微生物的代謝調(diào)控與代謝工程-課件

微生物的代謝調(diào)控與代謝工程第一節(jié)微生物代謝的自我調(diào)節(jié)第二節(jié)微生物的代謝調(diào)控第三節(jié)提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法第四節(jié)代謝工程微生物的代謝調(diào)控與代謝工程第一節(jié)微生物代謝的自我調(diào)節(jié)1第一節(jié)微生物代謝的自我調(diào)節(jié)第一節(jié)2精品資料精品資料3你怎么稱呼老師？如果老師最后沒有總結(jié)一節(jié)課的重點的難點，你是否會認為老師的教學(xué)方法需要改進？你所經(jīng)歷的課堂，是講座式還是討論式？教師的教鞭“不怕太陽曬，也不怕那風(fēng)雨狂，只怕先生罵我笨，沒有學(xué)問無顏見爹娘……”“太陽當空照，花兒對我笑，小鳥說早早早……”微生物的代謝調(diào)控與代謝工程-ppt課件4微生物代謝是受到高度調(diào)節(jié)的，如下事實可以說明1）微生物生長在含單一有機化合物為能源的合成培養(yǎng)基中，所有大分子單體（如氨基酸）的合成速率同大分子（如蛋白質(zhì)）的合成速率協(xié)調(diào)一致，不會浪費能量去合成那些他們用不著的東西。2）任何一種單體的合成，如能從外源獲得并能進入細胞內(nèi)，單體的合成自動停止，參與這些單體生成的酶的合成也會停止；3）微生物只有在有某些有機基質(zhì)（如乳糖）存在時，才會合成異化這些基質(zhì)的酶；4）如存在兩種有機基質(zhì)，微生物會先合成那些能異化更易利用的基質(zhì)的酶，待易利用的基質(zhì)耗竭才開始誘導(dǎo)分解較難利用的基質(zhì)的酶；5）養(yǎng)分影響生長速率，從而相應(yīng)改變細胞大分子的組成（如RNA含量）微生物代謝是受到高度調(diào)節(jié)的，如下事實可以說明1）微生物生長在5微生物自我調(diào)節(jié)的部位：1、養(yǎng)分吸收分泌的通道大多數(shù)親水分子難于透過細胞膜，需借助一些負責(zé)運輸?shù)拿赶到y(tǒng)（如透酶）才得以實現(xiàn)；有些是需能的。2、限制基質(zhì)與酶的接近

在真核生物中，各種代謝庫的基質(zhì)分別存在于由胞膜分隔的細胞器內(nèi)，如在鏈孢霉中精氨酸存在于細胞質(zhì)和液泡內(nèi)，這兩處參與精氨酸代謝的酶量有很大的差別。原核生物的控制方式不同，其中有些酶是以多酶復(fù)合物或以細胞膜結(jié)合的方式存在，類似于酶的固定化形式，使它不能自由活動。3、代謝途徑通量的控制微生物控制代謝物流的方法有兩種：

調(diào)節(jié)現(xiàn)有酶的量、改變已有酶分子的活性

微生物自我調(diào)節(jié)的三個部位實際上也就是三個類型，但都涉及到酶促反應(yīng)調(diào)節(jié)。

酶促調(diào)節(jié)的方式包括酶活性調(diào)節(jié)和酶合成調(diào)節(jié)兩大類微生物自我調(diào)節(jié)的部位：1、養(yǎng)分吸收分泌的通道大多數(shù)親水分6原核生物真核生物原核生物真核生物7一、酶活性調(diào)節(jié)酶活性的調(diào)節(jié)方式共價修飾變(別)構(gòu)效應(yīng)締合與解離競爭性抑制

一、酶活性調(diào)節(jié)酶活性的調(diào)節(jié)方式共價修飾81、共價修飾指蛋白質(zhì)分子中的一個或多個氨基酸殘基與一化學(xué)基團共價連接或解開，使其活性改變的作用。化學(xué)基團：從酶蛋白質(zhì)中除去或加入小化學(xué)基團磷酸基、腺苷?；?、甲基、乙基等蛋白質(zhì)的共價結(jié)合部位一般為絲氨酸殘基的-CH2OH共價修飾分可逆和不可逆兩種酶活性調(diào)節(jié)（continued）由共價修飾引起酶活性（有時還涉及調(diào)節(jié)特性）改變的酶叫共價調(diào)節(jié)酶。這是一種快速、靈敏、高效的細調(diào)方式。1、共價修飾指蛋白質(zhì)分子中的一個或多個氨基9有些酶存在活性和非活性兩種狀態(tài)，它們可以通過另一種酶的催化作共價修飾而互相轉(zhuǎn)換。如:糖原磷酸化酶

通過激酶和磷酸酯酶來調(diào)節(jié)活性

磷酸化形式有活性

去磷酸化形式無活性

1）可逆共價修飾有些酶存在活性和非活性兩種狀態(tài)，它們可以通10磷酸化酶E-CH2-OH(無活性)

磷酸化酶E-CH2-O-P(有活性)

H2OPi磷酸酯酶ATPADP磷酸化酶激酶磷酸化酶磷酸化酶H2OPi磷酸酯酶ATPADP磷酸化酶激酶11

12個完全相同亞基(分子量50000)，排成兩層六角環(huán)結(jié)構(gòu);

每個亞基含有催化部位和結(jié)合效應(yīng)物的變構(gòu)部位;

每個亞基的酪氨酸殘基上還能進行可逆的腺苷?；?，完全腺苷?；山Y(jié)合12個AMP;

完全脫腺苷酰形式是活性最高的，完全腺苷?；氖腔钚宰畹偷?

腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(Adenylyltransferase;AT)催化;

AT的特異性是由調(diào)節(jié)蛋白P所控制的，有PA、PD兩種形式；PA與AT的復(fù)合物催化GS的腺苷?；?PD與AT的復(fù)合物則催化脫腺苷酰反應(yīng);

調(diào)節(jié)蛋白P本身又受到鳥苷?；兔擑B苷酰化的可逆共價修飾;又如:大腸桿菌谷氨酰胺合成酶(GS)12個完全相同亞基(分子量50000)，排成兩層六角環(huán)12脫腺苷酰化谷氨酰胺合成酶(GS0)(高活性)腺苷?；劝滨０泛铣擅?GS12)(低活性)ATPPPiAT?PAADPPiAT?PD腺苷酰轉(zhuǎn)移酶-PA腺苷酰轉(zhuǎn)移酶-PD脫腺苷?；佘挣；疉TPPPiAT?PAADPPiAT?PD13酶可逆共價修飾的意義：1）因酶構(gòu)型的轉(zhuǎn)換是由酶催化的，故可在很短的時間內(nèi)經(jīng)信號啟動，觸發(fā)生成大量有活性的酶；2）這種修飾作用可更易控制酶的活性以響應(yīng)代謝環(huán)境的變化。

這一系統(tǒng)具有能隨時響應(yīng)的特性，因而經(jīng)常在活化與鈍化狀態(tài)之間來回變換。

需消耗能量，但只占細胞整個能量消耗的一小部分酶可逆共價修飾的意義：1）因酶構(gòu)型的轉(zhuǎn)換是由酶催化的，故可142）不可逆共價修飾

典型的例子是酶原激活——無活性的酶原被相應(yīng)的蛋白酶作用，切去一小段肽鏈而被激活(胰蛋白酶原的活化靠腸肽酶從其N-端切去一個己肽Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)腸肽酶胰酶原胰酶彈性蛋白酶原的活化彈性蛋白酶原的活化彈性蛋白酶原的活化自身催化

信號放大，胰酶自身催化

酶完成使命后便被降解，關(guān)閉酶活性

酶原變?yōu)槊甘遣豢赡娴?）不可逆共價修飾典型的例子是酶原激活——無活性的酶原被15共價調(diào)節(jié)酶調(diào)節(jié)的特點

（1）作用方式：酶都具有兩種形式即無活性（低活性）和有活性（高活性）。（2）作用本質(zhì)：與別構(gòu)調(diào)節(jié)不同，是酶分子共價鍵發(fā)生了改變，即酶的一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而別構(gòu)酶中酶分子只發(fā)生非共價鍵的改變，即構(gòu)象的改變。（3）作用能耗：所需酶分子比生物合成酶要少，在酶分子發(fā)生磷酸化等修飾作用反應(yīng)中，一般每個亞基只消耗一個分子ATP，比一亞基生物合成所需的ATP少很多。（4）作用效率：共價調(diào)節(jié)酶的調(diào)節(jié)信號具有放大效應(yīng)，其催化效率比別構(gòu)酶調(diào)節(jié)要高很多。共價調(diào)節(jié)酶調(diào)節(jié)的特點（1）作用方式：酶都具有兩種形式即無活162、變構(gòu)控制變構(gòu)或別構(gòu)(allosterism)效應(yīng)是指一種小分子物質(zhì)與一種蛋白質(zhì)分子發(fā)生可逆的相互作用，導(dǎo)致這種蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變這種蛋白質(zhì)與第三種分子的相互作用。

變構(gòu)蛋白是表現(xiàn)變構(gòu)效應(yīng)的蛋白，如阻遏蛋白

具有變構(gòu)作用的酶稱作變構(gòu)酶酶活性調(diào)節(jié)（continued）2、變構(gòu)控制變構(gòu)或別構(gòu)(allosterism)效應(yīng)變構(gòu)17微生物的代謝調(diào)控與代謝工程-ppt課件18天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶ATP激活天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶ATP激活19

大腸桿菌糖代謝中酶的激活劑與抑制劑

酶激活劑抑制劑磷酸果糖激酶ADP、GDPPEP丙酮酸脫氫酶PEP、AMP、GDPNADH、乙酰CoA激活、抑制兩個矛盾的過程；普遍存在于微生物代謝中大腸桿菌糖代謝中酶的激活劑與抑制劑激活20大腸桿菌酵解和TCA循環(huán)中的變構(gòu)控制位點促進抑制大腸桿菌酵解和TCA循環(huán)中的變構(gòu)控制位點促進抑制21變構(gòu)調(diào)節(jié)機制：1）變構(gòu)酶具有一個以上的結(jié)合位點，除了結(jié)合底物的活性中心外，在同一分子內(nèi)還有一些分立的效應(yīng)物結(jié)合位點（副位點）；2）主位點和副位點可同時被占據(jù)；3）副位點可結(jié)合不同的效應(yīng)物，產(chǎn)生不同的效應(yīng)；4）效應(yīng)物在副位點上的結(jié)合可隨后引起蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的變化，從而影響酶活性中心的催化活性；5）變構(gòu)效應(yīng)是反饋控制的理論基礎(chǔ)，是調(diào)節(jié)代謝的有效方法。6）配體和酶蛋白的不同部位（或亞基）結(jié)合時，可在底物——底物，效應(yīng)物——底物和效應(yīng)物——效應(yīng)物之間發(fā)生協(xié)同反應(yīng)，此效應(yīng)可以是促進（正協(xié)同）或阻抑的（負協(xié)同）。變構(gòu)調(diào)節(jié)機制：1）變構(gòu)酶具有一個以上的結(jié)合位點，除了結(jié)合底物22變構(gòu)酶的反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì)

變構(gòu)酶的反應(yīng)動力學(xué)不同于普通酶的，它不符合米氏動力學(xué)方程式。

普通酶反應(yīng)速度和底物濃度的關(guān)系為：V=（Vmax[S]）/（Km+[S]）

變構(gòu)酶反應(yīng)速度和底物濃度的關(guān)系為：V=（Vmax[S]）n/（Km+[S]n）V：酶促反應(yīng)速度，Vmax：最大反應(yīng)速度，S：底物濃度，Km：米氏常數(shù)，n：亞基數(shù)

變構(gòu)酶的反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì)變構(gòu)酶的反應(yīng)動23微生物的代謝調(diào)控與代謝工程-ppt課件24微生物的代謝調(diào)控與代謝工程-ppt課件25

變構(gòu)酶的反應(yīng)速度與底物濃度（或變構(gòu)抑制劑的濃度）的關(guān)系曲線呈S型，有協(xié)同性；當?shù)孜锘蛐?yīng)物濃度極低時，酶反應(yīng)速度的變化極微小，這是因為效應(yīng)物濃度極低時，不具有協(xié)同性，當效應(yīng)物濃度超過某個水平（閾值）時酶反應(yīng)速度急劇增大（減?。＜创嬖谥孜锘蛐?yīng)物對反應(yīng)速度發(fā)生影響的閾值。這在代謝控制上具有很大的生理意義。變構(gòu)酶的反應(yīng)速度與底物濃度（或變構(gòu)抑制劑的26變構(gòu)酶的脫敏作用（desensitingation）變構(gòu)酶經(jīng)特殊處理后，不喪失酶活性而失去了對變構(gòu)效應(yīng)物的敏感性，稱為脫敏作用。

可通過許多方法：加熱處理、0~50℃低溫處理、化學(xué)試劑（汞鹽、對氯汞苯甲酸（PCMB）、尿素等）透析、X射線照射、蛋白酶有限水解、pH的改變等等。變構(gòu)酶的脫敏作用（desensitingation）27（1）使變構(gòu)酶解聚：可利用上述物理、化學(xué)等方法處理變構(gòu)酶，可使變構(gòu)酶多聚物解聚導(dǎo)致對效應(yīng)物脫敏，失去調(diào)節(jié)功能。解聚后的單體不再相互作用，失去協(xié)同性的反應(yīng)速度與底物濃度之間的關(guān)系曲線不再呈S形，而是一般酶那樣的雙曲線。（2）基因突變?yōu)樽儤?gòu)酶編碼的結(jié)構(gòu)基因的突變可引起脫敏，如誘變育種獲得抗類似突變株中多發(fā)生這種變化，在氨基酸的核苷酸發(fā)酵育種上，已作為突破微生物代謝控制的一個重要手段利用。

（1）使變構(gòu)酶解聚：283、締合與解離酶活性調(diào)節(jié)（continued）

能進行這種轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)由多個亞基組成；

蛋白質(zhì)活化與鈍化是通過亞基締合與解離實現(xiàn)的；3、締合與解離酶活性調(diào)節(jié)（continued）能進行這29酶活性調(diào)節(jié)（continued）4、競爭性抑制

一些蛋白質(zhì)的生物活性受代謝物的競爭性抑制

如需要氧化性NAD+的反應(yīng)可能被還原型NADH的競爭抑制；需ATP的反應(yīng)可能受ADP或AMP的競爭型抑制；

有些酶受反應(yīng)過程產(chǎn)物的競爭性抑制酶活性調(diào)節(jié)（continued）4、競爭性抑制一些蛋30二、酶合成的調(diào)節(jié)

凡是能促進酶合成的調(diào)節(jié)稱為誘導(dǎo)；而能阻礙酶合成的調(diào)節(jié)稱為阻遏。

酶合成的調(diào)節(jié)是一種通過調(diào)節(jié)酶的合成量進而調(diào)節(jié)代謝速率的調(diào)節(jié)機制，這是一種在基因水平上（在原核生物中主要在轉(zhuǎn)錄水平上）的代謝調(diào)節(jié)。

同調(diào)節(jié)酶的活性的反饋抑制等相比，通過調(diào)節(jié)酶的合成而實現(xiàn)代謝調(diào)節(jié)的方式是一類較間接而緩慢的調(diào)節(jié)方式；其優(yōu)點是通過阻止酶的過量合成，有利于節(jié)約生物合成的原料和能量。二、酶合成的調(diào)節(jié)凡是能促進酶合成的調(diào)節(jié)稱為誘導(dǎo)；而能阻礙31

一）酶合成調(diào)節(jié)的類型誘導(dǎo)阻遏末端產(chǎn)物阻遏分解代謝產(chǎn)物阻遏類型一）酶合成調(diào)節(jié)的類型誘導(dǎo)末端產(chǎn)物阻遏類型32組成酶不依賴于酶底物或類似物的存在而合成

如葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸過程中的各種酶誘導(dǎo)酶依賴于某種底物或底物的結(jié)構(gòu)類似物的存在而合成

如大腸桿菌乳糖利用酶1、酶合成的誘導(dǎo)（induction）組成酶不依賴于酶底物或類似物的存在而合成誘導(dǎo)酶依賴于某種底33

誘導(dǎo)劑可以是誘導(dǎo)酶的底物，也可是底物的結(jié)構(gòu)類似物

如：乳糖是大腸桿菌-半乳糖苷酶合成的誘導(dǎo)劑，也是此酶的底物[實際上乳糖不是真正的誘導(dǎo)物，它必須先轉(zhuǎn)化為別乳糖才能起誘導(dǎo)劑的作用]

誘導(dǎo)劑也可以不是該酶的作用底物

如異丙基--D-硫代半乳糖苷（IPTG）是-半乳糖苷酶合成的極佳誘導(dǎo)劑，但不是作用底物；

酶的作用底物不一定有誘導(dǎo)作用

如對硝基苯--L-阿拉伯糖苷是-半乳糖苷酶的底物，但不能誘導(dǎo)該酶的合成。誘導(dǎo)劑可以是誘導(dǎo)酶的底物，也可是底物的結(jié)構(gòu)類似物34酶的誘導(dǎo)可分兩種：1）同時誘導(dǎo)

2）順序誘導(dǎo)當誘導(dǎo)物加入后，同時或幾乎同時誘導(dǎo)幾種酶的合成；主要存在于短的代謝途徑中。如將乳糖加入到E.coli培養(yǎng)基后，可同時誘導(dǎo)出-半乳糖苷透性酶、-半乳糖苷酶、半乳糖苷轉(zhuǎn)乙?；?；不管誘導(dǎo)強度如何，這三種蛋白以同一比例合成。

（因為三者的基因組成同一操縱子）先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中間代謝物的酶，以達到對較復(fù)雜代謝途徑的分段調(diào)節(jié)。酶的誘導(dǎo)可分兩種：1）同時誘導(dǎo)2）順序誘導(dǎo)35苯乙醇胺苯乙酮酸苯乙醛苯甲酸順，順-粘康酸-酮己二酸L-犬尿氨酸O-氨基苯甲酸L-色氨酸N-甲酰犬尿氨酸-酮己二酰CoA乙酸+琥珀酸兒茶酚丙氨酸甲酸假單孢菌芳香氨基酸降解酶類的順序誘導(dǎo)苯乙醇胺苯乙酮酸苯乙醛苯甲酸順，順-粘康酸-酮己二酸L-犬362、酶合成的阻遏(repression)末端產(chǎn)物阻遏(end-productrepression)分解代謝物阻遏(cataboliterepression)2、酶合成的阻遏(repression)末端產(chǎn)物阻遏(en37

指由某代謝途徑末端產(chǎn)物過量積累而引起的阻遏。末端產(chǎn)物阻遏(end-productrepression)

對直線式途徑來說，末端產(chǎn)物阻遏的情況較簡單，即產(chǎn)物作用于代謝途徑中的各種關(guān)鍵酶，使之合成受阻；對于分支代謝途徑而言，情況較復(fù)雜，每種末端產(chǎn)物僅專一地阻遏合成它的那條分支途徑的酶。代謝途徑分支點以前的“公共酶”僅受所有分支途徑末端產(chǎn)物的阻遏（多價阻遏作用）。

末端產(chǎn)物阻遏在代謝調(diào)節(jié)中有重要作用，保證細胞內(nèi)各種物質(zhì)維持適當?shù)臐舛?；普遍存在于氨基酸核苷酸生物合成途徑中。指由某代謝途徑末端產(chǎn)物過量積累而引起的阻遏。末端產(chǎn)物阻遏38分解代謝物阻遏(cataboliterepression)——是指兩種碳源（或氮源）分解底物同時存在時，細胞利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關(guān)分解酶合成的現(xiàn)象。or——當培養(yǎng)基中同時存在有多種可供利用的底物時，某些酶的合成往往被容易利用的底物所阻遏，這就是分解代謝阻遏。分解代謝物阻遏(cataboliterepression39

最典型的例子是細胞通過最易利用的碳源（如葡萄糖）的分解產(chǎn)物來抑制一些酶的合成。

這個現(xiàn)象最早在青霉素的生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，可快速利用的葡萄糖致使青霉素產(chǎn)量特別低，而緩慢利用的乳糖卻能較好地生產(chǎn)青霉素。

進一步的研究表明，乳糖并不是青霉素合成的特殊前體，它的價值僅在于緩慢利用。被快速利用的葡萄糖的分解產(chǎn)物阻遏了青霉素合成酶的合成。最典型的例子是細胞通過最易利用的碳源（如葡萄糖）的分解產(chǎn)40把大腸桿菌培養(yǎng)在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中，可明顯看到大腸桿菌經(jīng)歷了兩個對數(shù)期。葡萄糖在第一個周期中被利用。在葡萄糖代謝初期，-半乳糖苷酶和半乳糖苷透性酶的合成受阻遏，使乳糖不被利用。葡萄糖被消耗完后，乳糖代謝所需的酶開始合成，于是出現(xiàn)了利用乳糖的第二個生長周期。把大腸桿菌培養(yǎng)在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中，可明顯看到大腸桿41

阻遏作用并非快速利用的碳源（或氮源）本身作用的結(jié)果；而是其分解代謝過程中所產(chǎn)生的中間代謝物引起；

這種抑制青霉素合成及乳糖利用的現(xiàn)象，起初認為只有葡萄糖才會產(chǎn)生，故稱為葡萄糖效應(yīng)。

所有可以迅速利用或代謝的能源，都能阻遏異化另一種被緩慢利用能源所需酶的合成

分解代謝阻遏涉及到的是一些誘導(dǎo)酶阻遏作用并非快速利用的碳源（或氮源）本身作用的結(jié)果；而42

二）酶合成調(diào)節(jié)的分子機制目前認為，由Monod和Jacob提出的操縱子假說能較好地解釋酶合成的誘導(dǎo)和阻遏操縱子(operon)啟動基因(promoter)操縱基因(operator)結(jié)構(gòu)基因(structuralgene)RNA聚合酶結(jié)合部位操縱基因位于啟動基因和結(jié)構(gòu)基因之間，能與阻遏物（一種調(diào)節(jié)蛋白）相結(jié)合，以此來決定結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄能否進行結(jié)構(gòu)基因為一組功能相關(guān)的基因誘導(dǎo)型操縱子（inducibleoperon）阻遏型操縱子（repressibleoperon）只有當存在誘導(dǎo)物時其轉(zhuǎn)錄水平才最高,并隨之轉(zhuǎn)譯出誘導(dǎo)酶

負責(zé)基質(zhì)分解

如乳糖操縱子只有當缺乏輔阻遏物時其轉(zhuǎn)錄頻率才最高，即只有通過去阻遏作用才能啟動所編碼酶的合成

負責(zé)某些物質(zhì)合成

色氨酸操縱子二）酶合成調(diào)節(jié)的分子機制目前認為，由Monod和Jac43調(diào)節(jié)基因(regulatorgene)

一般位于相應(yīng)操縱子的附近，也可遠離操縱子;編碼組成型調(diào)節(jié)蛋白

調(diào)節(jié)蛋白(regulatoryprotein)是一類變構(gòu)蛋白，有兩個特殊位點，其一可與操縱基因結(jié)合，另一位點可與效應(yīng)物結(jié)合。能在沒有誘導(dǎo)物時與操縱基因結(jié)合只能在輔阻遏物存在時才能與操縱基因結(jié)合阻遏物(repressor):阻遏物蛋白（aporepressor）調(diào)節(jié)蛋白(可分兩種)調(diào)節(jié)基因(regulatorgene)一般位于相應(yīng)操縱44效應(yīng)物(effector)——指一類低分子質(zhì)量的信號物質(zhì)（如糖類及其衍生物、氨基酸、核苷酸等）。誘導(dǎo)物(inducer)輔阻遏物(corepressor)效應(yīng)物(effector)——指一類低分子質(zhì)量的信號物質(zhì)（如45酶的誘導(dǎo)機制：(以E.coli乳糖操縱子為例)

E.coli乳糖操縱子由lac啟動基因(lacP)、lac操縱基因(lacO)和三個結(jié)構(gòu)基因(lacZ、Y、A)所組成，三個結(jié)構(gòu)基因分別編碼-半乳糖苷酶、透過酶和轉(zhuǎn)乙酰酶。

乳糖操縱子是負調(diào)節(jié)的代表，在缺乏乳糖等誘導(dǎo)物時，由調(diào)節(jié)基因(lacI)編碼的調(diào)節(jié)蛋白（即lac阻遏物）一直結(jié)合在操縱基因上，抑制著結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的進行。

當有誘導(dǎo)物如乳糖存在時，乳糖與lac阻遏物相結(jié)合，使后者發(fā)生構(gòu)象變化，結(jié)果降低了lac阻遏物與操縱基因間的親和力，使它不能繼續(xù)結(jié)合在操縱子上，操縱子的“開關(guān)”被打開，結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯可順利進行。

當誘導(dǎo)物耗盡后，lac阻遏物可再次與操縱基因結(jié)合，這時轉(zhuǎn)錄的“開關(guān)”又被關(guān)閉，酶就無法合成，同時，細胞內(nèi)已轉(zhuǎn)錄好的mRNA也迅速地被限制性內(nèi)切酶所水解，所以細胞內(nèi)酶的合成速度急劇下降。酶的誘導(dǎo)機制：(以E.coli乳糖操縱子為例)E.c46lacIPlacZlacYlacA調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因控制部分轉(zhuǎn)錄mRNA-半乳糖苷酶透過酶轉(zhuǎn)乙?；咐萌樘巧L阻遏蛋白RNA聚合酶O誘導(dǎo)物無活性乳糖操縱子(lacoperon)——酶的誘導(dǎo)機制lacIPlacZlacYlacA調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因控制部分轉(zhuǎn)47無乳糖

關(guān)有乳糖開無乳糖關(guān)有乳糖開48末端產(chǎn)物(反饋)阻遏機制:(以色氨酸操縱子為例)

色氨酸操縱子的阻遏是對合成代謝酶類進行正調(diào)節(jié)的典例

E.coli色氨酸操縱子也由啟動基因、操縱基因和結(jié)構(gòu)基因（5個）三部分組成。5個結(jié)構(gòu)基因分別編碼色氨酸合成途徑中的5種酶。

調(diào)節(jié)基因(trpR)遠離操縱基因，編碼阻遏物蛋白；其為由4個亞基組成的四聚體；單獨的四聚體不能和操縱基因(trpO)結(jié)合，只有先結(jié)合了色氨酸分子后改變了四聚體的分子構(gòu)象才能與trpO結(jié)合。

當細胞內(nèi)色氨酸濃度高時，色氨酸與阻遏物蛋白結(jié)合，形成完全阻遏物，與操縱基因結(jié)合，阻止結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄（色氨酸為輔阻遏物）。

當細胞內(nèi)色氨酸缺乏或不足時，則導(dǎo)致阻遏物脫離操縱基因，使操縱基因“開關(guān)”打開，結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄又可正常進行。末端產(chǎn)物(反饋)阻遏機制:(以色氨酸操縱子為例)49trpROtrpLatttrpEtrpDtrpCtrpBtrpAP鄰氨基苯甲酸合成酶-亞基鄰氨基苯甲酸合成酶

-亞基吲哚甘油磷酸合成酶Trp合成酶-亞基Trp合成酶-亞基分支酸鄰氨基苯甲酸磷酸核糖基鄰氨基苯甲酸吲哚甘油磷酸色氨酸羧苯氨基脫氨核糖磷酸t(yī)rpROtrpLatttrpEtrpDtrpCtrpBt50trpROtrpLatttrpEtrpDtrpCtrpBtrpAP阻遏物蛋白（無活性）阻遏物阻遏物（有活性）RNA聚合酶結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄翻譯色氨酸合成色氨酸轉(zhuǎn)錄將重新開始trpROtrpLatttrpEtrpDtrpCtrpBt51分解代謝阻遏機制:

(以葡萄糖分解代謝物對乳糖分解酶的阻遏為例)

E.coli含有一個代謝產(chǎn)物活化蛋白CAP(cataboliteactivatedprotein)，也稱cAMP受體蛋白CRP；CAP和cAMP都是lacmRNA合成所必需的。

CAP能與cAMP形成復(fù)合物，cAMP-CAP復(fù)合物結(jié)合在lac操縱子的啟動基因上，可促進轉(zhuǎn)錄的進行，實現(xiàn)正調(diào)節(jié)。

葡萄糖分解代謝的中間代謝物能抑制腺苷酰環(huán)化酶活性并活化磷酸二酯酶，從而降低cAMP濃度，此時CAP不能被活化形成cAMP-CAP復(fù)合物，從而抑制了lac的轉(zhuǎn)錄。雙重調(diào)控分解代謝阻遏機制:E.coli含有一個代謝產(chǎn)物活化52lacIPlacZlacYlacA調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因控制部分阻遏蛋白RNA聚合酶O誘導(dǎo)物乳糖操縱子(lacoperon)——分解代謝阻遏CAPcAMP-CAP復(fù)合物cAMP腺苷酰環(huán)化酶磷酸二酯酶葡萄糖分解轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄lacIPlacZlacYlacA調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因控制部分阻53微生物的代謝調(diào)控與代謝工程-ppt課件54無乳糖關(guān)有乳糖開？無葡萄糖有乳糖開無乳糖關(guān)有乳糖開？無葡萄糖開55RNA水平的調(diào)節(jié)機制:弱化子的弱化調(diào)節(jié)

Yanofsky1973年研究大腸桿菌色氨酸合成時發(fā)現(xiàn)；當細胞內(nèi)有色氨酸存在時，可使轉(zhuǎn)錄過程在未到終點之前，便有80%-90%的轉(zhuǎn)錄停止。這種調(diào)節(jié)方式不是使正在轉(zhuǎn)錄的過程全部在中途停止，故稱弱化作用(attenuation)

弱化調(diào)節(jié)是通過操縱子的引導(dǎo)區(qū)內(nèi)類似于終止子結(jié)構(gòu)的一段DNA序列實現(xiàn)的，這段序列稱為弱化子或衰減子(attenuator)。

當細胞內(nèi)某種氨基酰-tRNA缺乏時，該弱化子不表現(xiàn)為終止子功能；當細胞內(nèi)某種氨基酰-tRNA充足時，弱化子表現(xiàn)為終止子功能，但這種終止作用并不使所有正在轉(zhuǎn)錄中的mRNA全部都中途停止，而只是部分中途停止轉(zhuǎn)錄。RNA水平的調(diào)節(jié)機制:弱化子的弱化調(diào)節(jié)Yanofsk56

弱化調(diào)節(jié)方式是在mRNA水平上起作用的；

較為廣泛地存在于氨基酸合成操縱子調(diào)節(jié)中，是細菌輔助阻遏作用的一種精細調(diào)控；

mRNA含有一引導(dǎo)區(qū)（在第一個結(jié)構(gòu)基因的上游），顯示出一種不平常的氨基酸密碼子的堆積。

如:色氨酸操縱子兩個Trp密碼子相鄰地位于引導(dǎo)區(qū)弱化調(diào)節(jié)方式是在mRNA水平上起作用的；57trpROtrpLatttrpEtrpDtrpCtrpBtrpAP？組氨酸操縱子弱化子中存在7個組氨酸密碼子；苯丙氨酸操縱子弱化子中存在7個苯丙氨酸密碼子trpROtrpLatttrpEtrpDtrpCtrpBt58游離mRNA中1與2，3與4配對游離mRNA中59色氨酸充足時細胞具有大量攜帶Trp的tRNA，便會迅速形成引導(dǎo)肽。在trpmRNA上工作的核糖體復(fù)合物與合成trpmRNA的RNA聚合酶同步運行。由此，第一個可能的mRNA次級結(jié)構(gòu)，干環(huán)(stemloop)構(gòu)型形成一種中止環(huán)（1：2），加上一終止環(huán)（3：4）；出現(xiàn)這種情況，則RNA聚合酶復(fù)合物十有八九會停止在終止環(huán)上并解離，隨后結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄便被終止。色氨酸充足時60缺少色氨酸時則因為缺少tRNAtrp，trp引導(dǎo)區(qū)的轉(zhuǎn)譯被停止，核糖體便停頓在Trp密碼子上，并阻止中止環(huán)的形成。其結(jié)果形成一種抗終止區(qū)環(huán)（2：3），從而抑制終止區(qū)環(huán)的形成。因此RNA聚合酶并未停止，繼續(xù)轉(zhuǎn)錄trp基因缺少色氨酸時61游離mRNA中1與2，3與4配對低濃度色氨酸使核糖體停留在1部位，轉(zhuǎn)錄得以完成高濃度色氨酸使核糖體到達2部位，3與4配對，轉(zhuǎn)錄終止游離mRNA中低濃度色氨酸高濃度色氨酸62微生物的代謝調(diào)控與代謝工程-ppt課件63色氨酸合成代謝調(diào)節(jié)中存在反饋抑制反饋阻遏弱化調(diào)節(jié)微生物代謝調(diào)節(jié)的復(fù)雜性色氨酸合成代謝調(diào)節(jié)中存在64trpoperon阻遏系統(tǒng)——終產(chǎn)物的阻遏機制

反饋阻遏在分子水平上的作用機制

trpoperon阻遏系統(tǒng)——終產(chǎn)物的阻遏機制反饋阻遏在65二元調(diào)節(jié)系統(tǒng)含有兩種蛋白：傳感器（或發(fā)射器）跨膜蛋白調(diào)節(jié)器（或接受器）可溶性蛋白近年來越來越多的二元調(diào)節(jié)系統(tǒng)在原核微生物中被發(fā)現(xiàn)二元調(diào)節(jié)系統(tǒng)含有兩種蛋白：傳感器（或發(fā)射器）跨膜蛋白66

傳感器起蛋白激酶作用，能催化需ATP的自動磷酸化作用和將磷酸基轉(zhuǎn)移給其他蛋白（如調(diào)節(jié)蛋白）的作用。

若受外界或內(nèi)部刺激（如滲透壓、化學(xué)吸引劑、特殊分子的存在或缺乏），傳感器分子便自動磷酸化，從而把刺激轉(zhuǎn)換成生化信號（傳感器分子的磷酸化狀態(tài)）。此信號可通過磷酸基的轉(zhuǎn)移將信號傳給可溶性調(diào)節(jié)蛋白。

磷酸化調(diào)節(jié)器可作為轉(zhuǎn)錄的激活劑或阻遏物，再與DNA序列相互作用。

此二元系統(tǒng)是微生物中的信號傳導(dǎo)模型，參與硫酸鹽和氮代謝的調(diào)節(jié)。傳感器起蛋白激酶作用，能催化需ATP的自動磷酸化作用和將67A：傳感器，跨膜蛋白B：調(diào)節(jié)器，可溶性蛋白傳感器借磷酸化把刺激作用轉(zhuǎn)換成一種信號；磷酸基可轉(zhuǎn)移到調(diào)節(jié)器上，再起某一基因的阻遏物或激活劑的作用。A：傳感器，跨膜蛋白B：調(diào)節(jié)器，可溶性蛋白68二組分調(diào)控系統(tǒng)二組分調(diào)控系統(tǒng)69三、分支生物合成途徑的調(diào)節(jié)1、同工酶（isoenzyme）調(diào)節(jié)某一分支途徑中的第一步反應(yīng)可由多種酶催化，但這些酶受不同的終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié).(酶的分子結(jié)構(gòu)不同)如：大腸桿菌的天門冬氨酸族氨基酸的合成途徑中，有三個同工酶：天門冬氨酸激酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，分別受賴氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸的反饋調(diào)節(jié)三、分支生物合成途徑的調(diào)節(jié)1、同工酶（isoenzyme）調(diào)702、協(xié)同反饋調(diào)節(jié)(concertedfeedbackregulation)需有一種以上終產(chǎn)物的過量存在方有明顯的效果單個終產(chǎn)物過量，不產(chǎn)生或只產(chǎn)生很小的影響ABCDEFG2、協(xié)同反饋調(diào)節(jié)(concertedfeedbackre713、累加反饋調(diào)節(jié)(cumulativefeedbackregulation)每一種末端產(chǎn)物過量只能部分抑制或阻遏，總的效果是累加的BACDEFG30%40%58%3、累加反饋調(diào)節(jié)(cumulativefeedback724、增效反饋調(diào)節(jié)(cooperativefeedbackregulation)代謝途徑中任一末端產(chǎn)物過量時，僅部分抑制共同反應(yīng)中第一個酶的活性，但兩個末端產(chǎn)物同時過量時，其抑制作用可超過各末端產(chǎn)物產(chǎn)生的抑制作用的總和。BACDEFG15%20%90%4、增效反饋調(diào)節(jié)(cooperativefeedback735、順序反饋調(diào)節(jié)(sequentialfeedbackregulation)

分支途徑中幾個末端產(chǎn)物抑制分支點后面第一個酶，使分支點產(chǎn)物積累，結(jié)果分支點產(chǎn)物又反饋抑制共同途徑中的第一個酶，最后使整個代謝途徑停止。5、順序反饋調(diào)節(jié)(sequentialfeedback746、聯(lián)合激活或抑制調(diào)節(jié)由一種生物合成的中間產(chǎn)物參與兩個完全獨立的、不交叉的合成途徑的控制。這種中間體物質(zhì)濃度的變化會影響這兩個獨立代謝途徑的代謝速率。6、聯(lián)合激活或抑制調(diào)節(jié)由一種生物合成的中間產(chǎn)物參與75腸細菌氨甲酰磷酸合成酶的聯(lián)合激活和抑制

腸細菌中精氨酸和嘧啶核苷酸的合成途徑是完全獨立的，但它們有一共同的中間體——氨甲酰磷酸。

負責(zé)合成該中間體的酶——氨甲酰磷酸合成酶可以被嘧啶代謝途徑的代謝物UMP反饋抑制，也可被精氨酸合成途徑中的中間體鳥氨酸激活。氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸腸細菌氨甲酰磷酸合成酶的聯(lián)合激活和抑制腸細菌中精氨酸和嘧啶76四、能荷調(diào)節(jié)能荷（energycharge）——指細胞中ATP、ADP、AMP系統(tǒng)中可為代謝反應(yīng)供能的高能磷酸鍵的量度。能荷調(diào)節(jié)——指細胞通過改變ATP、ADP、AMP三者比例來調(diào)節(jié)其代謝活動，也稱腺苷酸調(diào)節(jié)。四、能荷調(diào)節(jié)能荷（energycharge）——指細胞中A77

E.coli生長期間，能荷為0.8，靜止期為0.5，低于0.5時死亡；

Asp.niger檸檬酸生產(chǎn)菌，生長期能荷為0.85，而產(chǎn)酸期為0.8。

在某種意義上，可把ATP當作糖代謝的末端產(chǎn)物。當ATP過量時會對合成ATP系統(tǒng)產(chǎn)生反饋抑制。當ATP分解為ADP、AMP、Pi時。將其能量供給合成反應(yīng)時，ATP生物合成的反饋調(diào)節(jié)被解除，ATP又得以合成。因此，能量不僅調(diào)節(jié)生成ATP的分解代謝酶類的活性，也能調(diào)節(jié)利用ATP的生物合成酶類的活性。糖代謝和中心代謝途徑中的酶活性受能荷的調(diào)節(jié)。E.coli生長期間，能荷為0.8，78微生物的代謝調(diào)控與代謝工程-ppt課件79

當能荷降低時：則激活催化糖分解，（能量生成）酶系，或解除ATP對這些酶的抑制（如糖原磷酸化酶、果糖磷酸激酶、檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶、反丁烯二酸酶等）并抑制糖原合成酶，1、6磷酸果糖酯酶，從而加速糖分解和TCA的產(chǎn)能代謝。當能荷生高時：細胞中AMP，ADP轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP，這時ATP則抑制糖原降解以及糖酵解和TCA環(huán)中的關(guān)鍵酶（如糖原磷酸化酶，磷酸果糖激酶，檸檬酸合成酶，異檸檬酸脫氫酶）并激活糖類合成酶（糖原合成酶、1、6-P-果糖酯酶）從而抑制糖的分解，加速糖原的合成。當能荷降低時：則激活催化糖分解，（能量80能荷不僅調(diào)節(jié)形成ATP的分解代謝酶類（如磷酸果糖激酶、異檸檬酸脫氫酶、檸檬酸合成酶等）的活性，也調(diào)節(jié)利用ATP的生物合成酶類（如檸檬酸裂解酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶等）的活性。R代表ATP合成的酶系統(tǒng)U代表ATP消耗的酶系統(tǒng)

能荷不僅調(diào)節(jié)形成ATP的分解代謝酶類（如磷酸果糖81第二節(jié)微生物的代謝調(diào)控第二節(jié)82

但是，在工業(yè)生產(chǎn)中卻往往需要單一地積累某種產(chǎn)品，這些產(chǎn)品的量又經(jīng)常是大大地超出了細胞正常生長和代謝所需的范圍。

因此，要達到過量積累某種產(chǎn)品的目的，提高生產(chǎn)效率，就必須使原有的調(diào)節(jié)系統(tǒng)失去控制，在保證微生物適當生存的條件下，建立起新的代謝方式，使微生物的代謝產(chǎn)物按照人們的意志積累。

代謝反應(yīng)的協(xié)調(diào)是通過細胞自身的代謝調(diào)控系統(tǒng)對細胞機能實行精細控制來達到的。

對于生命過程來說，代謝反應(yīng)的協(xié)調(diào)是必要的；但是，在工業(yè)生產(chǎn)中卻往往需要單一地積累某種產(chǎn)品，這些產(chǎn)83一、克服反饋抑制和反饋阻遏的調(diào)控反饋調(diào)節(jié)反饋抑制反饋阻遏克服反饋調(diào)節(jié)，可從以下兩方面著手：

降低末端產(chǎn)物濃度應(yīng)用抗反饋突變株一、克服反饋抑制和反饋阻遏的調(diào)控反饋調(diào)節(jié)反饋抑制克服反饋調(diào)節(jié)841、降低末端產(chǎn)物濃度1）營養(yǎng)缺陷型的利用

營養(yǎng)缺陷型是指原菌株因基因突變致使合成途徑中斷，喪失了合成某種必須物質(zhì)的能力，而必須在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)物質(zhì)才能正常生長的突變菌株。

營養(yǎng)缺陷型突變株的代謝流受阻，末端產(chǎn)物減少，解除了末端產(chǎn)物參與的反饋調(diào)節(jié)，可使代謝途徑中的某一中間產(chǎn)物積累。1、降低末端產(chǎn)物濃度1）營養(yǎng)缺陷型的利用營養(yǎng)缺陷型85利用營養(yǎng)缺陷型積累直鏈代謝途徑中間代謝產(chǎn)物利用營養(yǎng)缺陷型積累86ABCDEEaEbEcEd

若要積累C，首先要獲得缺失酶c的營養(yǎng)缺陷型。

酶c缺失后，物質(zhì)C便不再轉(zhuǎn)變成物質(zhì)D，不再合成物質(zhì)E。

由于這種突變體已不能合成末端產(chǎn)物E，所以就解除了E對酶a和酶b的反饋調(diào)節(jié)。反饋抑制反饋阻遏Ec缺陷CABCDEEaEbEcEd若要積累C，首先要獲得缺失酶c87但是，完全不能合成產(chǎn)物E的突變體，因為不能利用E去進一步合成必須的細胞物質(zhì)，所以無法正常生長。為了保證突變體的正常生長，培養(yǎng)時須提供低濃度的、不足以引起反饋調(diào)節(jié)的物質(zhì)E。這樣高濃度的中間產(chǎn)物C就能積累起來了。例如：利用枯草桿菌的精氨酸缺陷型生產(chǎn)瓜氨酸，利用大腸桿菌的賴氨酸缺陷型生產(chǎn)蘇氨酸，都是這個道理。但是，完全不能合成產(chǎn)物E的突變體，因為不能利用E去進88利用營養(yǎng)缺陷型積累分支代謝途徑中的中間產(chǎn)物利用營養(yǎng)缺陷型積累89ABCDEFGHIJMNKL末端產(chǎn)物L(fēng)和N共同對酶a施以反饋;此外，L抑制酶J1，N抑制酶J2J1J2選用缺失酶J1的突變株，則L的合成受阻。L和N共同對酶a的反饋被解除。又由于酶J2還受到N的調(diào)節(jié)，只有少量的J能轉(zhuǎn)變成N，于是中間產(chǎn)物J大量積累。J1缺陷J

ABCDEFGHIJMNKL末端產(chǎn)物L(fēng)和N共同對酶a施以反饋90谷氨酸棒桿菌的IMP合成途徑和代謝調(diào)節(jié)工業(yè)上用谷氨酸棒桿菌的腺苷酸缺陷型生產(chǎn)肌苷酸（IMP）即是此例的應(yīng)用。谷氨酸棒桿菌的IMP合成途徑和代謝調(diào)節(jié)工業(yè)上用谷氨酸棒桿菌的91在分支途徑中，如果減少某一末端產(chǎn)物的濃度，常?？梢苑e累另一末端產(chǎn)物。利用營養(yǎng)缺陷型積累分支代謝途徑末端產(chǎn)物工業(yè)上應(yīng)用的重要例子是賴氨酸發(fā)酵在分支途徑中，如果減少某一末端產(chǎn)物的濃度，常?？梢苑e累另一末92C.glutamicum的代謝調(diào)節(jié)與賴氨酸生產(chǎn)◆天冬氨酸半醛生成高絲氨酸的途徑受阻之后，蘇氨酸的生成減少?！籼K氨酸與賴氨酸合作進行的反饋抑制便被打破，于是賴氨酸能夠大量積累。C.glutamicum的代謝調(diào)節(jié)與賴氨酸生產(chǎn)◆天冬93

降低末端產(chǎn)物濃度(continued)2）滲漏缺陷型的利用滲漏缺陷型——是一種特殊的營養(yǎng)缺陷型，是遺傳性代謝障礙不完全的突變型。其特點是酶活力下降而不完全喪失，并能在基本培養(yǎng)基上少量生長。

不會產(chǎn)生過量的末端產(chǎn)物，因而可以避開反饋調(diào)節(jié)，但它又能合成微量的末端產(chǎn)物，用來進行生物合成；在培養(yǎng)這種突變體時，可不必在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的物質(zhì)，就能積累所需的產(chǎn)物。降低末端產(chǎn)物濃度(continued)2）滲漏缺陷型的94滲漏缺陷型的獲得方法：把大量營養(yǎng)缺陷型菌株接種在基本培養(yǎng)基平板上，挑選生長特別慢而菌落小的即可。應(yīng)用實例:利用滲漏型育成天門冬氨轉(zhuǎn)甲酰酶活力提高500倍的菌株該菌株為尿嘧啶滲漏缺陷型，當培養(yǎng)基中少量的尿嘧啶消耗后，為尿嘧啶所反饋抑制的天門冬氨轉(zhuǎn)甲酰酶活力增加500倍滲漏缺陷型的獲得方法：應(yīng)用實例:953）提高細胞滲透性

細胞內(nèi)合成的發(fā)酵產(chǎn)物若要分泌到培養(yǎng)基中，必須經(jīng)過細胞膜和細胞壁。如果產(chǎn)物不易分泌出細胞，而積累在細胞內(nèi)，則會引起反饋調(diào)節(jié)。

改變細胞膜和細胞壁的通透性，使其有利于產(chǎn)物的分泌，也是降低末端產(chǎn)物濃度的一種途徑。

降低末端產(chǎn)物濃度(continued)3）提高細胞滲透性細胞內(nèi)合成的發(fā)酵產(chǎn)物若要分泌到培養(yǎng)基中96

谷氨酸生產(chǎn)菌的細胞膜磷脂含量高時，細胞的通透性較差，磷脂含量低時，通透性較好。

通常在培養(yǎng)基中添加一些控制因素，以達到影響細胞膜磷脂含量的目的。如可使用青霉素來使細胞壁的完整合成受阻。

細胞壁和細胞膜的通透性增大后，產(chǎn)物易于泄出，于是就降低了谷氨酸在細胞內(nèi)的積累。谷氨酸生產(chǎn)菌的細胞膜磷脂含量高時，細胞的通透性較差，磷97氨基酸的分泌

對于微生物細胞的氨基酸的分泌機制尚不夠清楚，一般認為，無論哪種微生物細胞內(nèi)氨基酸庫中最多的谷氨酸（G-細菌細胞未發(fā)現(xiàn)有游離的氨基酸），因此正常培養(yǎng)下，微生物有少量氨基酸（尤其是Glu，Asp）的分泌，在霉菌和細菌培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)有1mg/mL左右。微生物在增殖旺盛期，由于蛋白質(zhì)大量合成，細胞內(nèi)庫存氨基酸減少，這時游離的谷氨酸大約只有最大量的二分之一，只有當細胞內(nèi)生物合成的氨基酸不被用于合成蛋白質(zhì)或其它代謝系統(tǒng)時，使庫存量提高，才容易作為排出物向細胞外分泌。

氨基酸的分泌對于微生物細胞的氨基酸的分泌機制尚98

與氨基酸吸收的情況一樣，氨基酸分泌機制因菌種及氨基酸種類而異。其中谷氨酸產(chǎn)生菌的谷氨酸分泌進行了大量研究，其機制概括如下：1.當谷氨酸產(chǎn)生菌增殖時，細胞壁膜擴增和形成間體時，細胞伸長2倍長度時，再加上缺乏生物素等條件影響，停止谷氨酸產(chǎn)生菌分裂，谷氨酸用于合成蛋白質(zhì)或其它代謝系統(tǒng)停止，細胞內(nèi)谷氨酸庫大量增加，再加上谷氨酸產(chǎn)生菌不發(fā)生自溶，細胞仍有活力，將葡萄糖通過其生物合成途徑，源源不斷地生物合成谷氨酸，為從細胞內(nèi)——細胞外分泌谷氨酸提供必要的充分條件。2.通過控制生物素、油酸、甘油的亞適量或表面活性劑等，使谷氨酸產(chǎn)生菌的細胞合成不完全，使其磷脂含量降低為正常細胞的二分之一左右，或通過添加青霉素等破壞細胞壁合成，從而導(dǎo)致細胞膜的滲漏，使谷氨酸大量向細胞外分泌，排出的谷氨酸可達總游離氨基酸的92%左右。與氨基酸吸收的情況一樣，氨基酸分泌機制因菌種及氨基99微生物的代謝調(diào)控與代謝工程-ppt課件100核苷酸分泌

核苷酸是不易分泌出細胞外的，實驗證明Mn2+對產(chǎn)氨短桿菌核苷酸分泌起關(guān)鍵作用。Mn2+可引起細胞形態(tài)的變化，在IMP(腺苷酸）發(fā)酵中，控制Mn2+（限量）造成細胞膨脹的不規(guī)則形態(tài)，膜產(chǎn)生異常，非常專一性的膜透性被破壞，核苷酸生物合成補救途徑酶系[PRPP激酶、Hx（次黃嘌呤）焦磷酸化酶]及Hx和R5-P都分泌于體外，在體外大量生物合成IMP。但當Mn2+過量時，菌體呈小球狀，抑制了這些物質(zhì)的分泌。

IMP和XMP都是糖磷酸酯，僅在嘌呤殘基2值上有無羥基之別。產(chǎn)氨短桿菌在Mn2+過量下生長，IMP完全沒有分泌，但XMP分泌性卻很好。Mn2+限量時，細胞脂肪酸含量提高，該機制尚未清楚，最近也有報導(dǎo)抗生素、表面活性劑等物質(zhì)可調(diào)節(jié)膜的核苷酸分泌。

核苷酸分泌核苷酸是不易分泌出細胞外的，實驗證明101微生物的代謝調(diào)控與代謝工程-ppt課件102蛋白質(zhì)（酶）的分泌

不論是原核還是真核生物，在細胞質(zhì)內(nèi)合成的蛋白質(zhì)需定位于細胞的特定區(qū)域或者分泌出胞外。也就是說，基因表達不僅是把DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，RNA翻譯為蛋白質(zhì)，還要實現(xiàn)把合成的蛋白質(zhì)精確地輸送或分泌到位。這是近年來分子生物學(xué)研究的一個十分活躍的領(lǐng)域。因為這不僅是一種基因表達調(diào)控的理論，而且與生物工程工業(yè)化生產(chǎn)有關(guān)，也就是說不僅要解決基因高效表達，還要解決其產(chǎn)物分泌；這是當前基因工程、生物工程急需解決的問題。蛋白質(zhì)（酶）的分泌不論是原核還是真核生物，103微生物的代謝調(diào)控與代謝工程-ppt課件1041、信號順序被翻譯為信號肽，信號肽一旦出現(xiàn)就會引導(dǎo)核糖體到膜上。2、信號肽在膜上可識別一個或多個受體蛋白，通過氨基酸末端的堿性區(qū)與膜帶負電荷的內(nèi)面受體蛋白結(jié)合。3、當新生肽正在跨越膜時，信號序列和其后的肽段折成兩個短的螺旋酶，并曲成一個反向平行的螺旋發(fā)夾，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)可插入到疏水的脂質(zhì)雙層中。4、蛋白質(zhì)翻譯時信號序列的疏水核心不斷插入膜中，直至切點露出膜外側(cè)為止，于是在膜中形成一個孔眼或隧道，一旦分泌蛋白的N端酶在膜內(nèi)，后續(xù)合成的其它肽段部分將順利利用膜中形成孔眼或通道順利邁過膜。1、信號順序被翻譯為信號肽，信號肽一旦出現(xiàn)就會引導(dǎo)核糖體到膜1055、新生肽鏈通過此孔眼被輸出，當?shù)鞍踪|(zhì)部分或全部被輸出后，信號肽就被一種特異蛋白酶（即信號肽酶）切割，該酶的切點是在信號肽和分泌蛋白之間。6、轉(zhuǎn)運完成時，受體蛋白即自由擴散入膜平面。

由此可見，疏水的信號肽對新生肽鏈跨越膜及固定在膜上，是起一個拐棍作用。沒有信號肽及其穿膜轉(zhuǎn)化，蛋白質(zhì)就只能在膜內(nèi)不能向外分泌。這種蛋白質(zhì)分泌是在翻譯的同時被輸出的，稱翻譯同步分泌，還有翻譯后分泌，即蛋白質(zhì)在合成后才穿過膜，但也沒通過信號肽的作用。5、新生肽鏈通過此孔眼被輸出，當?shù)鞍踪|(zhì)部分或全部被輸出后，信106

分泌的啟動和抑制的調(diào)控，目前只知與一種稱為信號識別顆粒(Signalrecogentionparticle簡稱SRP)有關(guān)。其作用是能與核糖體結(jié)合，并停止蛋白質(zhì)合成，它阻止翻譯發(fā)生在肽鏈延長至約70氨基酸殘基長度時，這個長度正好是信號肽完成從核糖體出來時的長度（跟隨信號肽后的30～40個氨基酸殘基，此時被埋在核糖體內(nèi)）。SRP對翻譯起負調(diào)節(jié)作用，由于SRP暫時中止這些分泌蛋白的翻譯，能確保這些蛋白質(zhì)未達到細胞膜或內(nèi)膜之前不能完成翻譯。這樣在信號肽和SRP的共同作用下，使得這些分泌蛋白能及時完成轉(zhuǎn)運和分泌，避免在細胞內(nèi)積累。分泌的啟動和抑制的調(diào)控，目前只知與一種稱為1072、抗反饋調(diào)節(jié)突變株的利用

在以積累末端產(chǎn)物為目的的發(fā)酵生產(chǎn)中，如果代謝途徑單一無分枝，往往不能選用營養(yǎng)缺陷型突變株。要提高產(chǎn)量，最好采用抗反饋調(diào)節(jié)突變株。

抗反饋調(diào)節(jié)突變株是一種解除合成代謝反饋調(diào)節(jié)機制的突變型菌株。其特點是所需產(chǎn)物不斷積累，不會因其濃度超量而終止生產(chǎn)。2、抗反饋調(diào)節(jié)突變株的利用在以積累末端產(chǎn)物為目的的發(fā)酵108

抗反饋突變株由于基因突變，它們的酶或無活性的原阻遏物不再與末端產(chǎn)物結(jié)合，從而不再發(fā)生酶的變構(gòu)及阻遏物的活化，或者活性阻遏物不能再與發(fā)生了突變的操縱基因結(jié)合，因此反饋調(diào)節(jié)被打破，即使在末端產(chǎn)物過量的情況下，也同樣可以積累高濃度的末端產(chǎn)物。抗反饋突變株由于基因突變，它們的酶或無活性的原阻遏物不109抗反饋調(diào)節(jié)突變株的獲得：抗反饋突變株通?？梢杂锰砑幽┒水a(chǎn)物類似物的方法來篩選獲得?？煞裰苯佑卯a(chǎn)生反饋調(diào)節(jié)的末端產(chǎn)物來進行篩選？抗反饋調(diào)節(jié)突變株的獲得：抗反饋突變株通?？梢杂锰砑幽┒水a(chǎn)物類110

末端產(chǎn)物類似物和末端產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似，因而能夠引起反饋，但是它們不能參與生物合成。

在培養(yǎng)基中添加末端產(chǎn)物類似物后，未突變的細胞將由于代謝途徑受阻而不能獲得生物合成所需的該種末端產(chǎn)物，從而導(dǎo)致細胞死亡。

那些對類似物不敏感的突變體，則由于原來受反饋控制的酶的結(jié)構(gòu)，或是酶的合成系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)生了改變，它們不再受抑制或阻遏的影響，在類似物充斥的情況下照常能合成該種末端產(chǎn)物。例如，用類似物D-精氨酸選出的谷氨酸棒桿菌的抗反饋突變株可使L-精氨酸的產(chǎn)量得到提高。末端產(chǎn)物類似物和末端產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似，因而能夠引起反饋，但是111從營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株也能獲得抗反饋的突變菌株從營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株也能獲得抗反饋的突變菌株112發(fā)生回復(fù)突變后，雖然酶的催化活性恢復(fù)了，末端產(chǎn)物仍然能生成，但很可能酶的氨基酸序列發(fā)生了變化，變得對反饋不敏感了。這樣的回復(fù)突變株便能過量地積累末端產(chǎn)物。通過營養(yǎng)缺陷突變，對反饋敏感的酶缺失了。發(fā)生回復(fù)突變后，雖然酶的催化活性恢復(fù)了，末端產(chǎn)物仍然能生成，113初級代謝途徑障礙性回復(fù)突變型

“原養(yǎng)型→營缺型→原養(yǎng)型”

反饋調(diào)節(jié)變構(gòu)酶的調(diào)節(jié)中心發(fā)生突變造成由芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶，首先選取低產(chǎn)菌株獲得一部分嘧啶和嘌呤缺陷型，再進一步篩選得到回復(fù)突變型菌株，使蛋白酶產(chǎn)量提高5-10倍。次級代謝途徑障礙性回復(fù)突變型“零變株”是完全失去產(chǎn)生抗生素的能力．可是它們的回復(fù)突變株的產(chǎn)量往往比親株高。

次級代謝回復(fù)突變，是一種初級代謝途徑或次級代謝途徑障礙性回復(fù)突變型?！阕冎辍幕貜?fù)突變株的篩選：抗生素菌株初級代謝途徑障礙性回復(fù)突變型次級代謝途徑障礙性回復(fù)突變型114

以上數(shù)例有一個共同趨向，即發(fā)生障礙性突變的營養(yǎng)缺陷型，抗生素產(chǎn)量大多數(shù)都比親株低．而回復(fù)突變株往往比原養(yǎng)型親株高。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因：主要是以上缺陷型菌株由幾種不能合成的氨基酸都是參與相應(yīng)抗生素生物合成的。比如甲硫氨酸是金霉素合成的甲基供體，亮氫酸是合成放線菌素的原料?；蛲蛔兘Y(jié)果，使菌體喪失參與合成這些氨基酸的某種酶的活力，導(dǎo)致有關(guān)抗生素合成過程因缺乏這些氨基酸而產(chǎn)量下降。以上數(shù)例有一個共同趨向，即發(fā)生障礙性突變的營115在工業(yè)上，生產(chǎn)氨基酸、嘌呤、嘧啶和維生素的生產(chǎn)菌種大都是抗反饋突變株。在工業(yè)上，生產(chǎn)氨基酸、嘌呤、嘧啶和維生素的生產(chǎn)菌種大116二、克服分解代謝阻遏的調(diào)控生產(chǎn)中要克服分解代謝阻遏可采取下列措施二、克服分解代謝阻遏的調(diào)控生產(chǎn)中要克服分解代謝阻遏可采取下列1171、避免使用有阻遏作用的碳源和氮源克服分解代謝阻遏的調(diào)控(continued)

可采用相對來說不引起分解代謝阻遏的碳源或氮源，如乳糖、多元醇、有機酸和黃豆餅粉等。如：用甘露糖代替半乳糖培養(yǎng)熒光假單胞菌，由于克服了半乳糖的分解代謝阻遏，結(jié)果在細胞中所產(chǎn)生的纖維素酶提高了1500倍。1、避免使用有阻遏作用的碳源和氮源克服分解代謝阻遏的調(diào)控(c118微生物的代謝調(diào)控與代謝工程-ppt課件11920世紀40年代初期就發(fā)現(xiàn)，青霉素發(fā)酵過程中，雖然葡萄糖被菌體利用最快，但對青霉素合成并不適宜。而乳糖利用雖然較慢，卻能提高青霉素產(chǎn)量。不同的碳源對次級代謝產(chǎn)物積累的作用是不一樣的,一般認為速效碳源都比較差.例:積累頭孢菌素c抗生素比產(chǎn)率遞減順序為蔗糖＞半乳糖＞果糖＞麥芽糖＞葡萄糖20世紀40年代初期就發(fā)現(xiàn)，青霉素發(fā)酵過程120

氮源分解調(diào)節(jié)是類似于碳源分解一類的分解阻遏方式。它主要指含氮底物的酶（如蛋白酶。硝酸還原酶、酰胺酶、組氨酸酶和脲酶）的合成受快速利用的氮源，尤其是氨的阻遏。在次級代謝中。氮分解代謝產(chǎn)物阻遏作用是確實存在的。例:阿維菌素的產(chǎn)生氮源分解調(diào)節(jié)是類似于碳源分解一類的分解阻遏方1212、流加碳源或氮源

在考慮經(jīng)濟效益而必須使用有阻遏作用的碳源或氮源時，緩慢流加碳、氮源可使分解代謝產(chǎn)物維持在較低的水平上，而不至于產(chǎn)生阻遏?？朔纸獯x阻遏的調(diào)控(continued)2、流加碳源或氮源在考慮經(jīng)濟效益而必須使用有阻遏122

如調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，使產(chǎn)生的阻遏蛋白失活，不能與末端分解代謝產(chǎn)物結(jié)合；或操縱基因發(fā)生突變使阻遏蛋白不能與其結(jié)合，都能獲得抗分解代謝阻遏的突變株。3、利用抗分解代謝阻遏的突變體克服分解代謝阻遏的調(diào)控(continued)如調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，使產(chǎn)生的阻遏蛋白失活，不能與末123篩選方法：

在以酶受阻遏的底物為唯一氮源的培養(yǎng)基上，選擇能正常生長的菌落。例如：

把鼠傷寒沙門氏菌培養(yǎng)在葡萄糖-脯氨酸瓊脂上，因為脯氨酸氧化酶被葡萄糖阻遏，所以采用脯氨酸為唯一氮源。未突變菌株的脯氨酸氧化酶被阻遏，而無法利用脯氨酸作為氮源，菌株不能生長；抗分解代謝阻遏突變株則能夠利用脯氨酸而正常生長?？朔纸獯x阻遏的調(diào)控(continued)

用葡萄糖為碳源，受阻遏酶的底物作為唯一氮源配制成培養(yǎng)基，連續(xù)移接誘變后的產(chǎn)氣桿菌，可以選出不受葡萄糖阻遏的組氨酸酶突變株。由于野生型菌株合成組氨酸酶被葡萄糖阻遏，而突變株則可產(chǎn)生組氨酸酶，能迅速生長形成菌落。篩選方法：例如：克服分解代謝阻遏的調(diào)控(continued)124三、對誘導(dǎo)調(diào)節(jié)的控制

在生產(chǎn)上為了提高誘導(dǎo)酶的產(chǎn)量，對誘導(dǎo)調(diào)節(jié)控制的常用手段有：三、對誘導(dǎo)調(diào)節(jié)的控制在生產(chǎn)上為了提高誘導(dǎo)酶的產(chǎn)量，1251、添加誘導(dǎo)物類似物

在誘導(dǎo)物就是酶的底物的情況下，添加底物類似物來加強誘導(dǎo)作用是最好的。

因為底物類似物不易被所形成的酶分解，而在細胞中始終保持較高的濃度，能夠持續(xù)地誘導(dǎo)酶的合成，獲得較高濃度的酶。例如:

用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)可誘導(dǎo)-半乳糖苷酶的合成1、添加誘導(dǎo)物類似物在誘導(dǎo)物就是酶的底物的情況下，添1262、添加輔酶或輔助因子在有些情況下，必須在培養(yǎng)基中添加輔酶才會產(chǎn)生誘導(dǎo)作用例如：丙酮酸脫羧酶的合成需有硫胺存在2、添加輔酶或輔助因子在有些情況下，必須在培養(yǎng)基中添加輔酶才1273、利用組成型突變株

突變可以除去酶合成時對誘導(dǎo)物的依賴組成酶突變株在沒有誘導(dǎo)物存在時，能照常合成誘導(dǎo)酶

在生產(chǎn)中使用組成酶突變株時，可不必在發(fā)酵液中添加誘導(dǎo)物，且產(chǎn)生的誘導(dǎo)酶活性也比原菌株強。3、利用組成型突變株突變可以除去酶合成時對誘導(dǎo)物的依128

只有需要時才合成所需的酶是微生物應(yīng)有的、正常的調(diào)節(jié)機制。如不設(shè)法繞過這種機制，就難于使所需要的誘導(dǎo)酶大量生產(chǎn)。采用誘變方法，借強力因素誘變，引起突變，消除誘導(dǎo)酶，合成所必需依賴誘導(dǎo)物這種障礙，如突變不是發(fā)生在結(jié)構(gòu)基因上，而是發(fā)生在調(diào)節(jié)基因或操縱基因上，從而導(dǎo)致調(diào)節(jié)基因編碼的阻遏物（阻遏蛋白）無活性，或操縱基因?qū)钚宰瓒粑锏挠H和力衰退，則無需誘導(dǎo)物便能產(chǎn)生誘導(dǎo)酶，這種突變作用稱為調(diào)節(jié)性或組成型突變。具有這種特性的菌株稱為組成型突變株。只有需要時才合成所需的酶是微生物應(yīng)有的、正常129

選育組成型突變株的方法，其主要原則是創(chuàng)造一種利于組成型菌株生長而不利于誘導(dǎo)型菌株生長的培養(yǎng)條件，造成對組成型的選擇優(yōu)勢以及適當?shù)淖R別兩類菌落的方法，從而把組成型突變株選擇出來。選育組成型突變株的方法，其主要原則是創(chuàng)造一種利于130例如

把大腸桿菌半乳糖苷酶的誘導(dǎo)型菌株經(jīng)誘變處理后，先在含乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，由于組成型突變株半乳糖苷酶的合成不需誘導(dǎo)即能產(chǎn)生，因此可較誘導(dǎo)型的出發(fā)菌株較早開始生長，在一定時間內(nèi)菌數(shù)的增加便較快。如持續(xù)進行培養(yǎng)，由于誘導(dǎo)酶形成后，原菌株生長速率亦逐漸增加，這種選擇性造成的差別就會減少?？捎媒惶嬖谌樘恰⑵咸烟桥囵B(yǎng)基中進行培養(yǎng)的方法。兩者利用葡萄糖時的生長速率是相同的，乳糖為碳源造成的組成型菌株的優(yōu)勢生長會持續(xù)下去。例如如持續(xù)進行培養(yǎng)，由于誘導(dǎo)酶形成后，原菌株生長速率131

在平板上識別組成型突變株的方法，主要是利用在無誘導(dǎo)物存在時進行培養(yǎng)，它能產(chǎn)生酶，加入適當?shù)牡孜镞M行反應(yīng)顯示酶活以識別。

如甘油培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)大腸桿菌時，誘導(dǎo)型菌株不產(chǎn)酶，組成型菌株可產(chǎn)生半乳糖苷酶。菌落長出后噴布鄰硝基苯半乳糖苷，組成型菌株的菌落由于能水解它而呈現(xiàn)硝基苯的黃色，誘導(dǎo)型則無顏色變化。

通常使用酶解后可以有顏色變化的底物，便于迅速檢出組成型菌落。在平板上識別組成型突變株的方法，主要是利用在無誘導(dǎo)物132

第三節(jié)提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法第三節(jié)1331、使用誘導(dǎo)物

與糖類和蛋白質(zhì)降解有關(guān)的水解酶類大都屬誘導(dǎo)酶類，因此向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物就會增加胞外酶的產(chǎn)量。如:加入槐糖（1，2--D-葡二糖）誘導(dǎo)木霉菌的纖維素酶的合成；木糖誘導(dǎo)半纖維素酶和葡萄糖異構(gòu)酶的生成一、提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法1、使用誘導(dǎo)物與糖類和蛋白質(zhì)降解有關(guān)的水解酶類大都屬誘導(dǎo)134

但誘導(dǎo)物的價格往往比較貴，經(jīng)濟上未必合算

加入廉價的含誘導(dǎo)物的原料是一種常用的方法。提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法（continued）如：槐豆莢等某些種子皮中含有槐糖；玉米芯富含木聚糖，培養(yǎng)過程中可陸續(xù)被水解產(chǎn)生槐糖、木糖但誘導(dǎo)物的價格往往比較貴，經(jīng)濟上未必合算加入廉價1352、除去誘導(dǎo)物——選育組成型產(chǎn)生菌

在發(fā)酵工業(yè)中，要選擇到一種廉價、高效的誘導(dǎo)物是不容易的；分批限量加入誘導(dǎo)物在工藝上也多有不便。

使調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，不產(chǎn)生有活性的阻遏蛋白；或者操縱基因發(fā)生突變不再能與阻遏物相結(jié)合，都可達到此目的。

更為有效的方法是改變菌株的遺傳特性，除去對誘導(dǎo)物的需要，即選育組成型突變株。提高初級代謝產(chǎn)物