)錄與表達(dá),但在非注射部位均未檢測(cè)到轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄或表達(dá)產(chǎn)物。4堆型艾美耳球蟲DNA疫苗免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為pVAX1.0-3-1E組、pVAX1.0-3-1E-IFN-γ組、pVAX1.0-3-1E-IL-2組、pVAX1.0-3-1E-IL-17組、pVAX1.0-3.1E-IL-18組、非感染非免疫組、感染非免疫組以及3-1E蛋白組。每組30只實(shí)驗(yàn)雞。制備好的基因疫苗和蛋白疫苗經(jīng)肌肉1日齡、21日齡兩次注射雛雞,28日齡經(jīng)口接種新鮮的堆型艾美耳球蟲孢子化卵囊。34日齡撲殺,分別作十二指腸病變記分、OPG值、增重、抗球蟲指數(shù)(ACI)幾個(gè)指標(biāo)測(cè)定,確定其保護(hù)力的大小。結(jié)果表明,帶有ChIFN-γ和IL-2的E.acervulina免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗保護(hù)效果比相對(duì)應(yīng)的DNA疫苗和蛋白疫苗好。構(gòu)建的E.acervulina免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗的保護(hù)效果以pVAX1.0-3-1E-IFN-7和pVAX1.0-3-1E-IL-2最好,其增重最大,十二指腸病變記分和OPG值最小,ACI分別為180.36,180.04;其次為pVAX1.0-3-1E