2023-2024學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修三3-1+重組DNA技術(shù)的基本工具教學(xué)設(shè)計(jì)

3.1重組DNA技術(shù)的基本工具一、教材分析（一）教學(xué)目標(biāo)1.闡明重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具的作用。2.認(rèn)同基因工程的誕生和發(fā)展離不開(kāi)理論研究和技術(shù)創(chuàng)新。3.進(jìn)行DNA的粗提取與鑒定。（二）教學(xué)重點(diǎn)和難點(diǎn)1.教學(xué)重點(diǎn)（1）重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具的作用。（2）DNA的粗提取與鑒定。2.教學(xué)難點(diǎn)（1）基因工程載體需要具備的條件。（2）DNA的粗提取與鑒定。（三）編寫思路本節(jié)內(nèi)容是學(xué)習(xí)本章其他內(nèi)容的基礎(chǔ)。由于重組DNA技術(shù)所需的“分子工具”對(duì)學(xué)生而言是抽象的，因此教材在“從社會(huì)中來(lái)”欄目中創(chuàng)設(shè)了具體的培育轉(zhuǎn)基因番木瓜的情境，讓學(xué)生認(rèn)識(shí)到培育轉(zhuǎn)基因番木瓜需要用到專門的“分子工具”，進(jìn)而引導(dǎo)他們思考用到了哪些“分子工具”，以及這些“分子工具”各具有什么特征。本節(jié)內(nèi)容的編排主要遵循“簡(jiǎn)約、形象、誘思”的原則。“簡(jiǎn)約”體現(xiàn)在重組DNA技術(shù)所需的“分子工具”種類多樣，根據(jù)課程標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容要求，同時(shí)考慮到高中生物學(xué)課程的基礎(chǔ)性，教材只把三種基本的工具介紹給學(xué)生，并未拓展。“形象”一方面體現(xiàn)在教材給一些抽象的文字描述配了形象、直觀的插圖，如“限制酶切割DNA分子產(chǎn)生兩種不同末端的示意圖”可以使學(xué)生準(zhǔn)確地理解切割的部位和“黏性”的內(nèi)涵；“大腸桿菌及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖”可以使基因工程載體需要具備的條件的相關(guān)內(nèi)容變得容易理解。另一方面，教材采用了打比方的方法，使三種基本工具的作用“形象化”，這樣也是為了便于學(xué)生理解和掌握?！罢T思”體現(xiàn)在教材針對(duì)學(xué)習(xí)的內(nèi)容，提出一些相應(yīng)的問(wèn)題，啟發(fā)學(xué)生思考。例如，在介紹限制酶時(shí)，提出“推測(cè)限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么”的問(wèn)題，是為學(xué)生深入理解限制酶在生物體中的作用打開(kāi)思路；學(xué)，生在學(xué)習(xí)DNA連接酶時(shí)，很自然地會(huì)想到學(xué)過(guò)的催化脫氧核糖核昔酸聚合的DNA聚合酶，提出"DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎”的問(wèn)題，可以引導(dǎo)學(xué)生分析兩者的不同作用，從而達(dá)到讓他們深入認(rèn)識(shí)DNA連接酶的目的。本節(jié)安排的“思考，討論重組DNA分子”，意在讓學(xué)生通過(guò)模擬制作和討論相關(guān)問(wèn)題，初步感受構(gòu)建重組DNA分子的過(guò)程，并進(jìn)一步熟悉、理解限制酶和DNA連接酶的作用?！暗缴鐣?huì)中去”安排了讓學(xué)生了解生產(chǎn)和銷售“分子工具”的公司生產(chǎn)產(chǎn)品的情況，分析相關(guān)上市公司的股票價(jià)格走勢(shì)的活動(dòng)，這些活動(dòng)超越了生物技術(shù)本身的范疇，突出了生物技術(shù)在社會(huì)經(jīng)濟(jì)活動(dòng)及日常生活中的重要作用。對(duì)學(xué)生而言，活動(dòng)既新穎又具有積極的意義，他們?cè)谕瓿苫顒?dòng)的過(guò)程中，能體會(huì)到科學(xué)、技術(shù)、社會(huì)三者間的關(guān)系。由于重組DNA技術(shù)是在DNA分子水平上進(jìn)行的操作，提取和鑒定DNA是該技術(shù)涉及的最基礎(chǔ)的操作，因此本節(jié)最后安排了“探究，實(shí)踐DNA的粗提取與鑒定”活動(dòng)，讓學(xué)生學(xué)習(xí)相關(guān)操作。通過(guò)這個(gè)活動(dòng)還可以幫助學(xué)生鞏固在必修課中已經(jīng)學(xué)過(guò)的DNA的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的知識(shí)，使他們對(duì)DNA這一微觀分子形成一定的感性認(rèn)識(shí)。二、教學(xué)建議本節(jié)教學(xué)建議安排2課時(shí)，其中1課時(shí)用于開(kāi)展“探究，實(shí)踐”活動(dòng)。在教學(xué)中可以按照教材的安排先講解重組DNA技術(shù)的基本工具的內(nèi)容，再開(kāi)展探究實(shí)踐活動(dòng)，也可以先開(kāi)展探究實(shí)踐活動(dòng)后講解。具體的教學(xué)建議如下。（一）結(jié)合基因工程應(yīng)用的實(shí)例引人本節(jié)課的學(xué)習(xí)本節(jié)課是學(xué)習(xí)基因工程的開(kāi)端，課前可以帶領(lǐng)學(xué)生參觀當(dāng)?shù)嘏e辦的與基因工程有關(guān)的展覽、轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)基地、轉(zhuǎn)基因作物種植基地等，或指導(dǎo)學(xué)生借助互聯(lián)網(wǎng)、科普雜志等，初步了解一些基因工程應(yīng)用的實(shí)例；也可以利用教材中的素材，如章引言中培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的實(shí)例，本節(jié)開(kāi)篇“從社會(huì)中來(lái)”欄目中培育轉(zhuǎn)基因番木瓜的實(shí)例，提出本節(jié)課要解決的問(wèn)題，即在基因工程的操作中需要用到哪些“分子工具”，從而引人本節(jié)課的學(xué)習(xí)。（二）引導(dǎo)學(xué)生在分析舊知識(shí)的基礎(chǔ)上理解和掌握新知識(shí)本節(jié)的內(nèi)容是建立在必修1教材中酶的作用和特性，必修2教材中噬菌體侵染細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)、DNA的結(jié)構(gòu)和復(fù)制等相關(guān)內(nèi)容的基礎(chǔ)上的。引導(dǎo)學(xué)生建立新舊知識(shí)之間的聯(lián)系，將有助于他們理解和掌握新知識(shí)。例如，在講授限制酶有關(guān)的內(nèi)容時(shí)，可以設(shè)置問(wèn)題“限制酶從哪里尋找”，引導(dǎo)學(xué)生聯(lián)系噬菌體侵染細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)，認(rèn)識(shí)到細(xì)菌等原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但它們卻不受影響，這是因?yàn)樗鼈冊(cè)陂L(zhǎng)期進(jìn)化的過(guò)程中形成了一套防御機(jī)制，限制酶就是它們的一種防御性工具，從而讓學(xué)生了解限制酶的來(lái)源和理解它們存在的意義；在介紹限制酶的作用部位時(shí)，還要聯(lián)系DNA的結(jié)構(gòu)來(lái)幫助學(xué)生理解限制酶作用的特點(diǎn)。此外，在介紹DNA連接酶有關(guān)的內(nèi)容時(shí)，可以聯(lián)系學(xué)生已經(jīng)學(xué)過(guò)的DNA聚合酶的相關(guān)知識(shí)，通過(guò)對(duì)兩種酶進(jìn)行比較，來(lái)加深他們對(duì)DNA連接酶的認(rèn)識(shí)。（三）組織好教材中的“思考，討論”活動(dòng)，幫助學(xué)生理解“分子工具”的本質(zhì)特征基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，屬于微觀層面，學(xué)生在日常生活中很少接觸到，對(duì)此比較陌生，難于理解。因此，在教學(xué)中要充分利用教材中的生動(dòng)形象的比喻、直觀的插圖、模擬制作活動(dòng)等幫助學(xué)生增加感性認(rèn)識(shí)。教材“思考，討論”中的模擬制作活動(dòng)對(duì)學(xué)生理解“分子工具”的本質(zhì)特征具有十分重要的作用。教材中主要模擬的是限制酶和DNA連接酶的作用，教學(xué)時(shí)可以讓活動(dòng)內(nèi)容更加豐富，如可以增加不同的DNA片段，模擬不同限制酶的切割，甚至可以增加對(duì)載體的模擬，在載體中畫出相應(yīng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)以及需要切割的DNA片段等。活動(dòng)的安排可以按照教材中的順序，在學(xué)生學(xué)習(xí)完本節(jié)內(nèi)容后開(kāi)展，以反饋檢測(cè)學(xué)生對(duì)前面內(nèi)容的掌握情況；也可以邊講授相關(guān)的內(nèi)容，邊帶領(lǐng)學(xué)生進(jìn)行活動(dòng)，通過(guò)任務(wù)驅(qū)動(dòng)，讓學(xué)生在活動(dòng)的過(guò)程中理解工具的作用。開(kāi)展活動(dòng)的同時(shí)，要注意利用好教材中的討論題引導(dǎo)學(xué)生展開(kāi)討論，否則模擬活動(dòng)可能會(huì)變成簡(jiǎn)單的模仿。（四）借助科學(xué)史，讓學(xué)生認(rèn)同基因工程的誕生離不開(kāi)技術(shù)創(chuàng)新基因工程的原理看似很簡(jiǎn)單，即將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，使這個(gè)基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而賦予生物新的遺傳特性。但其實(shí)從理論研究到工程實(shí)踐的過(guò)程并不簡(jiǎn)單，這條發(fā)展之路離不開(kāi)一項(xiàng)項(xiàng)創(chuàng)新技術(shù)的推動(dòng)，教學(xué)中應(yīng)該讓學(xué)生明白這一點(diǎn)。可以通過(guò)引導(dǎo)學(xué)生自主閱讀本章的“科技探索之路”，補(bǔ)充與三種“分子工具”發(fā)現(xiàn)歷程相關(guān)的科學(xué)史資料，或讓學(xué)生在課下查找相關(guān)資料，幫助他們認(rèn)識(shí)到基因工程得以實(shí)現(xiàn)離不開(kāi)三種“分子工具”的發(fā)現(xiàn)和成功運(yùn)用，進(jìn)而深刻體會(huì)到技術(shù)創(chuàng)新的重要意義。三、“探究·實(shí)踐”指導(dǎo)DNA的粗提取與鑒定提取與鑒定DNA是基因工程中獲取目的基因的基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)讓學(xué)生體驗(yàn)DNA的粗提取與鑒定的過(guò)程，幫助學(xué)生了解DNA的理化性質(zhì)，讓他們明白如何利用物質(zhì)的理化性質(zhì)，用物理和化學(xué)的方法進(jìn)行分離和提純。（一）材料準(zhǔn)備植物材料：新鮮的洋蔥、菠菜、菜花、香蕉、草莓等，若準(zhǔn)備的植物材料不馬上使用，可以將其放入冰箱冷藏或冷凍保存。動(dòng)物材料：新鮮的豬肝、魚白（魚的精巢）等，若準(zhǔn)備的動(dòng)物材料不馬上使用，也可以將其冷藏或冷凍保存。（二）實(shí)施建議1.DNA的粗提?。?）如果以菜花為實(shí)驗(yàn)材料，由于它的硬度較高，容易出現(xiàn)研磨不充分的情況，需要延長(zhǎng)研磨的時(shí)間，而如果研磨時(shí)間太長(zhǎng)，研磨時(shí)產(chǎn)生的熱量可能會(huì)影響DNA的提取量，因此有條件的學(xué)?？梢栽诓牧咸幚淼倪^(guò)程中加入纖維素酶，這樣研磨的效果較好。如果以洋蔥為實(shí)驗(yàn)材料，它的氣味相對(duì)刺激，可以為學(xué)生準(zhǔn)備護(hù)目鏡，并注意通風(fēng)。不同的實(shí)驗(yàn)材料，其DNA的含量有所差別，香蕉、草莓、魚白等材料中的DNA含量較高。該實(shí)驗(yàn)也可以選取各種植物的葉為實(shí)驗(yàn)材料。葉中往往含有大量的蛋白多糖、丹寧和色素等雜質(zhì)。在粗提取過(guò)程中大多數(shù)蛋白質(zhì)可以通過(guò)氯仿處理變性、沉淀后被除去（參見(jiàn)本部分第5條建議的內(nèi)容）；大多數(shù)糖類雜質(zhì)較難除去，它們?cè)跐舛容^高時(shí)常常會(huì)使提取物呈膠狀，從而影響鑒定的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)前可將材料置于低溫、暗處保存，以降低多糖的含量。[2]（2）本實(shí)驗(yàn)處理植物材料的研磨液中含有SDS（十二烷基硫酸鈉），EDTA（乙二胺四乙酸）、Tris（三甲基氨基甲燒）等試劑。SDS可使蛋白質(zhì)變性與DNA分離；EDTA是一種DNA酶的抑制劑，可防止細(xì)胞破碎后DNA酶降解DNA；Tris提供緩沖體系，DNA在這個(gè)緩沖體系中呈穩(wěn)定狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)中若遇到實(shí)驗(yàn)試劑缺乏的情況，可以用家用洗潔精（含有SDS）或質(zhì)量百分比為10%的洗衣粉水溶液（含有蛋白酶和表面活性劑，可用溫水溶解洗衣粉）替代研磨液，也能達(dá)到裂解細(xì)胞膜、讓蛋白質(zhì)變性的目的。還可以在研磨、過(guò)濾后得到的濾液中加入嫩肉粉（含有木瓜蛋白酶），并在適宜溫度的水浴中加熱以加快反應(yīng)速率，促使部分蛋白質(zhì)水解。下面以香蕉為例，介紹學(xué)生在家就可以完成的DNA粗提取的操作。香蕉中DNA的粗提取實(shí)驗(yàn)①取一段長(zhǎng)約2cm的去皮香蕉，剪碎置于玻璃杯中。②加入10mL溫水，2g食鹽，5滴洗潔精，充分研磨。③用雙層紗布過(guò)濾研磨液，收集濾液。④向?yàn)V液中加人2g嫩肉粉，混合均勻。⑤將濾液置于55~60℃（木瓜蛋白酶作用的最適溫度）的水浴中加熱5~10min。⑥冷卻，加入等體積、預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精。⑦靜置2~3min，用玻璃棒（或筷子）挑取白色絮狀析出物。（3）教師還可以布置學(xué)生在課前查閱有關(guān)DNA在不同濃度NaCI溶液中溶解度發(fā)生變化的資料，以此為依據(jù)設(shè)計(jì)其他粗提取DNA的方案，從而加深學(xué)生對(duì)DNA理化性質(zhì)的認(rèn)識(shí)，提高他們的科學(xué)探究能力。（4）若提取的DNA中含有較多的雜質(zhì)，鑒定效果不明顯，教師可以引導(dǎo)學(xué)生思考提取的DNA中可能有哪些雜質(zhì)，能用什么方法鑒定這些雜質(zhì)等。例如，雙縮脈試劑可用于鑒定蛋白質(zhì)。（5）若想提高提取的DNA的純度，可以在研磨、過(guò)濾后得到的濾液中加入等體積的氯仿，離心后取上清液，再加人等體積、預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精以析出DNA。這樣操作的原因是氣仿能使蛋白質(zhì)失去水合狀態(tài)而變性，從而析出；離心后，溶液會(huì)分層，上層為水相，下層為有機(jī)相（氯仿）；DNA溶解在上層，析出的蛋白質(zhì)的密度比水的大，比氛仿的小，它分布在水相與有機(jī)相中間，這樣就實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)與DNA的分離。2.DNA的鑒定（1）DNA中嘌呤核昔酸上的脫氧核糖遇酸生成w-羥基-y-酮基戊醛，后者再和二苯胺試劑作用呈現(xiàn)藍(lán)色。鑒定時(shí)溶液藍(lán)色的深淺，與溶液中DNA含量的多少有關(guān)，可以加入適量乙醛.以提高反應(yīng)的靈敏度。（2）DNA與二苯胺試劑反應(yīng)后的溶液對(duì)波長(zhǎng)為595nm的光有最大吸收峰，并且DNA的含量在一定范圍時(shí)，吸光度的值與DNA的含量成正比，利用這個(gè)原理可以測(cè)定DNA的含量。（三）注意事項(xiàng)1.在將待鑒定的提取物加人2mol/L的NaCI溶液中溶解時(shí)，需要不斷攪拌以增加溶解的DNA的量，建議攪拌3min以上。2.二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，以保證實(shí)驗(yàn)效果。同時(shí)，加入二苯胺試劑后沸水浴處理的時(shí)間要在5min以上，且要等到冷卻后再觀察結(jié)果，這樣才可以觀察到較為明顯的顯色反應(yīng)。四、答案和提示（一）從社會(huì)中來(lái)提示

科學(xué)家用到了限制酶、DNA連接酶、載體等“分子工具”。限制酶能識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核昔酸序列，并將DNA雙鏈切斷，形成具有黏性末端或平末端的片段。DNA連接酶催化磷酸二酯鍵的形成，即催化一個(gè)DNA片段3'端的羥基與另一個(gè)DNA片段5'端的磷酸基團(tuán)上的輕基連接起來(lái)形成酯鍵。載體上可以插入外源基因，它能攜帶該基因進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或者整合到受體DNA上，隨著受體DNA同步復(fù)制。載體一般還帶有標(biāo)記基因，以便進(jìn)行重組DNA分子的篩選。（二）旁欄思考題1.提示原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制。限制酶就是它的一種防御性工具。當(dāng)外源DNA入侵時(shí)，它會(huì)利用限制酶來(lái)切割外源DNA，使之失效，以保證自身的安全。2.不是一回事。雖然DNA連接酶和DNA聚合酶都是催化磷酸二酯鍵形成的酶，但兩者存在顯著的區(qū)別。（1）DNA聚合酶只能催化單個(gè)核苷酸加到已有的核酸片段3'末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是催化兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是催化單個(gè)核昔酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。（2）DNA聚合酶以一條DNA鏈為模板，催化形成與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈；而DNA連接酶催化具有互補(bǔ)黏性末端或平末端的DNA片段連接起來(lái)，它不需要模板。此外，兩者雖然都是蛋白質(zhì)，但它們的組成和性質(zhì)各不相同。（三）思考·討論1.剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。2.提示根據(jù)學(xué)生實(shí)際操作的情況進(jìn)行指導(dǎo)。如果制作的黏性末端的堿基不能互補(bǔ)配對(duì)，可能是剪切位點(diǎn)或連接位點(diǎn)選得不對(duì)，也可能是其他原因。3.不能，因?yàn)榛虻拈L(zhǎng)度一般在100個(gè)堿基對(duì)以上。（四）到社會(huì)中去提示

在調(diào)查中需要了解企業(yè)的生產(chǎn)技術(shù)、產(chǎn)品的種類和產(chǎn)量、銷售渠道和銷售情況等，這樣才有可能對(duì)企業(yè)的經(jīng)營(yíng)狀況進(jìn)行正確的判斷。（五）練習(xí)與應(yīng)用概念檢測(cè)1.C。2.A。拓展應(yīng)用1.提示迄今為止，在基因工程操作中使用的限制酶絕大部分都是從細(xì)菌或霉菌中提取出來(lái)的，它們可以識(shí)別DNA上特定的堿基序列并使特定部位的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。微生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，可以將外源入侵的DNA降解。細(xì)菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因?yàn)楹心撤N限制酶的細(xì)胞的DNA分子或者不具備這種限制酶的識(shí)別序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到了限制酶所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開(kāi)。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶，也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA人侵。2.（1）XbaI。因?yàn)閄baI與SpeI切割產(chǎn)生了相同的黏性末端。（2）提示識(shí)別DNA分子中不同核昔酸序列，但能切割產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶被稱為同尾酶。同尾酶使構(gòu)建載體時(shí)，切割位點(diǎn)的選擇范圍擴(kuò)大。例如，我們選擇了用某種限制酶切割載體，如果目的基因的核昔酸序列中恰好含有該限制酶的識(shí)別序列，那么用該限制酶切割含有目的基因的DNA片段時(shí)，目的基因就很可能被切斷；這時(shí)可以考慮用合適的同尾酶（目的基因的核昔酸序列中不能有它的識(shí)別序列）來(lái)獲取目的基因。（六）探究·實(shí)踐結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1.提示觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說(shuō)明DNA中的雜質(zhì)較多。二苯胺試劑鑒定呈現(xiàn)藍(lán)色說(shuō)明實(shí)驗(yàn)基本成功；如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中出現(xiàn)了失誤等。2.本實(shí)驗(yàn)粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。3.提示本實(shí)驗(yàn)可以采取分組的方式進(jìn)行?？梢赃x取不同的實(shí)驗(yàn)材料；也可以查閱資料了解其他提取DNA的方法，對(duì)同種材料采用不同的方法。最后從多方面比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺試劑顯色的深淺等，看看哪種實(shí)驗(yàn)材料、哪種提取方法的效果更好。進(jìn)一步探究提示

實(shí)驗(yàn)室提取純度較高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的SDS溶液，使蛋白質(zhì)變性后與DNA分開(kāi)；隨后，加入氣仿一異丙醇混合液（體積比為24：1），通過(guò)離心將蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)除去，取上清液；可重復(fù)上述操作幾次，直至上清液變成透明的黏稠液體。此外由于苯酚可以迅速使蛋白質(zhì)變性，抑制核酸酶的活性，因此還可以先用苯酚處理，然后離心分層，這時(shí)DNA溶于上層水相，蛋白質(zhì)變性后存在于酚層中，用吸管、微量移液器等實(shí)驗(yàn)用具就可以將兩者分開(kāi)。教師可以根據(jù)學(xué)校的條件讓學(xué)生自己設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果。五、背景資料（一）轉(zhuǎn)基因抗病毒番木瓜的培育過(guò)程番木瓜是一種廣受人們喜愛(ài)的水果，但是它的生產(chǎn)卻一直受到番木瓜環(huán)班病毒（PRSV）的嚴(yán)重威脅。PRSV是一種單鏈RNA病毒，主要經(jīng)蚜蟲傳播，能侵染多種葫蘆科植物。病毒傳播嚴(yán)重時(shí)，會(huì)導(dǎo)致番木瓜減產(chǎn)80%~90%。早在1928年就有人觀察到，接種了煙草花葉病毒弱毒株的煙草，雖然接種葉會(huì)出現(xiàn)壞死斑，但整個(gè)植株獲得了對(duì)同種及相近種病毒的抗性。研究發(fā)現(xiàn)，在其他植物中也大多存在類似的現(xiàn)象，人們把此現(xiàn)象稱為交叉保護(hù)。美國(guó)夏威夷大學(xué)和康奈爾大學(xué)的科研人員于1986年開(kāi)始研究培育抗PRSV的轉(zhuǎn)基因番木瓜。當(dāng)時(shí)科學(xué)家認(rèn)為番木瓜染病是病毒外殼蛋白誘發(fā)的，于是他們根據(jù)交叉保護(hù)現(xiàn)象，通過(guò)基因槍法將PRSV毒株HA5-1的外殼蛋白（coatprotein，CP）基因?qū)肓朔竟系挠鷤M織內(nèi)，并于1990年獲得了世界上首例轉(zhuǎn)PRSV-CP基因的番木瓜。1998年4月，兩個(gè)品種的轉(zhuǎn)基因番木瓜在美國(guó)獲準(zhǔn)商業(yè)化種植。美國(guó)培育出的抗PRSV番木瓜品種，主要是對(duì)夏威夷地區(qū)的HA病毒株系具有抗性，對(duì)我國(guó)華南地區(qū)主要存在的四個(gè)番木瓜環(huán)斑病毒株系Ys、Vb、Sm和Lc不具有抗性。因此，我國(guó)科學(xué)家開(kāi)始選用我國(guó)存在的病毒株系的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因番木瓜研究，以期獲得具有良好適應(yīng)性的轉(zhuǎn)基因品系。隨著RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，科學(xué)家認(rèn)識(shí)到交叉保護(hù)現(xiàn)象主要是通過(guò)RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默引起的，而不是由病毒的外殼蛋白誘導(dǎo)的。我國(guó)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)的科研人員利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將病毒株系Ys的復(fù)制酶基因轉(zhuǎn)入番木瓜，成功培育出轉(zhuǎn)基因番木瓜“華農(nóng)一號(hào)”?！叭A農(nóng)一號(hào)”于2006年獲得了生產(chǎn)應(yīng)用安全證書，目前已在華南地區(qū)廣泛種植。該品種抗性廣，對(duì)華南地區(qū)流行的各種番木瓜環(huán)斑病毒毒株都具有很好的抗性，深受瓜農(nóng)喜愛(ài)，產(chǎn)生了良好的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和環(huán)境效益。（二）限制酶簡(jiǎn)介限制酶是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中特定核昔酸序列的DNA水解酶。最初，限制酶是從微生物中分離純化得到的，而現(xiàn)在基本都采用基因重組的方法進(jìn)行生產(chǎn)。20世紀(jì)60年代，阿爾伯（W.Arber）等人在研究λ噬菌體侵染大腸桿菌的機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于大腸桿菌K菌株的入噬菌體（簡(jiǎn)稱λk）和來(lái)源于大腸桿菌B菌株的λ噬菌體（簡(jiǎn)稱λa），可以高效感染它們各自的大腸桿菌宿主菌株，但是當(dāng)用λk感染B菌株或用λg感染K菌株時(shí)，其感染效率大大下降，這說(shuō)明λk受到了B菌株的限制，入g則受到了K菌株的限制，這一現(xiàn)象稱作限制?？茖W(xué)家還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用入k感染B菌株時(shí)，即便感染效率很低，也仍然有極少數(shù)的λx感染成功，如果用B菌株繁殖出來(lái)的λg再次感染B菌株，這時(shí)λx可以像λB一樣高效感染B菌株，而不會(huì)出現(xiàn)上述限制現(xiàn)象，這種現(xiàn)象稱作修飾。宿主細(xì)胞的限制和修飾作用廣泛存在于細(xì)菌中。通過(guò)進(jìn)一步研究，科學(xué)家弄清了細(xì)菌限制和修飾作用的分子機(jī)制。大腸桿菌K菌株和B菌株擁有不同的限制和修飾系統(tǒng)，它們受hsdR、hsdM和hsds基因的調(diào)控。hsdR編碼產(chǎn)生限制酶，它能識(shí)別雙鏈DNA分子上特定的核昔酸序列并將雙鏈DNA分子切斷；hsdM編碼產(chǎn)生DNA甲基化酶，它催化DNA分子特定位點(diǎn)上的堿基的甲基化反應(yīng)；hsdS編碼的產(chǎn)物能協(xié)助限制酶和DNA甲基化酶識(shí)別作用位點(diǎn)。大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的DNA甲基化酶封閉了其自身DNA上能被自身所產(chǎn)生，的限制酶識(shí)別的位點(diǎn)。λk和λg長(zhǎng)期寄生在宿主細(xì)胞中，宿主細(xì)胞中的DNA甲基化酶也封閉了其DNA上能被宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的限制酶識(shí)別的位點(diǎn)，所以大腸桿菌的限制酶不會(huì)降解自身的DNA以及長(zhǎng)期在它體內(nèi)生存的噬菌體的DNA。外來(lái)的DNA入侵時(shí)，宿主細(xì)胞中的限制酶會(huì)將其降解，但是這種降解作用并不完全，總有少數(shù)人侵的DNA能在宿主細(xì)胞中復(fù)制，并在復(fù)制過(guò)程中被宿主的DNA甲基化酶所修飾，這就是為什么B菌株繁殖出來(lái)的λk可以高效感染B菌株的原因。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的差異，限制酶可以分為三類：1型、II型、III型。Ⅰ型和II型限制酶的應(yīng)用價(jià)值不大，I型限制酶廣泛用于重組DNA技術(shù)。1968年，科學(xué)家首次采用硫酸按沉淀、透析、DEAE-纖維素離子交換層析等技術(shù)，從大腸桿菌K菌株中分離、純化出了Ⅰ型限制酶。1970年，史密斯（H.O.Smith）等人將流感嗜血桿菌Rd菌株與同位素標(biāo)記的沙門氏菌噬菌體P22的DNA一起解育，發(fā)現(xiàn)這些DNA無(wú)法通過(guò)氯化艷密度梯度離心回收，說(shuō)明這些DNA被細(xì)菌中的酶降解了。接著，他們利用細(xì)菌細(xì)胞粗提物消化外源DNA，發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌的DNA溶液黏度沒(méi)有變化，說(shuō)明粗提物中含有某種限制酶。（進(jìn)一步，史密斯等人同樣利用硫酸按沉淀、透析、DEAE-纖維素離子交換層析等技術(shù)從流感嗜血桿菌中分離、純化出了I型限制酶HindII。他們還分析了用這種限制酶切割后的DNA的末端序列，指出這段序列是一段回文序列。自此以后，分子生物學(xué)界掀起了尋找限制酶的熱潮，至今已發(fā)現(xiàn)3800余種限制酶。（三）磷酸二酯鍵在核酸中一個(gè)核昔酸核糖上第3位的羥基與下一個(gè)核昔酸核糖上第5位的磷酸羥基脫水縮合就形成了3'，5'-磷酸二酯鍵，它是核酸中核背酸的連接方式。若干個(gè)核昔酸通過(guò)3'，5'-磷酸二酯鍵連接成的多核昔酸鏈為核酸。在核昔酸鏈的一端的一個(gè)核昔酸，其核糖上第5位連接的磷酸只有一個(gè)酯鍵，此核昔酸被稱為DNA鏈的5"磷酸末端或5'端；另一端的一個(gè)核昔酸上第3位的羥基是自由的，此核昔酸被稱為DNA鏈的3'羥基末端或3'端。鏈內(nèi)的核昔酸第5位上的磷酸和第3位上的羥基均已參與二酯鍵的形成，故它被稱為核苷酸殘基。（四）天然質(zhì)粒的改造在基因工程中，人們需要對(duì)天然質(zhì)粒進(jìn)行改造，以獲得理想、實(shí)用的載體，從而滿足各種實(shí)驗(yàn)要求。1.基因工程中理想的載體一般至少應(yīng)具備以下條件。（1）具有合適的限制酶切割位點(diǎn)，外源基因片段容易插入載體，插入后不影響載體進(jìn)入受體細(xì)胞和在受體細(xì)胞中復(fù)制，并且載體能夠保持穩(wěn)定的復(fù)制狀態(tài)和遺傳特性。（2）容易進(jìn)入受體細(xì)胞，且轉(zhuǎn)化效率越高越好。（3）能在受體細(xì)胞中復(fù)制繁殖，且具有較強(qiáng)的自主復(fù)制能力。（4）容易從宿主細(xì)胞中分離、純化出來(lái)。（5）有用于識(shí)別、篩選的選擇性標(biāo)記，便于重組DNA分子的檢測(cè)。2.對(duì)天然質(zhì)粒的改造主要包括以下幾個(gè)方面。（1）一般載體越小，轉(zhuǎn)化的效率越高；小的載體外源DNA片段的裝載量更大。因此，要?jiǎng)h除天然質(zhì)粒不必要的DNA區(qū)域，盡量減小質(zhì)粒的相對(duì)分子質(zhì)量。（2）在質(zhì)粒上引入含有多種限制酶切割位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)，以便外源基因的重組。一般還要?jiǎng)h除重復(fù)的限制酶切割位點(diǎn)，使環(huán)狀的質(zhì)粒經(jīng)限制酶處理后只在一處斷裂，從而保證外源基因的準(zhǔn)確插入。（3）加入易于識(shí)別的選擇性標(biāo)記，如各種抗生素抗性基因，以便檢測(cè)重組質(zhì)粒是否成功進(jìn)人受體細(xì)胞。（4）為了保證實(shí)驗(yàn)的安全性，杜絕重組質(zhì)粒擴(kuò)散，污染環(huán)境，要滅活某些質(zhì)粒的編碼基因，如促進(jìn)質(zhì)粒在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移的mob基因。為了提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)，還要滅活那些抑制質(zhì)粒復(fù)制的基因。（5）在質(zhì)粒中引入特定用途的輔助序列，以滿足更多的實(shí)驗(yàn)要求。例如，引入Lacz基因用于藍(lán)白斑篩選；引入用于檢測(cè)和分離表達(dá)產(chǎn)物的標(biāo)簽編碼序列，如多聚組氨酸標(biāo)簽、由8個(gè)氨基酸組成的Flag-tag標(biāo)簽等。（五）基因工程中載體的分類基因工程中使用的載體可以按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類。1.按來(lái)源和性質(zhì)分類基因工程中使用的載體按照來(lái)源和性質(zhì)可以分為質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體、人造染色體載體等。質(zhì)粒載體教材中已經(jīng)有介紹，在這里不再展開(kāi)。（1）噬菌體載體噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱，噬菌體能夠在宿主菌內(nèi)實(shí)現(xiàn)復(fù)制，部分噬菌體能引起宿主菌裂解。噬菌體中首先被改造成載體的是入噬菌體。野生型的入噬菌體具有過(guò)多的限制酶切割位點(diǎn)，因此在改造時(shí)要去掉一些限制酶切割位點(diǎn)，同時(shí)切除非必需的區(qū)段。與質(zhì)粒載體相比，噬菌體載體主要有以下特點(diǎn)。第一，噬菌體的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，能夠攜帶更大的DNA片段，噬菌體可以裝載5~20kb的外源DNA，而質(zhì)粒一般只能攜帶10kb以下的DNA片段。第二，噬菌體感染細(xì)菌的效率一般要比質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌的效率高很多，它常被用于構(gòu)建DNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)。第三，噬菌體的克隆操作比質(zhì)粒的復(fù)雜。噬菌體和質(zhì)粒作為載體各有利弊，因此人們構(gòu)建了噬菌體一質(zhì)粒雜合載體，該載體由噬菌體DNA的某個(gè)特征區(qū)域與質(zhì)粒DNA重組而成。（2）病毒載體質(zhì)粒與噬菌體都有嚴(yán)格的宿主選擇性，只能在相應(yīng)的菌體中生存和繁殖，所以它們遠(yuǎn)不能完成載體在基因工程中所承擔(dān)的全部使命。動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有質(zhì)粒，如果要向動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)人外源基因，通常需要用到DNA病毒或RNA病毒。病毒具有高效入侵細(xì)胞的能力，能將自身的基因組轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，掠奪細(xì)胞的“生物合成機(jī)器”生產(chǎn)它自己的DNA、RNA和蛋白質(zhì)，因此它是功能強(qiáng)大的基因轉(zhuǎn)移載體。動(dòng)物病毒載體，如腺病毒載體、桿狀病毒載體等，是比較理想的真核基因工程載體。雖然對(duì)它們的研究和應(yīng)用遠(yuǎn)沒(méi)有質(zhì)粒那樣成熟，但它們具有潛在的應(yīng)用前景。（3）人造染色體載體對(duì)一些大型染色體組的序列分析往往需要克隆具有數(shù)十萬(wàn)甚至上百萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)的DNA片段，為了滿足克隆大片段外源基因的需要，科研工作者構(gòu)建了人造染色體載體，如酵母人工染色體克隆載體、細(xì)菌人工染色體克隆載體等。[5.9]2.按功能和用途分類基因工程中使用的載體按照功能和用途可以分為克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體等?？寺≥d體指可以攜帶外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞，并能夠大量復(fù)制從而實(shí)現(xiàn)外源基因擴(kuò)增的載體。常見(jiàn)的克隆質(zhì)粒載體有pBR332質(zhì)粒和pUC質(zhì)粒。表達(dá)載體就是在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加了基因表達(dá)調(diào)控元件，如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、終止子等，從而使得整合在它上面的外源基因能在受體細(xì)胞中高效表達(dá)。穿梭載體指含有兩個(gè)親緣關(guān)系不同的復(fù)制子，能在兩種不同的生物中復(fù)制的載體。例如，有些載體不僅具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)和選擇性標(biāo)記，還具有真核生物的自主復(fù)制序列和選擇性標(biāo)記，所以它們既能在