熒光定量原理與應(yīng)用第二版

關(guān)于熒光定量原理與應(yīng)用第二版提綱PCR簡介

熒光定量PCR技術(shù)原理熒光化學(xué)物質(zhì)簡介定量方法實時熒光定量PCR技術(shù)簡介：第2頁,共50頁，2024年2月25日，星期天PCR概念什么是PCR？PolymeraseChainReaction(PCR)聚合酶鏈反應(yīng)是在體外選擇性的擴(kuò)增特定DNA片段的方法。第3頁,共50頁，2024年2月25日，星期天ClassicPCR第4頁,共50頁，2024年2月25日，星期天ClassicPCR第5頁,共50頁，2024年2月25日，星期天PCR循環(huán)第一步加熱變性、雙鏈打開第二步退火、引物與單鏈結(jié)合第三步-引物延伸變?yōu)閮蓚€雙鏈DNA第6頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第7頁,共50頁，2024年2月25日，星期天常規(guī)PCR常規(guī)PCR技術(shù)：PCR后借助電泳對擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析S1S2MDNAEngine第8頁,共50頁，2024年2月25日，星期天提綱PCR簡介

熒光定量PCR技術(shù)原理熒光化學(xué)物質(zhì)簡介定量方法實時熒光定量PCR技術(shù)簡介：第9頁,共50頁，2024年2月25日，星期天定量PCR定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線實現(xiàn)對起始模板的定量分析IQ5Real-timePCR儀第10頁,共50頁，2024年2月25日，星期天PCR反應(yīng)混合物Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA多聚酶引物模板DNA或緩沖液熒光物質(zhì)第11頁,共50頁，2024年2月25日，星期天提綱PCR簡介熒光定量PCR技術(shù)原理

熒光化學(xué)物質(zhì)簡介定量方法實時熒光定量PCR技術(shù)簡介：第12頁,共50頁，2024年2月25日，星期天

SYBRGreen1

TaqMan熒光化學(xué)第13頁,共50頁，2024年2月25日，星期天SYBRGreenISYBRGreen1第14頁,共50頁，2024年2月25日，星期天SYBRGreenI工作原理

SYBRGreen1

結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位

SYBRGreen1染料結(jié)合狀態(tài)時熒光強(qiáng)度是非結(jié)合狀態(tài)的800-1000倍GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA第15頁,共50頁，2024年2月25日，星期天SYBRGreenI第16頁,共50頁，2024年2月25日，星期天SYBRGreenI第17頁,共50頁，2024年2月25日，星期天SYBRGreenI第18頁,共50頁，2024年2月25日，星期天與傳統(tǒng)PCR的比較實現(xiàn)了初始模板的絕對定量檢測靈敏度高可以檢測到低拷貝的目的基因可以區(qū)分微小的拷貝數(shù)差異可以對初始模板含量差異較大的樣品同時定量省時省力檢測設(shè)計靈活第19頁,共50頁，2024年2月25日，星期天MeltCurveAnalysis第20頁,共50頁，2024年2月25日，星期天MeltCurveAnalysis第21頁,共50頁，2024年2月25日，星期天SYBRGreenI優(yōu)點

使用方便 ---不必設(shè)計復(fù)雜的熒光探針

沒有序列特異性---可以用于不同的模板

便宜

靈敏第22頁,共50頁，2024年2月25日，星期天SYBRGreenI缺點

與非特異性產(chǎn)物結(jié)合第23頁,共50頁，2024年2月25日，星期天TaqMan探針熒光素淬滅劑TaqMan水解型雜交探針第24頁,共50頁，2024年2月25日，星期天TaqMan

目標(biāo)特異性探針

5’為熒光素，3’為淬滅劑5’熒光素3’淬滅劑與目標(biāo)序列互補第25頁,共50頁，2024年2月25日，星期天TAQMANProbes第26頁,共50頁，2024年2月25日，星期天TAQMANProbes第27頁,共50頁，2024年2月25日，星期天TAQMANProbes第28頁,共50頁，2024年2月25日，星期天TAQMANProbes第29頁,共50頁，2024年2月25日，星期天TaqMan優(yōu)點對目標(biāo)序列有很高的特異性

---特別適合于SNP檢測第30頁,共50頁，2024年2月25日，星期天TaqMan缺點

價格較高

只適合于一個特定的目標(biāo)

不能進(jìn)行融解曲線分析背景高第31頁,共50頁，2024年2月25日，星期天兼容化學(xué)試劑總結(jié)結(jié)合于雙鏈DNA的小溝中發(fā)夾型雜交探針?biāo)庑碗s交探針（5‘-3’外切）延伸復(fù)性任何步驟定量和檢測目標(biāo)基因融解曲線分析SNP分析定量和檢測目標(biāo)基因SNP分析定量和檢測目標(biāo)基因信號檢測工作原理有否淬滅劑化學(xué)試劑否有有主要應(yīng)用范圍第32頁,共50頁，2024年2月25日，星期天熒光曲線

隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強(qiáng)度不斷增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一次熒光強(qiáng)度信號，得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖第33頁,共50頁，2024年2月25日，星期天定量原理

如何對起始模板定量？通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線實現(xiàn)對起始模板的定量分析引入兩個概念：熒光閾值、Ct值第34頁,共50頁，2024年2月25日，星期天定量原理熒光閾值在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期設(shè)定一個熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn))閾值線第35頁,共50頁，2024年2月25日，星期天Ct值的概念定量原理Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物(熒光信號）到達(dá)閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t)值C(t)值18.12+/0.04-閾值線第36頁,共50頁，2024年2月25日，星期天提綱PCR簡介熒光定量PCR技術(shù)原理熒光化學(xué)物質(zhì)簡介定量方法實時熒光定量PCR技術(shù)簡介：第37頁,共50頁，2024年2月25日，星期天

絕對定量確定初始模板的準(zhǔn)確含量需要標(biāo)準(zhǔn)曲線

相對定量確定樣品間初始模板的含量倍數(shù)差異相對標(biāo)準(zhǔn)曲線不使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用Ct值計算

ΔCt方法

ΔΔCt方法（看家基因）

Pfaffl方法（考慮擴(kuò)增效率）

Vandesompele方法（多看家基因）14500copies定量方法

第38頁,共50頁，2024年2月25日，星期天借助標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值反推出其初始量得到未知樣品初始量絕對值unknown104103Unknowncontains3108copies絕對定量第39頁,共50頁，2024年2月25日，星期天

ΔCT法相對定量無均一化處理均一化依賴于加樣的一致性相對定量——ΔCT

Sample1Ct1(25)Sample2Ct2(22)ΔCT=Ct1-Ct2=25-22=3基因表達(dá)量Sample1/Sample2=2

–ΔCT=2-3=1/8第40頁,共50頁，2024年2月25日，星期天相對定量——ΔΔCTΔΔCT法相對定量考慮到了加樣誤差通常使用看家基因來完成均一化處理Sample1Ct1(25)Sample2Ct2(22)內(nèi)參基因actinCt0120Ct0221ΔCT1=Ct1-Ct01=25-20=5ΔCT2=Ct2-Ct02=22-21=1ΔΔCT=ΔCT1-ΔCT2=5-1=4基因表達(dá)量Sample1/sample2=2-

ΔΔCT=2-4=1/16第41頁,共50頁，2024年2月25日，星期天SimpleComplex2

CT

假定目的基因與看家基因的擴(kuò)增效率都是100%

只有一個看家基因

PfafflModification

考慮到擴(kuò)增效率的影響只有一個看家基因

VandesompeleMethod

考慮到擴(kuò)增效率的影響有多個看家基因相對定量第42頁,共50頁，2024年2月25日，星期天

利用相對標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，定量結(jié)果相除得到倍數(shù)差別同時建立兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線一條目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線至少再做一條看家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線借助標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)擴(kuò)增效率的影響

使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行相對定量分析相對定量——標(biāo)準(zhǔn)曲線法第43頁,共50頁，2024年2月25日，星期天

進(jìn)行可靠的定量實驗需要對引物對進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計用于優(yōu)化擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量和特異性的參數(shù)

引物設(shè)計擴(kuò)增片段選擇試劑的濃度循環(huán)條件變性溫度和退火溫度PCR體系優(yōu)化第44頁,共50頁，2024年2月25日，星期天利用動態(tài)溫度梯度功能一次實現(xiàn)退火溫度的優(yōu)化退火溫度的優(yōu)化第45頁,共50頁，2024年2月25日，星期天45oC55oC65oC溶解曲線擴(kuò)增曲線1.95oCfor15min2.94oCfor10sec3.Gradientfrom45oCto65oCfor15sec4.72oCfor30sec5.83oCfor1sec6.PlateRead7.Gotoline239moretimes8.Meltingcurvefrom65oCto95oC,read

every0.2oC,hold1sec.退火溫度的優(yōu)化第46頁,共50頁，2024年2月25日，星期天實時熒光定量PCR應(yīng)用定量：

DNA定量

RNA定量定性：

SNP分析基因型分析

RNA變異分析融解曲線分析第47頁,共50頁，2024年2月25日，星期天定量PCR應(yīng)用I-實時定量

病原體定量檢測轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測DNA定量——拷貝數(shù)研究（替代SouthernBlot）RNA定量——基因表達(dá)差異（替代NorthernBlot)

單個或多個基因地表達(dá)譜分析不同組織、器官不同時期不同處理第48頁,共50頁，2024年2月25日，星期