《細(xì)胞的破碎與分離》課件

第三章細(xì)胞的破碎與分離1精選課件ppt第三章細(xì)胞的破碎與分離1精選課件ppt本章的主要內(nèi)容常見(jiàn)的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)細(xì)胞破碎技術(shù)包涵體的純化方法2精選課件ppt本章的主要內(nèi)容常見(jiàn)的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)細(xì)胞破碎技術(shù)包涵體的純化方法2概述不同類型的細(xì)胞分泌目標(biāo)產(chǎn)物的類型：動(dòng)物細(xì)胞多分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)液植物細(xì)胞多為胞內(nèi)產(chǎn)物微生物（細(xì)菌/酵母/真菌）胞內(nèi)、胞外，對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物需要收集菌體或細(xì)胞進(jìn)行破碎。3精選課件ppt概述不同類型的細(xì)胞分泌目標(biāo)產(chǎn)物的類型：3精選課件ppt概述大多數(shù)情況下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目標(biāo)產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中。有些目標(biāo)產(chǎn)物存在于生物體中。尤其是由基因工程菌產(chǎn)生的大多數(shù)蛋白質(zhì)是在細(xì)胞內(nèi)沉積。脂類物質(zhì)和一些抗生素包含在生物體中。4精選課件ppt概述大多數(shù)情況下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目標(biāo)產(chǎn)大多數(shù)情況下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目標(biāo)產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中。有些目標(biāo)產(chǎn)物存在于生物體中。尤其是由基因工程菌產(chǎn)生的大多數(shù)蛋白質(zhì)是在細(xì)胞內(nèi)沉積。脂類物質(zhì)和一些抗生素包含在生物體中。概述5精選課件ppt大多數(shù)情況下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目標(biāo)產(chǎn)物存細(xì)胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來(lái)的技術(shù)，是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。定義6精選課件ppt細(xì)胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞外層均為細(xì)胞壁，細(xì)胞壁里面是細(xì)胞膜，動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，僅有細(xì)胞膜。通常細(xì)胞壁較堅(jiān)韌，細(xì)胞膜脆弱，易受滲透壓沖擊而破碎，因此細(xì)胞破碎的阻力主要來(lái)自于細(xì)胞壁。不同細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不完全相同，故細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度不同，細(xì)胞破碎的難易程度也就不同。細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)對(duì)破碎的影響7精選課件ppt微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞外層均為細(xì)胞壁，細(xì)胞壁里面是細(xì)胞膜，動(dòng)物細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)幾乎所有細(xì)菌的細(xì)胞壁都是由肽聚糖組成，它是難溶性的聚糖鏈；相鄰聚糖鏈上的短肽又交叉相聯(lián)，構(gòu)成了細(xì)胞壁的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包圍在細(xì)胞周圍；使細(xì)胞具有一定的形狀和強(qiáng)度。8精選課件ppt細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)幾乎所有細(xì)菌的細(xì)胞壁都是由肽聚糖組成，它是難溶細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破碎細(xì)菌的主要阻力是來(lái)自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)結(jié)構(gòu)的致密程度和強(qiáng)度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與革蘭氏陽(yáng)性菌有很大不同。

革蘭氏陰性菌典型的生物是大腸桿菌，通過(guò)這種細(xì)胞生產(chǎn)了很多細(xì)胞重組的產(chǎn)物。藥物名稱宿主用途胰島素大腸桿菌治療糖尿病人生長(zhǎng)激素大腸桿菌治療侏儒病α-干擾素大腸桿菌治療毛狀細(xì)胞白血病等9精選課件ppt細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破碎細(xì)菌的主要阻力是來(lái)自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其10精選課件ppt10精選課件ppt酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖最里層是由葡聚糖的細(xì)纖維組成，它構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛性骨架，使細(xì)胞具有一定的形狀，上面的是一層糖蛋白，最外層是甘露聚糖，由1,6-磷酸二酯鍵連接成網(wǎng)狀。在該層的內(nèi)部，有甘露聚糖-酶的復(fù)合物。破碎酵母細(xì)胞壁的阻力主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。11精選課件ppt酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖最里層是由葡聚糖的細(xì)纖維組成，它構(gòu)成了真菌的細(xì)胞壁真菌的細(xì)胞壁較厚，主要由多糖組成，其次還含有較少量的蛋白質(zhì)和脂類。不同的真菌，細(xì)胞壁的組成有很大的不同，其中大多數(shù)真菌的多糖壁是由幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成，少數(shù)含纖維素。與酵母和細(xì)菌的細(xì)胞壁一樣，真菌細(xì)胞壁的強(qiáng)度和聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)，不僅如此，它還含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，所以強(qiáng)度有所提高。12精選課件ppt真菌的細(xì)胞壁真菌的細(xì)胞壁較厚，主要由多糖組成，其次還含有較少細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)微生物革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌酵母菌真菌壁厚20-80nm10-13nm100-300nm100-250nm層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白質(zhì)(6-8%)脂類(8.5-13.5%)多聚糖(80-90%)脂類蛋白質(zhì)13精選課件ppt細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)微生物革蘭氏革蘭氏酵母菌真菌壁厚20-80細(xì)胞破碎技術(shù)14精選課件ppt細(xì)胞破碎技術(shù)14精選課件ppt細(xì)胞破碎技術(shù)15精選課件ppt細(xì)胞破碎技術(shù)15精選課件ppt細(xì)胞破碎技術(shù)16精選課件ppt細(xì)胞破碎技術(shù)16精選課件ppt細(xì)胞破碎方法及其原理機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法超聲法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：表面活性劑：酸堿酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過(guò)各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎17精選課件ppt細(xì)胞破碎方法及其原理機(jī)械破碎搗碎法物理破碎溫度差破碎法化學(xué)破一機(jī)械法機(jī)械破碎法又可分為：高壓勻漿破碎法（homogenization）高速珠研磨破碎法（beadgrinding）超聲波破碎法（ultrasonication）18精選課件ppt一機(jī)械法機(jī)械破碎法又可分為：18精選課件ppt進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量一般采用夾套冷卻的方式帶走。1.珠磨法（Beadmill）原理：19精選課件ppt進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨NetzschLM-20型珠磨機(jī)園盤(pán)以兩種位置交錯(cuò)地安裝在軸上，一種處于徑向，一種與軸傾斜，徑向盤(pán)使磨料沿徑向運(yùn)動(dòng)，傾斜盤(pán)則產(chǎn)生軸向運(yùn)動(dòng)。由于交錯(cuò)的運(yùn)動(dòng)，提高了破碎效率。A-具有冷卻夾套的圓筒形磨室B-具有冷卻裝置的攪拌軸和圓盤(pán)C-環(huán)形震動(dòng)俠縫分離器D-變速馬達(dá)1和2料液進(jìn)出口3和4攪拌冷卻劑進(jìn)出口5和6磨室冷卻劑進(jìn)出口20精選課件pptNetzschLM-20型珠磨機(jī)園盤(pán)以兩種位置交錯(cuò)地安裝在珠磨機(jī)破碎作用方程破碎作用是相對(duì)于時(shí)間的一級(jí)反應(yīng)速度過(guò)程，符合下列公式：

ln[1/(1-x)]=Ktx—破碎率；K一一級(jí)反應(yīng)速度常數(shù)；t一時(shí)間。K與攪拌轉(zhuǎn)速、細(xì)胞懸浮液濃度和循環(huán)速度、玻璃小珠裝量和珠體直徑，以及溫度等相關(guān)。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、減少大分子目的產(chǎn)物的失活、減少由于高破碎率產(chǎn)生的細(xì)胞小碎片不易分離而給后續(xù)操作帶來(lái)的困難。該式中t在間歇操作時(shí)為破碎操作時(shí)間，連續(xù)操作時(shí)為細(xì)胞懸浮液在破碎室內(nèi)的平均停留時(shí)間，即t=V/QV為破碎室的有效體積（即為懸浮液的體積），Q為料液流量。21精選課件ppt珠磨機(jī)破碎作用方程破碎作用是相對(duì)于時(shí)間的一級(jí)反應(yīng)速度過(guò)程，符膠體磨德國(guó)進(jìn)口珠磨機(jī)22精選課件ppt膠體磨德國(guó)進(jìn)口珠磨機(jī)22精選課件ppt甘蔗葉片和莖總RNA的提取及mRNA的分離純化

圖2-1甘蔗葉片總RNAFig.2-1TotalRNAisolatedfromsugarcaneleaf

圖2-2甘蔗莖總RNAFig.2-2TotalRNAisolatedfromsugarcanestem1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，顯示28S、18S和5SrRNA特征條帶清晰，說(shuō)明得到的總RNA完整性好，沒(méi)有可見(jiàn)的降解，也無(wú)明顯的基因組DNA污染。結(jié)果與分析23精選課件ppt甘蔗葉片和莖總RNA的提取及mRNA的分離純化圖2-1甘蔗甘蔗葉片和莖mRNA呈彌撒分布，長(zhǎng)度都分布在0.5～3kb范圍內(nèi)，完全符合建庫(kù)要求。圖2-3mRNA電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.2-3AgarosegelanalysisofmRNAM:1kbmarker;1:葉片mRNA;2:莖mRNAM:1kbmarker;1:leaf,smRNA;2:stem,smRNA甘蔗葉片和莖總RNA的提取及mRNA的分離純化結(jié)果與分析24精選課件ppt甘蔗葉片和莖mRNA呈彌撒分布，長(zhǎng)度都分布在0.5～3kb雙鏈cDNA（dscDNA）的合成及檢測(cè)圖2-4甘蔗葉片雙鏈cDNAFig.2-4ThedscDNAofsugarcaneleaf圖2-5甘蔗莖雙鏈cDNAFig.2-5ThedscDNAofsugarcanestem甘蔗葉片和莖dscDNA都分布在0.5～3kb之間。說(shuō)明所獲得的dscDNA是完整的。甘蔗葉片和莖dscDNA圖片差異較大，是用于電泳檢測(cè)的dscDNA用量差異造成。

結(jié)果與分析25精選課件ppt雙鏈cDNA（dscDNA）的合成及檢測(cè)圖2-4甘蔗葉片雙2.高壓勻漿法（High-pressurehomogenization）利用高壓使細(xì)胞懸浮液通過(guò)針形閥，由于突然減壓和高速?zèng)_擊撞擊環(huán)使細(xì)胞破碎，細(xì)胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時(shí)，每秒速度高達(dá)幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高速運(yùn)動(dòng)過(guò)程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細(xì)胞破碎。原理：——大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法，在微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理中常采用26精選課件ppt2.高壓勻漿法（High-pressurehomogeni高壓勻漿器的排出閥27精選課件ppt高壓勻漿器的排出閥27精選課件ppt影響高壓勻漿器細(xì)胞破碎因素被破碎的細(xì)胞分率符合如下公式：

ln[1/(1-R)]=KNPɑ

式中R—破碎率，為N次循環(huán)后，蛋白質(zhì)的釋放量Rn與最大釋放量Rm之比；K－與溫度有關(guān)的速度常數(shù)；P－操作壓力，MPa；ɑ－與微生物種類有關(guān)的常數(shù)。28精選課件ppt影響高壓勻漿器細(xì)胞破碎因素被破碎的細(xì)胞分率符合如下公式：28易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌較小的革蘭氏陽(yáng)性菌含有包含體的基因工程菌不宜采用高壓勻漿法的細(xì)胞類型。影響勻漿破碎的主要因素：壓力、溫度、通過(guò)勻漿器閥的次數(shù)29精選課件ppt易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌不宜采用高壓勻漿法的細(xì)胞類型。影大、中、小型高壓勻漿器30精選課件ppt大、中、小型高壓勻漿器30精選課件ppt超聲波破碎法（Ultrasonication)利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。超聲波的細(xì)胞破碎效率與細(xì)胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。3.超聲破碎法（Ultrasonication）31精選課件ppt超聲波破碎法（Ultrasonication)利用超聲波振蕩超聲波破碎的機(jī)理一般認(rèn)為在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用（cavitation),液體中局部空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，引起的粘滯性旋渦在細(xì)胞上造成了剪切力，使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動(dòng)，從而使細(xì)胞破碎。操作過(guò)程產(chǎn)生大量的熱，因此操作需在冰水或外部冷卻的容器中進(jìn)行。32精選課件ppt超聲波破碎的機(jī)理32精選課件ppt33精選課件ppt33精選課件ppt超聲波破碎的適用范圍超聲波破碎是很強(qiáng)烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎。一般桿菌比球菌易破碎，G-細(xì)菌比G+細(xì)菌易破碎，對(duì)酵母菌的效果較差。但超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)失活。超聲波破碎的有效能量利用率極低由于對(duì)冷卻的要求相當(dāng)苛刻，所以不易放大，但在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模細(xì)胞破碎中常用。34精選課件ppt超聲波破碎的適用范圍超聲波破碎是很強(qiáng)烈的破碎方法，適用于多數(shù)機(jī)械法的缺點(diǎn)（1）需要高的能量并且產(chǎn)生高溫和高的剪切力，容易使不穩(wěn)定產(chǎn)品變性失活；（2）就破碎的有機(jī)體或釋放的產(chǎn)物而論，它們是非專一的，并且產(chǎn)生碎片微粒尺寸的大范圍細(xì)分布，大量細(xì)顆粒給分離帶來(lái)了困難。35精選課件ppt機(jī)械法的缺點(diǎn)（1）需要高的能量并且產(chǎn)生高溫和高的剪切力，容易二非機(jī)械破碎方法非機(jī)械法又可分為：酶溶破碎法（enzymelysis）化學(xué)破碎法（chemicaltreatment）滲透壓沖擊破碎法（osmoticshock）凍融破碎法（freezingandthawing）36精選課件ppt二非機(jī)械破碎方法非機(jī)械法又可分為：36精選課件ppt1.酶溶法（EnzymaticLysis）（1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶β-1，3-葡聚糖酶β-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽鍵內(nèi)切酶殼多糖酶等酶解是利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜。37精選課件ppt1.酶溶法（EnzymaticLysis）（1）外加酶法常酶解法的特點(diǎn)是專一性強(qiáng)，因此在選擇酶系統(tǒng)時(shí)，必須根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成來(lái)選擇。溶菌酶（lysozyme)能專一性地分解細(xì)胞壁上肽聚糖分子的β-1,4糖苷鍵，因此主要用于細(xì)菌類細(xì)胞壁的裂解。革蘭氏陽(yáng)性菌懸浮液中加入溶菌酶，很快就產(chǎn)生溶壁現(xiàn)象。但對(duì)于革蘭氏陰性菌，單獨(dú)采用溶菌酶無(wú)效果，必須與螯合劑EDTA一起使用。放線菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽(yáng)性菌，以肽聚糖為主要成分，所以也能采用溶菌酶，酵母和真菌由于細(xì)胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、幾丁質(zhì)等，常用蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等。植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維素酶裂解。（1）外加酶法38精選課件ppt酶解法的特點(diǎn)是專一性強(qiáng)，因此在選擇酶系統(tǒng)時(shí)，必須根據(jù)細(xì)胞的結(jié)有時(shí)采用幾種酶的混合物會(huì)產(chǎn)生更好的效果，加入時(shí)需確定相應(yīng)的次序。

對(duì)酵母細(xì)胞采用酶法破碎時(shí)，先加入蛋白酶作用蛋白質(zhì)-甘露聚糖結(jié)構(gòu)，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質(zhì)體，這時(shí)若緩沖液的滲透壓變化，則細(xì)胞膜破裂，釋出胞內(nèi)產(chǎn)物。（1）外加酶法39精選課件ppt有時(shí)采用幾種酶的混合物會(huì)產(chǎn)生更好的效果，加入時(shí)需確定相應(yīng)的次優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)品釋放的選擇性高；抽提的速率和收率高；產(chǎn)品的破壞最少；條件溫和，對(duì)PH值和溫度等外界條件要求低；不殘留細(xì)胞碎片。缺點(diǎn)：溶酶價(jià)格高，溶酶法通用性差，產(chǎn)物抑制的存在。酶溶法的優(yōu)缺點(diǎn)40精選課件ppt優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：酶溶法的優(yōu)缺點(diǎn)40精選課件ppt（2）自溶法（Autolysis）

自溶作用是酶解的另一種方法，利用生物體自身產(chǎn)生的酶來(lái)溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代謝過(guò)程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細(xì)胞壁上聚合物的酶，以便生長(zhǎng)過(guò)程繼續(xù)下去。自溶作用：改變其生長(zhǎng)環(huán)境（溫度、ｐＨ、緩沖液），可以誘發(fā)產(chǎn)生過(guò)剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達(dá)到自溶目的。缺點(diǎn)是：易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過(guò)濾速度下降。41精選課件ppt（2）自溶法（Autolysis）自溶作用是酶解的另一種某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來(lái)。2.化學(xué)滲透法（Chemicalpermeation）該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。

42精選課件ppt某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯（1）酸、堿處理法酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采用6mol/LHCl。堿能溶解細(xì)胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來(lái)。成本低，反應(yīng)激烈，不具選擇性。采用酸堿調(diào)節(jié)溶液的PH值，改變細(xì)胞所處的環(huán)境，從而改變兩性產(chǎn)物——蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)，使蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)之間的作用力降低而易于溶解到液相中去，便于后面的提取。43精選課件ppt（1）酸、堿處理法酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采用6（2）表面活性劑無(wú)論表面活性劑是陰離子、陽(yáng)離子還是非離子型，都是兩性的，既能和水作用也能和脂作用，能與細(xì)胞壁上的脂蛋白結(jié)合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解細(xì)胞破碎常用的表面活性劑：十二烷基硫酸鈉（SDS，陰離子型）；非離子型如TritonX-100和吐溫（Tween）等對(duì)疏水性物質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)。44精選課件ppt（2）表面活性劑無(wú)論表面活性劑是陰離子、陽(yáng)離子還是非離子型，能被細(xì)胞壁脂質(zhì)層吸收后，使胞壁膜溶脹，細(xì)胞破裂，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來(lái)。乙醇、異丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高級(jí)醇等。（3）有機(jī)溶劑與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。鹽酸胍和脲是常用的變性劑。45精選課件ppt能被細(xì)胞壁脂質(zhì)層吸收后，使胞壁膜溶脹，細(xì)胞破裂，胞內(nèi)物質(zhì)被釋通用性差；時(shí)間長(zhǎng)，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過(guò)50%；有些化學(xué)試劑有毒?；瘜W(xué)試劑的加入常會(huì)給隨后產(chǎn)物的純化帶來(lái)困難，并影響最終產(chǎn)物純度?；瘜W(xué)滲透法優(yōu)缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：對(duì)產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過(guò)，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。46精選課件ppt通用性差；化學(xué)滲透法優(yōu)缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：46精選課件ppt2.物理法（Physicalpermeation）滲透壓沖擊法凍結(jié)-融化法干燥法47精選課件ppt2.物理法（Physicalpermeation）滲透壓沖1）滲透壓沖擊法滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法將細(xì)胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速膨脹而破裂。僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過(guò)程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細(xì)胞壁有缺陷，強(qiáng)度減弱。48精選課件ppt1）滲透壓沖擊法滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法48精選課2）凍結(jié)-融化法將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。一方面使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細(xì)胞膨脹而破裂。適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次。49精選課件ppt2）凍結(jié)-融化法將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化3）干燥法氣流干燥真空干燥噴霧干燥冷凍干燥使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、丁醇或緩沖液等對(duì)干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來(lái)。氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25-30℃的氣流中吹干；真空干燥多用于細(xì)菌。冷凍干燥適用于不穩(wěn)定的生化物質(zhì)50精選課件ppt3）干燥法氣流干燥使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。51精選課件ppt51精選課件ppt選擇破碎方法的依據(jù)細(xì)胞處理量；細(xì)胞壁強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)(高聚物交聯(lián)程度、種類和壁厚度)；目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)破碎條件的敏感性；破碎程度；目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性釋放52精選課件ppt選擇破碎方法的依據(jù)細(xì)胞處理量；52精選課件ppt選擇性釋放目標(biāo)產(chǎn)物的一般原則⑴僅破壞或破碎存在目標(biāo)產(chǎn)物的位置周圍當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物存在于細(xì)胞膜附近時(shí)，可采用較混和的方法，如酶溶法、滲透壓沖擊法和凍結(jié)－融化法等。當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)時(shí)，則需采用強(qiáng)烈的機(jī)械破碎法．當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物處于與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合的狀態(tài)時(shí)，調(diào)節(jié)溶液PH值，離子強(qiáng)度或添加與目標(biāo)產(chǎn)物具有親和性的試劑如：螯合劑、表面活性劑等，使目標(biāo)產(chǎn)物容易溶解釋放。(2)機(jī)械破碎法和化學(xué)法并用可使操作條件更加溫和，在相同的目標(biāo)產(chǎn)物釋放率條件下，降低細(xì)胞的破碎程度。53精選課件ppt選擇性釋放目標(biāo)產(chǎn)物的一般原則⑴僅破壞或破碎存在目標(biāo)產(chǎn)物的位置破碎率的測(cè)定與破碎技術(shù)的研究方向

1.破碎率的測(cè)定直接測(cè)定法目的產(chǎn)物測(cè)定法導(dǎo)電率測(cè)定法采用染色法把破碎的細(xì)胞與未破碎的細(xì)胞區(qū)別開(kāi)來(lái)。如破碎的革蘭氏陽(yáng)性菌可染成革蘭氏陰性菌的顏色；采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，完整的細(xì)胞呈紫色，而受損害的細(xì)胞呈亮紅色。將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心，測(cè)定上清液中目的產(chǎn)物含量或活性，并與100%破碎率的標(biāo)準(zhǔn)值比較，計(jì)算其破碎率。細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。54精選課件ppt破碎率的測(cè)定與破碎技術(shù)的研究方向1.破碎率的測(cè)定直接測(cè)定2.破碎技術(shù)的研究方向多種破碎方法相結(jié)合與上游過(guò)程相結(jié)合與下游工程相結(jié)合55精選課件ppt2.破碎技術(shù)的研究方向多種破碎方法相結(jié)合55精選課件ppt基因工程表達(dá)產(chǎn)物后處理的特殊性基因工程菌培養(yǎng)液不同表達(dá)形式的前處理胞外分泌型表達(dá)：離心,收集液相→濃縮→純化。胞內(nèi)表達(dá)：胞內(nèi)可溶性表達(dá)：離心,收集菌體→細(xì)胞破碎→離心，收集上清→純化胞內(nèi)周質(zhì)表達(dá)：離心,收集菌體→低濃度溶菌酶或滲透壓沖擊等溶解目標(biāo)物→離心,收集上清液→純化。不溶性包涵體：離心,收集菌體→細(xì)胞破碎→離心,收集沉淀→包涵體洗滌→目標(biāo)蛋白變性溶解→復(fù)性→純化。56精選課件ppt基因工程表達(dá)產(chǎn)物后處理的特殊性基因工程菌培養(yǎng)液不同表達(dá)形式的外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白產(chǎn)物占菌體總蛋白外源蛋白的積累人胰島素50%形成包涵體β-丙酰胺酶20%在細(xì)胞間區(qū)γ-人體干擾素25%形成包涵體凝乳酶原形成包涵體牛生長(zhǎng)激素>30%形成包涵體β-內(nèi)酰胺酶形成間區(qū)包涵體人胰島素原5%~26%形成包涵體57精選課件ppt外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白產(chǎn)物占菌體總蛋白外源蛋白的積累包含體的形成包涵體：一種蛋白質(zhì)不溶性聚集體，包括目標(biāo)蛋白、菌體蛋白等。目標(biāo)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，所以沒(méi)有生物活性。包涵體的形成：大腸桿菌中目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)水平過(guò)高，超過(guò)正常代謝水平，過(guò)多表達(dá)產(chǎn)物聚集在細(xì)胞內(nèi)，形成不溶性的包涵體。高表達(dá)產(chǎn)生的積聚物在細(xì)胞內(nèi)部形成不溶物原因？蛋白過(guò)量積聚，超過(guò)溶解度，導(dǎo)致沉淀；②蛋白生成太快，分子間疏水基團(tuán)相互作用而聚集沉淀；③蛋白生成太快，分子內(nèi)部二硫鍵的錯(cuò)誤連接導(dǎo)致沉淀；④表達(dá)蛋白過(guò)多，與其結(jié)合/誘導(dǎo)組分不足，不能形成溶解狀態(tài)⑤蛋白質(zhì)自身不穩(wěn)定。58精選課件ppt包含體的形成包涵體：一種蛋白質(zhì)不溶性聚集體，包括目標(biāo)蛋白、菌基因工程包涵體的純化方法收集菌體細(xì)胞細(xì)胞破碎包涵體的洗滌目標(biāo)蛋白的變性溶解目標(biāo)蛋白的復(fù)性包含體的出現(xiàn)不僅增加了生物分離設(shè)計(jì)的難度，也為蛋白質(zhì)折疊機(jī)理研究提出了新的課題。欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。59精選課件ppt基因工程包涵體的純化方法收集菌體細(xì)胞細(xì)胞破碎包涵體的洗滌目標(biāo)包涵體獲得

幾種常見(jiàn)的工藝路線(一)機(jī)械破碎(高壓勻漿、高速珠磨）離心提取包含體加變性劑溶解除變性劑復(fù)性60精選課件ppt包涵體獲得

幾種常見(jiàn)的工藝路線(一)機(jī)械破碎離心提取包含體加特點(diǎn):是利用了包含體與細(xì)胞碎片的密度差，用離心法將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開(kāi)，獲得了干凈的包含體，再對(duì)包含體溶解復(fù)性。優(yōu)點(diǎn)：擺脫了大量的雜蛋白、核酸、熱原、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，使后面的分離純化簡(jiǎn)單了。從這個(gè)角度上講，包含體的形成對(duì)分離純化亦有好處。缺點(diǎn):要經(jīng)過(guò)幾次離心才能除去大部分的細(xì)胞碎片，加工時(shí)間較長(zhǎng)。路線1的特點(diǎn)61精選課件ppt特點(diǎn):是利用了包含體與細(xì)胞碎片的密度差，用離心法將包含體與細(xì)包涵體獲得

幾種常見(jiàn)的工藝路線（二）機(jī)械破碎膜分離獲得包涵體加變性劑溶解包含體除變性劑復(fù)性62精選課件ppt包涵體獲得

幾種常見(jiàn)的工藝路線（二）機(jī)械破碎膜分離獲得包涵體路線（二）應(yīng)用了膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶性蛋白質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)是封閉式操作，不污染環(huán)境也不受環(huán)境污染，能量消耗也比離心法少。缺點(diǎn)：細(xì)胞碎片和包含體一起被膜擋住，難以分開(kāi)；而且膜的堵塞和濃差極化常常導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的滯留。路線2的特點(diǎn)63精選課件ppt路線（二）應(yīng)用了膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶性蛋白質(zhì)。包涵體獲得

幾種常見(jiàn)的工藝路線（三）化學(xué)破碎（加變性劑）離心除細(xì)胞碎片除變性劑復(fù)性64精選課件ppt包涵體獲得

幾種常見(jiàn)的工藝路線（三）化學(xué)破碎離心除細(xì)胞碎片除用化學(xué)法破碎，所采用的試劑既可以破碎又可以溶解包含體，將兩道工序和為一道，節(jié)省了設(shè)備和時(shí)間，比前兩者更適合于實(shí)驗(yàn)室操作。缺點(diǎn)是所有的可溶性雜質(zhì)都沒(méi)有除去，混雜在產(chǎn)物中間，給后續(xù)分離帶來(lái)困難。

路線三：65精選課件ppt用化學(xué)法破碎，所采用的試劑既可以破碎又可以溶解包含體，將兩道1）包涵體的洗滌細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密。洗滌的重要性：收集的沉淀中，除包涵體外，還包括許多雜質(zhì)，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，復(fù)性時(shí)會(huì)與目標(biāo)蛋白一起復(fù)性形成雜交分子而聚集，給后步純化帶來(lái)困難。洗滌劑：溫和的表面活性劑、蔗糖、低濃度的弱變性劑（如尿素）或脫氧膽酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂質(zhì)類雜質(zhì)。洗滌劑濃度以溶解雜質(zhì)，不溶解包涵體中表達(dá)產(chǎn)物為原則。66精選課件ppt1）包涵體的洗