貴州大學(xué)生物工藝學(xué)原理(無菌技術(shù))

生物工藝學(xué)使用班級:生物工程09級教師:吳鑫穎日期:2012年3月~2012年7月教材：國家十一五規(guī)劃教材《生物工藝學(xué)》

（邱樹毅主編）

目錄第一章緒論第二章工業(yè)微生物菌種選育、制備與保藏第三章工業(yè)培養(yǎng)基及其設(shè)計第四章生物工藝過程中的無菌技術(shù)第五章生物反應(yīng)動力學(xué)第六章發(fā)酵過程原理第七章生物反應(yīng)器及生物工藝過程的放大第八章生物反應(yīng)過程參數(shù)檢測與控制第九章生物產(chǎn)品分離及純化技術(shù)第十章生物產(chǎn)品工藝學(xué)及應(yīng)用

第四章生物工藝過程中的無菌技術(shù)

4.1生物反應(yīng)過程中無菌的要求4.2工業(yè)常用無菌技術(shù)4.2.1干熱滅菌4.2.2濕熱滅菌4.2.3射線滅菌4.2.4化學(xué)藥劑滅菌4.2.5過濾除菌4.3培養(yǎng)基滅菌4.3.1濕熱滅菌原理4.3.2分批滅菌4.3.3連續(xù)滅菌4.4空氣除菌4.4.1空氣除菌方法4.4.2空氣除菌流程

4.5設(shè)備及管道滅菌滅菌指利用物理和化學(xué)的方法殺滅or除去物料及設(shè)備中的一切生命物質(zhì)的過程。消毒是指用物理和化學(xué)的方法殺死物料、設(shè)備、器具內(nèi)外的病源微生物。消毒不一定能達到滅菌的要求，而滅菌可達到消毒的目的。4.1生物反應(yīng)過程中無菌的要求通常工業(yè)上采取的主要措施是：(1)對培養(yǎng)基進行滅菌處理；(2)對好氧過程的空氣進行滅菌處理；(3)對生物反應(yīng)器(發(fā)酵罐)及其連接管道進行滅菌處理；(4)菌種為無污染的純粹種子；(5)使生物反應(yīng)器處于正壓環(huán)境；(6)對培養(yǎng)過程中補料進行滅菌處理等。4.2.1干熱滅菌

4.2工業(yè)常用無菌技術(shù)4.2.2濕熱滅菌

4.2.3射線滅菌

4.2.4化學(xué)藥劑滅菌4.2.5過濾除菌

干熱滅菌時，微生物主要由于氧化，體內(nèi)蛋白質(zhì)變性和電解質(zhì)濃縮引起中毒等作用而死亡。(1)灼燒法。常用于實驗室接種針、勺、試管或三角瓶口和棉塞的滅菌，也用于工業(yè)發(fā)酵罐接種時的火環(huán)保護。

(2)烘箱熱空氣法。將物品放入烘箱內(nèi)，然后升溫至150～170℃，維持1～2小時。經(jīng)過烘箱熱空氣可以達到徹底滅菌的目的。該法適用于玻璃、陶瓷和金屬物品的滅菌。其優(yōu)點是滅菌后物品干燥，缺點是操作所需時間長，易損壞物品，對液體樣品不適用。4.2.1干熱滅菌

濕熱滅菌：利用飽和蒸汽釋放的熱能使微生物細胞中的蛋白質(zhì)、酶、核酸等分子內(nèi)的化學(xué)健受到不可逆破壞而進行滅菌的方法。濕熱蒸汽具有較高的穿透能力，溫度每升高10℃，細胞死亡速率常熟增加8~10以上。通常濕熱滅菌條件為121℃，維持30min。高壓蒸汽滅菌是實驗室、發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中最常用的滅菌方法。一般培養(yǎng)基、玻璃器皿、無菌水、緩沖液、金屬用具等都可以采用此法滅菌。4.2.2濕熱滅菌

射線滅菌：利用紫外線、高能電磁波或放射性物質(zhì)產(chǎn)生的高能粒子進行滅菌的方法，其中以紫外線（260nm）最常用。其殺菌作用主要是因為導(dǎo)致DNA胸腺嘧啶間形成胸腺嘧啶二聚體和胞嘧啶水合物，抑制DNA正常復(fù)制。此外，空氣在紫外線輻射下產(chǎn)生的臭氧有一定殺菌作用。

4.2.3射線滅菌

某些化學(xué)試劑能與微生物發(fā)生反應(yīng)而具有殺菌作用。

常用的化學(xué)藥劑有75%（v/v）酒精、甲醛、漂白粉(或次氯酸鈉)、高錳酸鉀、過氧乙酸、環(huán)氧乙烷、季銨鹽等?；瘜W(xué)藥劑不能用于培養(yǎng)基的滅菌，一般應(yīng)用于發(fā)酵工廠環(huán)境、器具等的消毒。4.2.4化學(xué)藥劑滅菌環(huán)氧乙烷滅菌柜

過濾除菌：利用過濾法阻留微生物以達到除菌的目的。此法僅適用于不耐高溫、澄清的液體培養(yǎng)基組分和空氣的過濾除菌。4.2.5過濾除菌4.3.1濕熱滅菌原理

4.3培養(yǎng)基滅菌4.3.2分批滅菌

4.3.3連續(xù)滅菌4.3.1.1微生物熱阻熱滅菌原理：每種微生物都有一定的生長溫度范圍。當(dāng)微生物處于超過生長溫度的上限的環(huán)境時，微生物細胞中的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)會發(fā)生不可逆變性，使微生物在很短的時間內(nèi)死亡，加熱滅菌就是根據(jù)微生物的這一特性進行的?！钜话阄⑸锏臓I養(yǎng)細胞在60℃加熱10min全部死亡；細菌芽孢能耐受較高的溫度，在100℃需要數(shù)分鐘甚至數(shù)小時才能被殺滅。某些嗜熱菌的芽孢在120℃下需30min甚至更長時間才能殺滅。所以，一般衡量滅菌徹底與否，是以能否殺滅芽孢細菌為標準。

4.3.1濕熱滅菌原理

☆致死溫度：殺死微生物的極限溫度；或指在一定時間內(nèi)殺死微生物的最低溫度。

☆致死時間：在致死溫度下，殺死全部微生物所需要的最少時間?！钤谥滤罍囟纫陨?，溫度愈高，致死時間愈短?！顭嶙瑁何⑸飳岬牡挚沽Γ粗肝⑸镌谀骋惶囟l件下(主要是溫度)的致死時間?！钕鄬嶙瑁褐改骋粭l件下的致死時間與另一微生物在相同條件下的致死時間之比。對數(shù)殘留定律：在一定溫度下，微生物受熱致死遵循分子反應(yīng)速率理論，微生物受熱死亡的速率－dN/dt在任何瞬間與殘留的活菌數(shù)N成正比，其數(shù)學(xué)表達式為

式中：N—殘留活菌數(shù)，個；

t—受熱時間，min；

k—反應(yīng)速率常數(shù)，比死亡速率常數(shù)，s-1。k也稱滅菌速率常數(shù)；

k是微生物耐熱性的一種特征，隨微生物的種類和滅菌溫度不同而不同。k越小，微生物越耐熱。

dN/dt—活菌數(shù)瞬時變化速率，即死亡速率。4.3.1.2濕熱滅菌的對數(shù)殘留定律若開始滅菌(t=0)時，培養(yǎng)基中活的微生物數(shù)為N0，將上式積分后可得到式中：N0—開始滅菌時原有的活菌數(shù)，個；

Nt—經(jīng)過t時間滅菌后的殘留菌數(shù)，個。

亦可看出，如果要求完全徹底滅菌，即殘留菌數(shù)Nt=0時，需要的滅菌時間為無窮大，此式即無意義，事實上是不可能的。因此，工程上進行滅菌設(shè)計時，一般采用Nt=0.001，即在1000次滅菌中允許有一次染菌機會。4.3.1.2濕熱滅菌的對數(shù)殘留定律

在實際過程中某些微生物受熱死亡的速率是不符合對數(shù)殘留規(guī)律的。將其N0/Nt對滅菌時間t在半對數(shù)坐標中標繪得到的殘留曲線不是直線。呈現(xiàn)這種熱死亡非對數(shù)動力學(xué)行為的主要是一些微生物芽孢。有關(guān)這一類熱死亡動力學(xué)的行為，以Prokop和Hunphey所提出的“菌體循序死亡模型”最有代表性，其假設(shè)耐熱性微生物芽孢的死亡不是突然的，而是漸變的，即耐熱性芽孢(R型)先轉(zhuǎn)變?yōu)閷崦舾械闹虚g態(tài)芽孢(S型)，然后轉(zhuǎn)變成死亡的芽孢(D型)，這一過程可用下式表示

NR—耐熱性活芽孢數(shù)(R型)；NS—敏感性活芽孢數(shù)(S型)；

ND—死亡的芽孢數(shù)(D型)；

4.3.1.3濕熱滅菌的非對數(shù)殘留定律根據(jù)對數(shù)殘留定律，聯(lián)立微分方程可得式中：Nt—任一時刻具有活力的芽孢數(shù)，即Nt=NS+NR；

N0—初始的活芽孢數(shù)；

kR—耐熱性芽孢的比死亡速率，s-1；

kS—敏感性芽孢的比死亡速率，s-1。在溫度相同時，對數(shù)與非對數(shù)定律的滅菌時間t不同。4.3.1.3濕熱滅菌的非對數(shù)殘留定律

4.3.1.4滅菌溫度和時間的選擇微生物的受熱死亡屬于單分子反應(yīng)，其滅菌速率常數(shù)k與溫度之間的關(guān)系可用阿累尼烏斯方程表示：式中：A—阿累尼烏斯常數(shù)，s-1；

R—氣體常數(shù)，8.314J/(mol·K)；

T—熱力學(xué)溫度，K；

△E—微生物死亡活化能，J/mol。

大部分培養(yǎng)基的破壞也可認為是一級分解反應(yīng)，若其他條件不變，培養(yǎng)基成分分解速率常數(shù)和溫度的關(guān)系也可用阿累尼烏斯方程表示。當(dāng)培養(yǎng)基受熱溫度從T1上升至T2時，微生物的比死亡速率常數(shù)k和培養(yǎng)基成分分解破壞的速率常數(shù)k′變化情況為☆對微生物的死亡情況而言將上述兩式相除并取對數(shù)后可得☆培養(yǎng)基成分的破壞，同樣也可得兩式相除得

4.3.1.4滅菌溫度和時間的選擇

由于滅菌時殺死微生物的活化能大于培養(yǎng)基成分破壞的活化能△E′，因此隨著溫度的上升，微生物比死亡速率常數(shù)增加倍數(shù)要大于培養(yǎng)基成分破壞分解速率常數(shù)的增加倍數(shù)。也就是說，當(dāng)滅菌溫度升高時，微生物死亡速率大于培養(yǎng)基成分破壞的速率。

根據(jù)這一理論，培養(yǎng)基滅菌一般選擇高溫快速滅菌法，則為達到相同的滅菌效果，提高滅菌溫度可以明顯縮短滅菌時間，并可減少培養(yǎng)基因受熱時間長而遭到破壞的損失。4.3.1.4滅菌溫度和時間的選擇4.3.1.4滅菌溫度和時間的選擇滅菌溫度/℃完全滅菌時間/min維生素B1破壞量/%10040099.3110366711515501204271300.581450.0821500.01＜1滅菌溫度和完全滅菌時間對維生素B1破壞量的比較不同成分的培養(yǎng)基其含菌量是不同的。培養(yǎng)基中微生物數(shù)量越多，達到無菌要求所需的滅菌時間也越長。天然基質(zhì)培養(yǎng)基，特別是營養(yǎng)豐富或變質(zhì)的原料中含菌量遠比化工原料的含菌量多，因此，滅菌時間要適當(dāng)延長。含芽孢桿菌多的培養(yǎng)基，要適當(dāng)提高滅菌溫度并延長滅菌時間。

4.3.1.5影響培養(yǎng)基滅菌的其他因素培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基pH培養(yǎng)基物理狀態(tài)泡沫微生物數(shù)量pH對微生物的耐熱性影響很大，pH為6.0～8.0時微生物耐熱能力最強，pH小于6.0時，H+易滲入微生物細胞內(nèi)，改變細胞的生理反應(yīng)促使其死亡。所以培養(yǎng)基pH愈低，滅菌所需時間愈短。

因為熱的傳導(dǎo)及對流作用使固體培養(yǎng)基的滅菌時間要比液體培養(yǎng)基的滅菌時間長。假如100℃時液體培養(yǎng)基的滅菌時間為1h，而固體培養(yǎng)基則需要2～3h才能達到同樣的滅菌效果。泡沫中的空氣形成隔熱層，使傳熱困難，對滅菌極為不利。需對易產(chǎn)生泡沫的培養(yǎng)基加入少量消泡劑后再進行滅菌。

高濃度有機物會在細胞的周圍形成一層薄膜，從而影響熱的傳入，使滅菌溫度高些。如培養(yǎng)基中的油脂、糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)會增加了微生物的耐熱性。4.3.2分批滅菌

培養(yǎng)基的分批滅菌：就是將配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器中，用直接蒸汽或間接蒸汽將培養(yǎng)基和所用設(shè)備加熱到滅菌溫度(一般121℃)，并在此溫度維持一定時間，再冷卻到發(fā)酵溫度，此操作過程，也稱為實罐滅菌。分批滅菌過程包括升溫、維持和冷卻三個階段空消：是對發(fā)酵罐設(shè)備及其周邊連接管道進行滅菌處理。優(yōu)點：培養(yǎng)基的分批滅菌不需要專門的滅菌設(shè)備，對蒸汽要求低，投資少，設(shè)備簡單，滅菌效果可靠。缺點：在滅菌過程中蒸汽消耗量大，造成鍋爐負荷波動大。應(yīng)用：常用于中、小型發(fā)酵罐的培養(yǎng)基滅菌。分批滅菌步驟：通常應(yīng)先把發(fā)酵罐的分空氣過濾器滅菌并用空氣吹干。開始滅菌時，放去夾套或蛇管中的冷水，開啟排氣管閥，通過空氣管向罐內(nèi)的培養(yǎng)基通過蒸汽進行加熱。當(dāng)培養(yǎng)基溫度升到75℃左右時，從取樣管和放料管向罐內(nèi)通入蒸汽，培養(yǎng)基溫度達到120℃，罐壓達1×105Pa(表壓)時，安裝在發(fā)酵罐上封頭的接種、補料、消泡劑、酸、堿管道應(yīng)排氣，并調(diào)節(jié)好各進氣和排氣閥門，使罐壓和溫度保持在這一水平進行保溫。在保溫階段，凡進口在培養(yǎng)基液面下的各管道以及顯示鏡管都應(yīng)通入蒸汽，在液面上的其余各管道則應(yīng)排放蒸汽。保溫結(jié)束后，依次關(guān)閉各排氣，進氣閥門，待罐內(nèi)壓力低于空氣壓力后，向罐內(nèi)通入無菌空氣，在夾套或蛇管中通冷卻水，使培養(yǎng)基溫度降到所需溫度。培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌：是將配好的培養(yǎng)基在向發(fā)酵罐等培養(yǎng)裝置輸送的同時進行加熱、保溫和冷卻的滅菌過程。圖4-1連續(xù)滅菌過程中溫度變化

4.3.3連續(xù)滅菌優(yōu)點：①可采用高溫短時滅菌，培養(yǎng)基受熱時間短，營養(yǎng)成分損失少，有利于提高發(fā)酵率,發(fā)酵罐利用及產(chǎn)量；②產(chǎn)品質(zhì)量較易控制。③蒸汽負荷均衡，鍋爐利用率高，操作方便。④適宜采用自動控制。⑤勞動強度低⑥采用板式換熱器時，可節(jié)約大量能量。但對培養(yǎng)基中含有較多的固體顆粒或泡沫時，采用分批滅菌較好。連續(xù)滅菌的基本設(shè)備一般包括：①配料預(yù)熱罐：將配好的料液預(yù)熱到60～70℃，以避免滅菌時由于料液與蒸汽溫度相差過大而產(chǎn)生水汽撞擊聲；②加熱裝置：主要作用是通過直接蒸汽或間接蒸汽使料液溫度快速上升到滅菌溫度，常有連消泵（塔）、蒸汽噴射加熱器、薄板換熱器等；③維持器：在滅菌溫度下使料液維持一段時間，達到滅菌效果；④冷卻器：從加熱的料液要冷卻降溫至發(fā)酵溫度，滿足生產(chǎn)要求。生產(chǎn)上一般采用冷卻水噴淋冷卻、閃蒸罐（真空冷卻器）、薄板換熱器等。4.3.3連續(xù)滅菌冷卻器常用連續(xù)滅菌工藝流程

4.3.3.1連消塔—噴淋冷卻流程

4.3.3.2噴射加熱—真空冷卻流程

4.3.3.3板式換熱器滅菌流程4.3.3.1連消塔—噴淋冷卻流程圖4-3真空冷卻的連續(xù)滅菌流程4.3.3.2噴射加熱—真空冷卻流程流程優(yōu)點：加熱和冷卻在瞬間完成，營養(yǎng)成分破壞最少，可以采用高溫滅菌，把溫度升高到140℃而不致引起培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的嚴重破壞。

圖4-4薄板換熱器連續(xù)滅菌流程4.3.3.3板式換熱器滅菌流程優(yōu)點：★流程中采用了薄板換熱器同時完成培養(yǎng)液的預(yù)熱、滅菌及冷卻過程?！锸古囵B(yǎng)液的預(yù)熱、加熱滅菌及冷卻過程可在同一設(shè)備內(nèi)完成?！镫m然利用板式熱交換器進行連續(xù)滅菌時，加熱和冷卻培養(yǎng)液所需要的時間比使用噴射式連續(xù)滅菌稍長，但滅菌周期則較間歇滅菌短得多?！镉捎跍缇囵B(yǎng)液的預(yù)熱過程同時為滅菌培養(yǎng)液的冷卻過程，所以節(jié)約了蒸汽及冷卻水的用量。4.4

空氣除菌1、空氣中微生物分布

103~104個/m3、氣候、環(huán)境等

2、生產(chǎn)對空氣的要求菌種的生長性能、pH

3、空氣含菌測定方法空氣除菌方法4.4.1.1熱殺菌壓縮產(chǎn)熱進行干熱滅菌（壓縮后一般能達到200度以上）4.4.1.2輻射殺菌

X-射線、β-射線、紫外線、超聲波、γ-射線等應(yīng)用較廣泛的還是紫外線（波長在253.72～256nm），其殺菌力與紫外線的強度成正比，與距離的平方成反比。常用于無菌室（常用的紫外燈功率為30W，安裝在操作臺上方一米左右高處，每次照射15-30min既可）和醫(yī)院手術(shù)室等空氣對流不大的環(huán)境消毒殺菌。但殺菌效率低，殺菌時間長，一般要結(jié)合甲醛或苯酚噴霧等來保證無菌室的高度無菌。4.4.1.3靜電除菌

靜電除塵是利用靜電引力吸附帶電粒子而達到除菌除塵的目的。懸浮于空氣中的微生物，其孢子大多帶有不同的電荷,沒有帶電荷的微粒在進入高壓靜電場時都會被電離變成帶電微粒，對于一些直徑很小的微粒，它所帶的電荷很小，當(dāng)產(chǎn)生的引力等于或小于氣流對微粒的拖帶力或微粒布朗擴散運動的動量時，則微粒就不能被吸附而沉降，所以靜電除塵對很小的微粒效率較高。空氣除菌方法電極鋼絲鋼管絕緣瓶鋼板空氣出口封頭管板法蘭空氣進口管式靜電除菌器4.4.1.4過濾除菌法是使空氣通過經(jīng)高溫滅菌的介質(zhì)過濾層，阻截空氣中的微生物等顆粒，而達到除菌的目的。此法經(jīng)濟適用、易于控制，目前在生產(chǎn)中使用最多。常用的過濾介質(zhì)按孔隙的大小可分為兩大類：一類是介質(zhì)間孔隙大于微生物直徑，故必須有一定厚度濾層才能達到過濾除菌的目的，一般有：棉花、活性炭、玻璃纖維、有機合成纖維、燒結(jié)材料（燒結(jié)金屬、燒結(jié)陶瓷、燒結(jié)塑料）；另一類介質(zhì)的孔隙小于細菌，含細菌等微生物的空氣通過介質(zhì)，微生物就被截留于介質(zhì)上而實現(xiàn)過濾除菌，有時稱之為絕對過濾?？諝獬椒?、慣性沖擊滯留

2、攔截滯留

3、布朗擴散

4、重力沉降

5、靜電吸附dfb●●●●●dp●介質(zhì)除菌機理對數(shù)穿透定律（理想情況：每個纖維的流態(tài)不受其他纖維的存在而影響；空氣中的微粒被吸附后不再被氣流卷走；過濾效率與空氣中粒子濃度無關(guān)；每一纖維層除去菌體的百分比相同）1、慣性沖擊滯留作用機理當(dāng)微粒以一定的速度垂直纖維方向運動時，空氣受阻即改變方向，繞過纖維前進。而微粒由于它的運動慣性較大，未能及時改變運動方向，直沖到纖維的表面，由于摩擦黏附，微粒就滯留在纖維表面上，這稱為慣性沖擊滯留作用。纖維能滯留微粒的寬度區(qū)間b與纖維直徑df之比，稱為單纖維的慣性沖擊捕集效率

(a)慣性2．?dāng)r截滯留作用微粒隨空氣氣流向前運動，當(dāng)氣流為層流時，隨氣流運動的粒子在接近纖維表面的部分由于與過濾介質(zhì)接觸而被纖維吸附捕集，這種作用稱之為阻攔滯留。空氣流速愈小，纖維直徑愈細，阻攔截留作用愈大。但是在介質(zhì)過濾的除塵除菌中，阻攔截留并不起主要作用。(b)攔截3．布朗擴散截留作用直徑很小的微粒在緩慢流動的氣流中能產(chǎn)生一種不規(guī)則的直線運動，稱為布朗擴散。布朗擴散的范圍一般很?。ㄎ⒚准墸?，故在較大氣速和較大的空間范圍內(nèi)，它是不起作用的；但在緩慢流動的氣流和極小的纖維間隙間，布朗擴散作用大大增強了微粒與纖維的接觸和被捕捉率。(c)擴散４、重力沉降作用機理重力沉降是一個穩(wěn)定的分離作用，當(dāng)微粒所受的重力大于氣流對它的拖帶力時，微粒就容易沉降。就單一的重力沉降情況下，大顆粒比小顆粒作用顯著，對于小顆粒只有在氣流速度很慢時才起作用。一般它是與攔截作用相配合的，即在纖維的邊界滯留區(qū)內(nèi)，微粒的沉降作用提高了攔截滯留的捕集效率。

(d)重力５、靜電吸附作用機理干空氣對非導(dǎo)體的物質(zhì)相對運動磨擦?xí)r，會產(chǎn)生誘導(dǎo)電荷，纖維和樹脂處理過的纖維，尤其是一些合成纖維更為顯著。(e)靜電4.4.2空氣除菌流程空氣除菌流程是按發(fā)酵生產(chǎn)時對無菌空氣的要求，如無菌程度、空氣壓力、溫度和濕度等，并結(jié)合采氣環(huán)境的空氣條件和所用除菌設(shè)備的特性，空氣的性質(zhì)等制定的。一般流程：采風(fēng)壓縮除水、除油加熱總過濾分過濾4.4.2.1兩級冷卻、加熱除菌流程4.4.2.2冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程4.4.2.3高效前置過濾空氣除菌流程4.4.2.4利用熱空氣加熱冷空氣的流程4.4.2