豬內(nèi)服藥物生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)的建立

2豬內(nèi)服藥物生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)的建立本文件規(guī)定了豬內(nèi)服藥物生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)的分類標(biāo)準(zhǔn)。本文件適用于對(duì)豬內(nèi)服藥物進(jìn)行生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)的分類，指導(dǎo)獸藥臨床合理用藥活以及性成分的篩查、內(nèi)服劑型的設(shè)計(jì)以及豬內(nèi)服仿制藥的開發(fā)。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)BiopharmaceuticsClassificationSystem,BCS是根據(jù)藥物溶解度和滲透性對(duì)藥物進(jìn)行分類的一種科學(xué)體系，是從生物藥劑學(xué)角度制定口服藥物處方研發(fā)策略的有力工具。[來源：GB/T20000.1]3.2藥物有效滲透性系數(shù)Effectivepermeability,Pef藥物在動(dòng)物腸道單位體積透過的效率。[來源：GB/T20000.1]4原理生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)是根據(jù)藥物溶解度和滲透性對(duì)藥物進(jìn)行分類的一種科學(xué)體系，是從生物藥劑學(xué)角度制定內(nèi)服藥物處方研發(fā)策略的有力工具。根據(jù)藥物的溶解性和滲透性的高低可將藥物分為4類，即第I類：高溶解度、高滲透性；第II類：低溶解度、高滲透性；第III類：高溶解度、低滲透性；第IV類：低溶解度、低滲透性。目前，國(guó)內(nèi)外尚無豬內(nèi)服藥物的BCS分類標(biāo)準(zhǔn)。借鑒FDA指導(dǎo)原則，采用搖瓶法測(cè)定藥物平衡溶解度并結(jié)合豬胃腸道的生理參數(shù)建立溶解性分類標(biāo)準(zhǔn)。高溶解性定義為：在39℃下，pH在2.0~7.5范圍，藥物的單次最大使用劑量能夠完全溶解于采食狀態(tài)的豬胃液體積內(nèi)，該藥物則為高溶解性藥物。反之，則為低溶解性藥物。根據(jù)FDA指導(dǎo)原則，高滲透性的判定與藥物在豬的內(nèi)服生物利用度有直接聯(lián)系。本標(biāo)準(zhǔn)將滲透性系數(shù)（Pef）值與藥物的內(nèi)服生物利用度進(jìn)行相關(guān)性分析，以Pef值為依據(jù)建立豬常用內(nèi)服藥物BCS滲透性分類標(biāo)準(zhǔn)。通過統(tǒng)計(jì)分析顯示內(nèi)服生物利用度≥85%的藥物的Peff≧21.63×10-3cm/min。因此，藥物在豬在體小腸單向灌流試驗(yàn)在十二指腸和回腸的Pef≧21.63×10-3cm/min即為高滲透性，反之則為低滲透性。35器材和試劑5.1.1色譜儀：如高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）。5.1.2色譜柱C18(250mm×4.6mm×5μm)。5.1.3紫外-可見分光光度計(jì)。5.1.4電子分析天平。5.1.5pH測(cè)定儀。5.1.6恒溫?fù)u床。5.1.7離心機(jī)。5.1.8蠕動(dòng)泵。5.1.9硅膠管。5.1.10高速冷凍離心機(jī)。5.1.11超聲波清洗機(jī)。5.1.12超純水儀。5.1.13微型漩渦震蕩儀。5.1.14恒溫磁力攪拌器。5.1.15全自動(dòng)高壓滅菌器。5.1.16恒溫水浴鍋。5.2試劑5.2.1鹽酸（分析純）。5.2.2鄰苯二甲酸氫鉀（分析純）。5.2.3磷酸二氫鉀（分析純）。5.2.4硼酸（分析純）。5.2.5氯化鉀（分析純）。5.2.6氫氧化鈉（分析純）。5.2.7草酸（分析純）。5.2.8磷酸（分析純）。5.2.9氨水（分析純）。5.2.10甲酸（分析純）。5.2.11甲醇（色譜純）。5.2.12乙腈（色譜純）。5.2.13Krebs-Ringer緩沖液。5.2.14其他試劑均為分析純。45.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物5.3.1商品豬。6方法/實(shí)驗(yàn)步驟6.1溶液的配制6.1.1Cluck-lubs緩沖液的配制：根據(jù)調(diào)研文獻(xiàn)提供的Cluck-lubs緩沖液的配制方法進(jìn)行配置，配制方法應(yīng)符合附錄A.1的操作。6.1.20.2mol/L鹽酸：準(zhǔn)確量取3.33mL的濃鹽酸于200mL的容量瓶中，加超純水定容至200mL。6.1.30.2mol/L氯化鉀：準(zhǔn)確稱取2.98g氯化鉀于200mL容量瓶中，加超純水定容至200mL。6.1.40.2mol/L鄰苯二甲酸氫鉀：準(zhǔn)確稱取8.17g鄰苯二甲酸氫鉀于200mL容量瓶中，加超純水定容至200mL。6.1.50.2mol/L氫氧化鈉：準(zhǔn)確稱取1.60g氫氧化鈉于200mL容量瓶中，加超純水定容至200mL。6.1.60.2mol/L磷酸二氫鉀：準(zhǔn)確稱取5.44g磷酸二氫鉀于200mL容量瓶?jī)?nèi)，加超純水定容至200mL。6.1.70.2mol/L硼酸：準(zhǔn)確稱取2.48g硼酸與2.98g氯化鉀于200mL容量瓶中，加蒸餾水定容至200mL。6.1.8Cluck-lubs緩沖液（pH=2.0）：準(zhǔn)確量取0.2mol/L氯化鉀88.1mL，0.2mol/L鹽酸11.9mL于200mL容量瓶中，加超純水定容至200mL，逐滴滴加0.2mol/L鹽酸調(diào)pH為2.0。6.1.9Cluck-lubs緩沖液（pH=7.5準(zhǔn)確量取0.2mol/L氫氧化鈉39.34mL，0.2mol/L磷酸二氫鉀50.0mL于200mL容量瓶中，加超純水定容至200mL，逐滴滴加0.2mol/L鹽酸調(diào)pH為7.5。6.1.10Cluck-lubs緩沖液（其他pHBCS最大溶解性的pH測(cè)定點(diǎn)根據(jù)胃腸pH2.0~7.5及藥物自身pKa值確定，包括pH=pKa和pH=pKa±1。因此，其余pH測(cè)定點(diǎn)根據(jù)藥物本身pKa值進(jìn)行設(shè)置。6.2藥物含量測(cè)定6.2.1分析方法的選擇根據(jù)查閱文獻(xiàn)結(jié)合《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》以及2015年版《中國(guó)獸藥典》，建立豬常用內(nèi)服藥物的含量測(cè)定方法。選擇特異、靈敏、可靠的分析方法，首選色譜法，如高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）。6.2.2方法學(xué)考核專屬性：取適量貯備液，添加一定體積稀釋液稀釋至不同濃度，相應(yīng)稀釋液作為空白對(duì)照，比較空白樣品與試樣色譜圖，以藥品出峰時(shí)間處無雜質(zhì)干擾判斷為準(zhǔn)，確定方法的特異性。線性范圍：取空白pH緩沖液，添加適量藥物貯備液，稀釋至一系列不同濃度的工作濃度，渦旋1~2min，0.22μm濾膜過濾后進(jìn)行色譜法檢測(cè)，每個(gè)濃度3次重復(fù)，將對(duì)應(yīng)濃度與平均峰面積值作線性回歸，得線性回歸方程與相關(guān)系數(shù)。5靈敏度：精確量取藥物工作液備用，用特定稀釋液稀釋成系列不同的工作濃度樣品，3次重復(fù)，記錄測(cè)得的信號(hào)強(qiáng)度S與背景信號(hào)強(qiáng)度N，以S/N≥3時(shí)樣品濃度為最低檢測(cè)限(Limitofdetection，LOD)。以S/N≥10時(shí)樣品濃度為最低定量限(Limitofquantitation，LOQ)。精確度和準(zhǔn)確度：取空白灌腸液，添加適量的藥物標(biāo)準(zhǔn)貯備液，配置低、中、高3個(gè)濃度，各5份，連續(xù)3天測(cè)定1次，取平均值，計(jì)算日內(nèi)變異系數(shù)與日間變異系數(shù)以及回收率。質(zhì)量控制：分析方法只有經(jīng)過嚴(yán)格考核后才能用于藥物的檢測(cè)。考核一般由獨(dú)立的分析人員配制不同濃度的質(zhì)控樣品進(jìn)行。質(zhì)控樣品是將已知量被測(cè)物添加到空白緩沖溶液和灌腸液中配制而成。6.3溶解性的測(cè)定6.3.1樣品制備將過量的待測(cè)藥物加入至含有100mL溫度為39℃,pH為2.0、pKa-1、pKa、pKa+1、7.5的Cluck-lubs緩沖液的三角瓶中。若藥物的pKa小于2.0或大于7.5時(shí)，則將過量的待測(cè)藥物加入至含有100mL溫度為39℃,pH為2.0、4.5、5.5、6.8、7.5的Cluck-lubs緩沖液的三角瓶中。6.3.2溶液的平衡將含有藥物的混懸液置于預(yù)先調(diào)制至39℃(±0.5℃)的搖床，震蕩頻率設(shè)置為150r/min，平衡時(shí)間為2或24h。溶解達(dá)到平衡后，取1mL混懸液8000r/min離心2min，取固定體積的上清液稀釋一定倍數(shù)后利用色譜法進(jìn)行檢測(cè)，確保稀釋后的濃度在建立的色譜方法的線性范圍內(nèi)。6.3.3藥物濃度的測(cè)定將稀釋后的上清液采用建立的色譜法進(jìn)行濃度的測(cè)定，將峰面積代入建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的濃度按照公式（1）計(jì)算的出藥物的平衡飽和溶解度，公式為：（1）C為藥物最大溶解度mg/mL；V1為稀釋后的體積，mL；V為離心后吸取的初始溶液的體積，μL；C測(cè)為通過峰面積計(jì)算而得的濃度，μg/mL。6.4藥物最大使用劑量的確定通過《中國(guó)獸藥典》（2015版）查閱豬常用的內(nèi)服藥物、給藥的方式和劑量。豬的內(nèi)服給藥方式一般為混飼或混飲，無法直接得到藥物的單次最大給藥劑量，需要結(jié)合豬的單次采食量與飲水量確定最大給藥劑量。若混飼和混飲給藥，分別利用公式（2）和（3）計(jì)算藥物單次最大給藥劑量。混飲：Dmax(mg/kg.B.W.)=C飲添(mg/L)×[(0.045BW+0.40)×2.5)/3]/B.W.（2）混飼：Dmax(mg/kg.B.W.)=C混添(mg/kg)×[(0.045BW+0.40)/3]/B.W.（3）Dmax為單次最大給藥劑量mg/kg.B.W.；C飲添飲水中藥物最大添加濃度（mg/LC混添飼料中藥物最大添加濃度（mg/kg）。6.5豬采食狀態(tài)的胃液體積計(jì)算采食狀態(tài)的胃液體積(L/kg)：V=0.8803B.W.2+29.371B.W.-133.65（4）B.W.為豬的體重。6根據(jù)以下公式計(jì)算藥物的Pef：Pef=根據(jù)以下公式計(jì)算藥物的Pef：Pef=7.1豬的麻醉健康三元雜交商品豬，肌肉注射0.001mL/kg.B.W.硫酸阿托品注射液與0.05mL/kg.B.W.痛立定，然后按15mg/kg.B.W.體重耳緣靜脈緩慢推注3%戊巴比妥鈉溶液10mL進(jìn)行麻醉。7.2豬在體小腸灌流豬麻醉后，常規(guī)消毒，在腹中線上方約20cm，切開皮膚約10cm，分別取十二指腸與回腸約10cm的腸段，于兩段切口插管結(jié)扎。用預(yù)熱至39℃生理鹽水將腸內(nèi)容物沖洗干凈，用溫?zé)岬慕猩睇}水的紗布蓋住。先以預(yù)熱至39℃的K-R營(yíng)養(yǎng)液以5mL/min的流速灌流10min，再調(diào)至3mL/min流速進(jìn)行供試液灌流，平衡灌流30min，進(jìn)口處用已知質(zhì)量的裝有供試液（灌流濃度根據(jù)藥物飽和溶解度和色譜法的定量限而設(shè)定）的進(jìn)樣瓶進(jìn)行灌流，在出口處用另一已知質(zhì)量的接樣瓶進(jìn)行收集，每隔15min更換一次供試液和收集液瓶子，持續(xù)75min，冷卻至室溫后，稱量供試液小瓶和收集液小瓶重量。試驗(yàn)結(jié)束后處死豬，剪下被灌流腸段，置于充滿39℃的K-R營(yíng)養(yǎng)液的玻璃板上，測(cè)量其長(zhǎng)度與內(nèi)徑，灌流應(yīng)符合附錄A.2的操作。7.3Peff的計(jì)算將收集的灌流液12000r/min，25℃,離心20min，吸取上清液，0.22μm濾膜過濾，精密吸取濾液于高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。式中：Qin和Qout分別為灌入和收集的供試液體積（mL，假定供試液密度為1.0g/mL，根據(jù)測(cè)得質(zhì)量計(jì)算體積）；Cin和Cout分別為進(jìn)口和出口處灌流液中的藥物濃度（mg/L）；Q為灌流速度（mL/min）；r為被灌流腸段內(nèi)徑（cm）；L為被灌流腸段長(zhǎng)度（cm）；V為灌流腸段的體積（cm3）。8豬內(nèi)服藥物BCS的分類標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)測(cè)定的藥物在不同pHCluck-lubs緩沖液的飽和溶解度和藥物的最大給藥劑量與采食狀態(tài)下胃液的體積的比值進(jìn)行比較，采食狀態(tài)下的胃液體積計(jì)算為公式4所示。若藥物最大使用劑量與胃液體積的比值小于藥物在不同pHCluck-lubs緩沖液的最小飽和溶解度，則為高溶解性的藥物；否則為低溶解性藥物。豬在體小腸單向灌流試驗(yàn)在十二指腸和回腸的Pef≧2.163×10-2cm/min，大于此滲透系數(shù)即為高滲透性，反之則為低滲透性。第I類(高溶解度、高滲透性)：在39℃下，pH在2.0~7.5范圍，藥物的單次最大使用劑量能夠完全溶解于采食狀態(tài)的豬胃液體積內(nèi)且藥物在豬在體小腸單向灌流試驗(yàn)在十二指腸和回腸的Pef≧2.163×10-2cm/min。第II類(低溶解度、高滲透性)：在39℃下，pH在2.0~7.5范圍，藥物的單次最大使用劑量不能夠完全溶解于采食狀態(tài)的豬胃液體積內(nèi)但藥物在豬在體小腸單向灌流試驗(yàn)在十二指腸和回腸的Pef≧2.163×10-2cm/min。7第III類(高溶解度、低滲透性)：在39℃下，pH在2.0~7.5范圍，藥物的單次最大使用劑量能夠完全溶解于采食狀態(tài)的豬胃液體積內(nèi)但藥物在豬在體小腸單向灌流試驗(yàn)在十二指腸和回腸的Pef<2.163×10-2cm/min。第IV類(低溶解度、低滲透性)：在39℃下，pH在2.0~7.5范圍，藥物的單次最大使用劑量不能夠完全溶解于采食狀態(tài)的豬胃液體積內(nèi)但藥物在豬在體小腸單向灌流試驗(yàn)在十二指腸和回腸的Pef<2.163×10-2cm/min。8附錄A（資料性）A.1Clark-Lubs緩沖液的配置pH))KHC8H4NaOH)3)pH))KHC8H4NaOH)3)0............................2...