幾丁寡糖聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌A549細(xì)胞及其移植瘤的影響

幾丁寡糖聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌A549細(xì)胞及其移植瘤的影響目的:1.通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),分析中藥降解產(chǎn)物幾丁寡糖單獨(dú)應(yīng)用及與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖、遷移、凋亡能力的影響以及對(duì)裸鼠移植瘤的作用,探討兩藥聯(lián)合在抗腫瘤作用方面是否具有良好的協(xié)同效果,為未來幾丁寡糖在抗腫瘤治療領(lǐng)域中的開發(fā)應(yīng)用及臨床轉(zhuǎn)化,提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。材料與方法:本研究采用三組藥物(幾丁寡糖組、順鉑組、幾丁寡糖聯(lián)合順鉑組)作用于人肺腺癌A549細(xì)胞系,通過MTS實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn),對(duì)比觀察各藥物組對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖、遷移及凋亡等生物學(xué)行為的影響;同時(shí)應(yīng)用肺腺癌A549細(xì)胞對(duì)裸鼠進(jìn)行皮下移植瘤造模,待造模成功后,按照給藥的不同將裸鼠隨機(jī)分為四組,分別為空白對(duì)照組、幾丁寡糖組、順鉑組和幾丁寡糖聯(lián)合順鉑組,先利用HE染色的方法鏡下觀察各組腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化,再應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法,觀察各組腫瘤組織中Ki67、P53及TTF-1的表達(dá)水平,通過對(duì)比各組藥物對(duì)Ki67、P53及TTF-1表達(dá)水平的影響,分析其對(duì)裸鼠移植瘤的作用并探討腫瘤的預(yù)后。結(jié)果:1.中藥降解產(chǎn)物幾丁寡糖具有抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖和遷移的作用,其效果隨著濃度的增加而增大。幾丁寡糖對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞作用24h的IC50為6.840mg/mL,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以7mg/mL為濃度參數(shù)。2.幾丁寡糖作用于A549細(xì)胞24h、48h、72h及96h后的增殖抑制率分別為49.80%、55.90%、71.30%和73.50%,順鉑對(duì)肺腺癌細(xì)胞的增殖抑制率分別為25%、47.4%、61.7%和71.2%,而兩藥聯(lián)合對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制率分別為52.4%、73.7%、86.8%和87.4%。藥物作用24h后,幾丁寡糖聯(lián)合順鉑組對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率與幾丁寡糖組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但與順鉑組相比抑制率明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);藥物作用48h、72h和96h后幾丁寡糖聯(lián)合順鉑組對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率與幾丁寡糖組和順鉑組相比均明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。幾丁寡糖聯(lián)合順鉑能夠明顯抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖能力,其作用大于單獨(dú)應(yīng)用幾丁寡糖或順鉑。3.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)幾丁寡糖藥物濃度為1mg/mL時(shí),24h、48h相對(duì)劃痕寬度分別為82.33%、42.68%,當(dāng)幾丁寡糖藥物濃度為3mg/mL時(shí),24h、48h相對(duì)劃痕寬度分別為83.46%、60.52%,而空白對(duì)照組分別為:84.78%、21.79%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。幾丁寡糖可以抑制肺腺癌A549細(xì)胞的遷移能力,且抑制作用隨幾丁寡糖藥物濃度的增加而增大。當(dāng)幾丁寡糖藥物濃度為7mg/mL時(shí),24h、48h相對(duì)劃痕寬度分別為81.79%、62.21%,當(dāng)順鉑藥物濃度為3μg/mL時(shí),24h、48h相對(duì)劃痕寬度分別為83.23%、55.91%,幾丁寡糖和順鉑聯(lián)合應(yīng)用時(shí),24h、48h相對(duì)劃痕寬度分別為83.91%、69.67%,而空白對(duì)照組則分別為:84.11%、23.09%,各組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。幾丁寡糖聯(lián)合順鉑組與幾丁寡糖組及順鉑組相比,可以更加顯著的降低肺腺癌A549細(xì)胞的遷移能力。4.Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)計(jì)算A549細(xì)胞的遷移數(shù)量,空白對(duì)照組578±26、幾丁寡糖組462±21、順鉑組423±28、幾丁寡糖聯(lián)合順鉑組236±23,幾丁寡糖聯(lián)合順鉑組與順鉑組、幾丁寡糖組和空白對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。幾丁寡糖聯(lián)合順鉑可以明顯抑制肺腺癌A549細(xì)胞的遷移能力,其作用大于單獨(dú)應(yīng)用幾丁寡糖或順鉑。5.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示幾丁寡糖組作用于肺腺癌A549細(xì)胞株24h后,早期凋亡率和晚期凋亡率分別為11.8%和5.3%(總凋亡率17.1%),順鉑組早期凋亡率和晚期凋亡率分別為5.3%和4.5%(總凋亡率9.8%),幾丁寡糖聯(lián)合順鉑組早期凋亡率和晚期凋亡率分別為6.7%和8.0%(總凋亡率14.7%),而空白對(duì)照組則分別為3.4%和2.8%(總凋亡率6.2%)。兩藥聯(lián)合組與幾丁寡糖組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但分別與順鉑組和空白對(duì)照組相比,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中藥降解產(chǎn)物幾丁寡糖及與順鉑聯(lián)合應(yīng)用均能夠誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡。6.對(duì)裸鼠移植瘤組織進(jìn)行HE染色鏡下觀察發(fā)現(xiàn),空白對(duì)照組、幾丁寡糖組及順鉑組腫瘤組織的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)基本相同,即癌細(xì)胞呈彌漫性分布,且異型性明顯,可見病理性核分裂像,腫瘤組織內(nèi)部可見點(diǎn)狀壞死;而幾丁寡糖聯(lián)合順鉑組鏡下觀察腫瘤組織,除了有上述表現(xiàn)以外,還可見局灶性壞死,并有細(xì)胞核破碎、固縮及染色質(zhì)邊集。7.對(duì)裸鼠移植瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,空白對(duì)照組、幾丁寡糖組、順鉑組、幾丁寡糖聯(lián)合順鉑組各組之間Ki67免疫積分中位數(shù)分別為9、5、5、1,即Ki67的表達(dá)水平分別為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)、陽(yáng)性(++)、陽(yáng)性(++)和弱陽(yáng)性(+),各用藥組與空白對(duì)照組相比,表達(dá)量均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);其中,幾丁寡糖聯(lián)合順鉑組與其他兩單藥組及空白對(duì)照組相比,表達(dá)量降低更為顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。P53免疫積分中位數(shù)分別為2、1、1、1,即P53的表達(dá)水平均為弱陽(yáng)性(+),各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TTF-1免疫積分中位數(shù)分別為3、1、1、0,即TTF-1的表達(dá)水平分別為弱陽(yáng)性(+)、弱陽(yáng)性(+)、弱陽(yáng)性(+)和陰性(-),聯(lián)合用藥組與空白對(duì)照組及兩單藥組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),兩單藥組與空白對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。中藥降解產(chǎn)物幾丁寡糖聯(lián)合順鉑能夠明顯下調(diào)裸鼠肺腺癌A549細(xì)胞移植瘤中Ki67、TTF-1的表達(dá)水平,其作用大于單獨(dú)應(yīng)用幾丁寡糖或順鉑。結(jié)論:1.本研究從體外細(xì)胞學(xué)水平及體內(nèi)動(dòng)物模型上證明中藥降解產(chǎn)物幾丁寡糖聯(lián)