【靈芝孢子粉中黃曲霉毒素的檢測(cè)3500字（論文）】

靈芝孢子粉中黃曲霉毒素的檢測(cè)目錄TOC\o"1-3"\h\u摘要 11.前言 12.任務(wù)來源 23.基本概念與原理 24.方案設(shè)計(jì) 34.3.1樣品的前處理 44.3.2校準(zhǔn)曲線的繪制 45.色譜分析檢測(cè)結(jié)果 45.1樣品色譜圖 45.2樣品加標(biāo)色譜圖 45.3線性回歸方程及檢出限 56.方案設(shè)計(jì)成果 57.方案設(shè)計(jì)總結(jié) 6參考文獻(xiàn) 7摘要建立免疫親和柱凈化-高效液相色譜法測(cè)定靈芝孢子粉中的黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2。該方法樣品用甲醇-水提取，稀釋后經(jīng)免疫親和柱凈化，用高效液相色譜法檢測(cè)，外標(biāo)法定量【1】。以C18柱為分離色譜柱，甲醇-水(45-55，體積/體積)溶液為流動(dòng)相洗脫，流速0.8mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長440nm。4種毒素在標(biāo)準(zhǔn)溶液為0.28、0.56、1.12和2.24、4.48ng/ml的條件下呈良好的線性關(guān)系，G2、G1、B2和B1相關(guān)系數(shù)分別為0.9992、0.9996、0.9996和0.9998。檢測(cè)靈敏度分別為0.3、0.3、0.2和0.2ug/kg。該方法靈敏度高，適用于靈芝孢子粉中的黃曲霉毒素總量的測(cè)定。關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素；免疫親和柱；高效液相色譜；靈芝孢子粉1前言吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局由原吉林進(jìn)出口商品檢驗(yàn)局、長春動(dòng)植物檢疫局和長春衛(wèi)生檢疫局合并組建，于1999年11月正式掛牌成立。是主管吉林省出入境衛(wèi)生檢疫和進(jìn)出境動(dòng)植物檢疫，以及進(jìn)出口商品檢驗(yàn)、鑒定、認(rèn)證和監(jiān)督管理的行政執(zhí)法機(jī)構(gòu)，直屬國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫局總領(lǐng)導(dǎo)。吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局專業(yè)技術(shù)力量雄厚。擁有氣相色譜儀、液相色譜儀、原子吸收光譜儀、質(zhì)譜儀、紫外光分光光度計(jì)、快速免疫檢測(cè)分析儀、電子拉力實(shí)驗(yàn)機(jī)等國內(nèi)、國際先進(jìn)的精密儀器設(shè)備。有2個(gè)國家級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，即“玉米及其深加工產(chǎn)品檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”和“參茸與參茸制品檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”。并建立了化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)室、生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室、物理性能實(shí)驗(yàn)室、機(jī)電檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室、艾滋病初篩實(shí)驗(yàn)室等。吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局重視科技的發(fā)展，人才技術(shù)過硬，實(shí)驗(yàn)室設(shè)備完善，使吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局在'農(nóng)殘'等檢測(cè)方面做出了突出貢獻(xiàn)，在國內(nèi)取得了較高的聲譽(yù)。黃曲霉毒素（AFT）是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物，二氫呋喃香豆素的衍生物，主要由黃曲霉寄生曲霉產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。已分離鑒定出12種包括B1，B2，G1，G2，M1，M2，P1，Q，HI，GM，B2a和毒醇，基本結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素。目前，分離鑒定黃曲霉毒素12種中B1、B2、G1和G2為主要產(chǎn)物。其中，黃曲霉毒素B1是毒性及致癌性最強(qiáng)的物質(zhì)。黃曲霉毒素進(jìn)入體內(nèi)后，主要在肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微粒體混合功能氧化酶系的作用下進(jìn)行代謝。黃曲霉毒素是目前已知最強(qiáng)致癌物之一，被世界衛(wèi)生組織劃定為一類致癌物。其致癌特點(diǎn)：致癌范圍廣，致癌強(qiáng)度大，可誘發(fā)多種癌，還可誘發(fā)畸胎。所以檢測(cè)食品、糧食、保健品中的黃曲霉毒素尤為重要。但直至目前仍無針對(duì)靈芝孢子粉中黃曲霉毒素的測(cè)定方法，因此需要建立地方標(biāo)準(zhǔn)對(duì)靈芝孢子粉中的黃曲霉毒素進(jìn)行檢測(cè)。 2任務(wù)來源吉林省是中國靈芝及靈芝孢子粉的主要產(chǎn)地之一，有不少靈芝種植基地，吉林省長白山地區(qū)更是作為靈芝的道地產(chǎn)地而馳名中外。但靈芝孢子粉在生產(chǎn)、運(yùn)輸、存放等過程中，如果環(huán)境條件不適合，將會(huì)產(chǎn)生黃曲霉毒素等生物毒素，影響人體健康。2014年曾接檢客戶委托檢測(cè)靈芝孢子粉中的黃曲霉毒素B1及總量的檢測(cè)，但直至目前仍無針對(duì)靈芝孢子粉中黃曲霉毒素的測(cè)定方法，因此只能用單位自行研制的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)?，F(xiàn)在需要建立靈芝孢子粉中黃曲霉毒素的檢測(cè)方法，將對(duì)吉林省靈芝孢子粉的出口及銷售起到積極的作用。因在此公司實(shí)習(xí)期間，參與了建立檢測(cè)靈芝孢子粉中黃曲霉毒素的檢測(cè)方法的工作，所以把本檢測(cè)內(nèi)容作為畢業(yè)設(shè)計(jì)的課題。設(shè)計(jì)思路：根據(jù)檢測(cè)花生、大米中黃曲霉毒素的方法用甲醇-水提取，提取液經(jīng)分取和稀釋后，經(jīng)免疫親和柱凈化，樣液供高效液相色譜儀（熒光檢測(cè)器）測(cè)定，外標(biāo)法定量。3基本概念與原理3.1基本概念靈芝孢子粉是靈芝成熟時(shí)釋放出的孢子（種子），是靈芝的精華部分，有效成分非常豐富，具有改善胰臟血液循環(huán)，降血糖，降血脂，改善睡眠質(zhì)量，輔助腫瘤治療等功效。但靈芝孢子粉在生產(chǎn)、運(yùn)輸、存放等過程中，如果環(huán)境條件不適合，將會(huì)產(chǎn)生黃曲霉毒素等生物毒素。靈芝孢子粉含油量較高，破壁后極易感染黃曲霉毒素，影響人體健康。免疫親和柱凈化是利用生物分子間所具有的專一親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)。由于免疫親和柱的專一性吸附特征，因此具有定量準(zhǔn)確、靈敏和可靠等諸多優(yōu)點(diǎn)。采用黃曲霉毒素免疫親柱凈化-高效液相色譜柱后光化學(xué)衍生-熒光檢測(cè)器測(cè)定靈芝孢子粉中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2的含量。該方法具有樣品前處理簡單、凈化效果好,準(zhǔn)確度高和重現(xiàn)性好等優(yōu)勢(shì)[3]。高效液相色譜的原理：由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同、隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時(shí)間不同，從而按一定順序從固定相中流出。與合適的柱后檢測(cè)方法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測(cè)。3.2基本原理試樣經(jīng)甲醇-水提取，提取液經(jīng)過濾、稀釋后，過免疫親和柱凈化，用帶熒光檢測(cè)器的高效液相色譜儀（經(jīng)光化學(xué)柱后衍生器）測(cè)定黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2的含量，外標(biāo)法定量。4方案設(shè)計(jì)4.1儀器、試劑與樣品高效液相色譜儀型號(hào)為waterse2695，配Waters2475熒光檢測(cè)器,Waters柱后衍生裝置，電子天平，移液槍；黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；免疫親和層析柱，纖維濾紙，具塞離心管，高速冷凍離心機(jī)，玻璃試管。甲醇為色譜純，水為去離子水，氯化鈉，70%甲醇-水（7:3，體積/體積），80%甲醇-水（8:2，體積/體積）。光化學(xué)柱后衍生器，樣品為靈芝孢子粉。4.2高效液相色譜條件流動(dòng)相：甲醇-水（45+55）梯度流速:0.8ml/min壓力：不超過4000色譜柱：C18柱進(jìn)樣量：10.0ul柱溫：25℃檢測(cè)器：PDA熒光檢測(cè)器波長：360-440nm4.3設(shè)計(jì)步驟4.3.1樣品的前處理（1）提取準(zhǔn)確稱取靈芝孢子粉1g，加入氯化鈉1g，置于具塞離心管中，加入25mL甲醇水（70%甲醇水）后渦旋1min，超聲20min，10000r/min離心1min，從上清液中取出10mL放入具塞離心管中，加入20mL水，渦旋混勻后，經(jīng)纖維濾紙過濾，待凈化。（2）凈化免疫親和柱經(jīng)活化后，準(zhǔn)確吸取上述濾液15mL加入免疫親和柱中，連接流速控制系統(tǒng)，控制流速不得超過1滴/s，上樣結(jié)束后，用10mL水淋洗，抽干免疫親和柱。用1mL甲醇洗脫至玻璃試管中，再在玻璃試管中加入1mL水，渦旋混勻后，經(jīng)0.22um微孔膜過濾，供檢測(cè)用。（3）檢測(cè)4.3.2校準(zhǔn)曲線的繪制取5個(gè)2mL的進(jìn)樣小瓶，加入通過計(jì)算后每個(gè)濃度所需的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用甲醇溶液定容，配制5個(gè)濃度點(diǎn)分別為0.28、0.56、1.12和2.24、4.48ng/mL。黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為112ng/mL。 5色譜分析檢測(cè)結(jié)果5.1樣品色譜圖5.2樣品加標(biāo)色譜圖5.3線性回歸方程及檢出限黃曲霉毒素線性回歸方程相關(guān)系數(shù)R檢出限（ug/kg）G2Y=2.40e+005x-8.86e+0020.99920.3G1Y=1.24e+005x+3.58e+0020.99960.3B2Y=4.94e+005x-9.85e+0020.99960.2B1Y=2.42e+005x-1.46e+0030.99980.26方案設(shè)計(jì)成果表6-1不同甲醇-水濃度的回收率黃曲霉毒素30%甲醇-水回收率50%甲醇-水回收率G20.11131.7%0.20157.4%G10.30128.9%0.59056.7%B20.06622.7%0.14449.6%B10.17815.8%0.50344.9%

表6-2不同甲醇-水濃度的回收率黃曲霉毒素80%甲醇-水回收率70%甲醇-水回收率G20.11934%0.18653%G10.90987.4%0.72370%B20.22176.2%0.21775%B10.89179.5%0.76668.4%根據(jù)上述檢測(cè)數(shù)據(jù)證明有機(jī)相高回收率好,樣品處理是用不同濃度的甲醇-水溶液提取,經(jīng)免疫親和柱凈化,80%和70%甲醇水溶液的提取效率顯著高于20%甲醇水、30%甲醇水、50%甲醇水、但70%甲醇水溶液的提取效率較好,但用70%甲醇水提取的回收率較好，最中確定70%甲醇-水溶液提取[2]。黃曲霉毒素易溶于如甲醇等中等極性的溶劑,甲醇洗脫回收率較大，因此樣品處理確定采用甲醇進(jìn)行洗脫。同時(shí)對(duì)甲醇提取液的用量進(jìn)行了考察,分別采用甲醇1.0、1.5、2ml對(duì)免疫親和柱進(jìn)行洗脫并收集各洗脫液進(jìn)樣分析[5]?；厥章视?jì)算顯示,1.0ml甲醇即可實(shí)現(xiàn)從免疫親和柱上將黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1完全洗脫的目標(biāo)。因此,最終甲醇洗脫體積確定為1.0ml[6]。7方案設(shè)計(jì)總結(jié)檢測(cè)結(jié)果證實(shí),甲醇-水體系能對(duì)靈芝孢子粉樣品中的黃曲霉毒素進(jìn)行有效提取,經(jīng)免疫親和柱凈化和柱后衍生熒光檢測(cè)器檢測(cè)，能有效分析靈芝孢子粉樣品中4種黃曲霉毒素含量。采用該方法處理樣品，不受樣品中其他組分干擾,檢測(cè)方法簡便快速、靈敏度高、選擇性和穩(wěn)定性好、回收率較高、重現(xiàn)性好,適合靈芝孢子粉中黃曲霉毒素的定量分析。參考文獻(xiàn)[1]熊平文，梁權(quán)，王雄，尚沁沁，余東游，果旗.免疫親和柱凈化-高效液相色譜法測(cè)定飼料中的黃曲霉毒素[J]，2015[2]李瑩，李建華，何強(qiáng)，付宇，孔祥虹，鄒陽，張璐.高效液相色譜-柱后衍生法測(cè)定植物油脂中4種黃曲霉毒素[J]，2015，（11）[3]朱鵬飛，劉文衛(wèi)，凌霞，姚譽(yù)陽，孔令燦.光化學(xué)衍