魏培海儀器分析高效液相色法

關(guān)于魏培海儀器分析高效液相色法

高效液相色譜法的特點

1.高壓：對流動相施加高壓，使其迅速地通過色譜柱液；

2.高效：分離效率大高，甚至可實現(xiàn)手性分離；

3.高靈敏度：采用高靈敏度的檢測器;4.速度快：與經(jīng)典液相色譜法相比，高效液相色譜法所需的分析時間較少，一般少于1h；

5.應(yīng)用范圍更廣。第2頁,共79頁，2024年2月25日，星期天HPLC與經(jīng)典LC的比較經(jīng)典液相色譜高效液相色譜

常壓或減壓

填料顆粒

柱效低

分析速度慢

色譜柱只用一次

不能在線檢測

高壓，15~35MPa

填料顆粒小，2~50μm

柱效高,n>30000塊/m

分析速度快

色譜柱可重復(fù)多次使用

能在線檢測第3頁,共79頁，2024年2月25日，星期天HPLC與GC的比較相同點：具分離和分析功能，均可以在線檢測。

不同點：

分析對象GC：適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、沸點較低的樣品，不適于高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品。占有機物的20%。HPLC：不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，適于溶解后能制成溶液的樣品；分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品。占有機物的80%以上。第4頁,共79頁，2024年2月25日，星期天流動相GC：流動相為惰性氣體，如H2、N2、He、Ar；組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用。HPLC：流動相為液體；流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度，增加了額外因素，如流動相極性、pH值、不同比例的兩種或兩種以上液體的配比。流動相種類較多，選擇余地廣。第5頁,共79頁，2024年2月25日，星期天

GC：加溫操作。

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。２僮鳁l件第6頁,共79頁，2024年2月25日，星期天本章教學(xué)內(nèi)容高效液相色譜儀

；液相色譜中的固定相和流動相；液相色譜法的主要類型

。第7頁,共79頁，2024年2月25日，星期天本章知識目標熟悉液相色譜法的分離原理、分析對象；熟悉液相色譜儀的基本構(gòu)造；熟悉液相色譜中的固定相、流動相類型，掌握其選擇方法；了解液相色譜法中常用的檢測器類型和結(jié)構(gòu)。第8頁,共79頁，2024年2月25日，星期天本章能力目標

能根據(jù)基團頻率判斷官能團的存在；能掌握用液相色譜儀進行樣品組分的分離和定量方法

。第9頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)高效液相色譜儀第10頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第13頁,共79頁，2024年2月25日，星期天主要部件：高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。輔助裝置：脫氣機、梯度洗脫裝置、自動進樣裝置、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。組成部件第14頁,共79頁，2024年2月25日，星期天基本流程第15頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第16頁,共79頁，2024年2月25日，星期天一、高壓輸液系統(tǒng)

包括：由貯液瓶、高壓泵、脫氣機、梯度洗脫等裝置。第17頁,共79頁，2024年2月25日，星期天1．溶劑脫氣裝置作用：防止溶解在溶劑（流動相、試樣）中的N2、O2進入檢測器而使噪聲劇增。脫氣方式：氦氣鼓泡、超聲波脫氣、真空脫氣等。第18頁,共79頁，2024年2月25日，星期天2．高壓泵作用：輸送流動相。無脈動或脈動極小，保證輸出的流動相具有恒定的流速。要求：具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等。第19頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第20頁,共79頁，2024年2月25日，星期天作用：分離過程中改變流動相的組成

，使所有峰都獲得最佳分離效果，分析時間縮短。基本方式：高壓梯度、低壓梯度。2．梯度洗脫第21頁,共79頁，2024年2月25日，星期天高壓梯度：利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。第22頁,共79頁，2024年2月25日，星期天低壓梯度

：一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。如雙元梯度、四元梯度等。第23頁,共79頁，2024年2月25日，星期天二、進樣系統(tǒng)進樣方式：隔膜注射器進樣停留進樣閥進樣自動進樣器進樣第24頁,共79頁，2024年2月25日，星期天1．隔膜注射器進樣

色譜柱頂端裝一耐壓彈性隔膜，進樣時用微量注射器刺穿隔膜將試樣注入色譜柱。優(yōu)點：裝置簡單、價廉、死體積小。缺點：是允許進樣量小，重復(fù)性差，只能用于低壓系統(tǒng)(<10MPa,壓力高了，密封墊會泄漏)。第25頁,共79頁，2024年2月25日，星期天2．停留進樣

停止流動相流動后再進樣，以防止泄漏，可用于高壓。缺點：重新升壓后會產(chǎn)生不穩(wěn)，保留時間和峰形重復(fù)性比較差。第26頁,共79頁，2024年2月25日，星期天3．閥進樣

結(jié)構(gòu)和作用原理與氣相色譜中所用的六通閥相同。

優(yōu)點：進樣準確，重復(fù)性好，適用于定量分析，更換不同體積的定量管，可調(diào)整進樣量。第27頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共79頁，2024年2月25日，星期天4．自動進樣

由計算機自動控制定量閥，按預(yù)先編制好的程序進行進樣。優(yōu)點：可自動完成幾十或上百個樣品的分析。在進行大量樣品的分析時，使用自動進樣器操作可節(jié)省大量人力和時間。缺點：裝置成本高。第29頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共79頁，2024年2月25日，星期天三、色譜柱組成：包括柱管和固定相兩部分。柱管材料通常采用優(yōu)質(zhì)不銹鋼，柱長一般為5~40cm，內(nèi)徑為1~6mm

。第31頁,共79頁，2024年2月25日，星期天

色譜柱的兩端有燒結(jié)不銹鋼或多孔聚四氟乙烯過濾片，以防止柱內(nèi)的填料流出。填充好固定相后的柱子有方向性，在使用時，應(yīng)使流動相的方向與柱子管外箭頭標的方向一致。第32頁,共79頁，2024年2月25日，星期天四、檢測器檢測器類型最高靈敏度（g/mL）溫度影響流速影響用于梯度洗脫紫外光度(UV)選擇性5

10-10低無可以示差折光(RI)通用性5

10-7有無不可熒光(FD)選擇性10-12~10-9低無可以紅外吸收(IR)選擇性~10-7低無可以極譜選擇性10-10~10-9有有困難電導(dǎo)選擇性10-9有有不可質(zhì)譜通用性~10-8無無可以第33頁,共79頁，2024年2月25日，星期天1．紫外檢測器

應(yīng)用最廣：適于約有70％的樣品。

靈敏度高：線性范圍大：死體積?。海?mm×10mm，8μL）；對流動相的流速和溫度變化不敏感。分類：固定波長型、可調(diào)波長型和二極管陣列檢測器。特點：第34頁,共79頁，2024年2月25日，星期天固定波長：254nm或280nm

固定波長紫外檢測器第35頁,共79頁，2024年2月25日，星期天可調(diào)波長紫外檢測器第36頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第37頁,共79頁，2024年2月25日，星期天二極管陣列檢測器第38頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第39頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共79頁，2024年2月25日，星期天2．熒光檢測器

工作原理：利用某些試樣具有熒光特性進行檢測。特點：高靈敏度、高選擇性；對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；第41頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第42頁,共79頁，2024年2月25日，星期天3．示差折光檢測器工作原理：折光指數(shù)與組成有關(guān)，連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；特點：通用型檢測器；靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫。分類：偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種。第43頁,共79頁，2024年2月25日，星期天偏轉(zhuǎn)式：它是基于折射率隨介質(zhì)中的成分變化而變化，如入射角不變，則光束的偏轉(zhuǎn)角是流動相(介質(zhì))中成分變化的函數(shù)。因此，測量折射角偏轉(zhuǎn)值的大小，便可得到試樣的濃度。第44頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第45頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)液相色譜中的固定相和流動相一、液相色譜固定相二、液相色譜流動相第46頁,共79頁，2024年2月25日，星期天一、液相色譜固定相1．按固相材料的剛性程度分類剛性固體

硅膠：用于液固色譜的固定相，液相色譜的擔(dān)體，化學(xué)鍵合固定相基質(zhì)材料。

硬質(zhì)凝膠聚苯乙烯與二乙烯基苯交聯(lián)而成的多孔顆粒：只應(yīng)用在離子交換色譜和凝膠色譜中。第47頁,共79頁，2024年2月25日，星期天2．按固相填料的疏松程度分類薄殼型微珠載體（表面多孔型）構(gòu)成：30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠、多孔氧化鋁或分子篩等，形成殼形結(jié)構(gòu)。特點：①多孔層厚度小、孔淺、柱效高；②分配過程在載體表面進行，出峰快；③顆粒大，裝柱容易，適于常規(guī)分析

。第48頁,共79頁，2024年2月25日，星期天全多孔型載體

構(gòu)成：硅膠、氟化鋁或硅藻土的微粒凝聚而成多孔球體。特點：顆粒較細，整個微粒全部是多孔性物質(zhì)，表面積大，負荷量大。適合于復(fù)雜混合物分離和痕量分析。第49頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第50頁,共79頁，2024年2月25日，星期天3．化學(xué)健合固定相

通過化學(xué)鍵的方式把有機分子結(jié)合到載體表面，形成一種新型固定相。它可以避免因機械涂布固定液，導(dǎo)致在色譜分離中使固定液流失的缺陷。第51頁,共79頁，2024年2月25日，星期天化學(xué)鍵合相的載體主要是硅膠（表面有硅醇基）：第52頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第53頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第54頁,共79頁，2024年2月25日，星期天時間，min固定相：C1固定相：C8固定相：C18硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長對反相色譜分離的影響1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長，分離效果越好。第55頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第56頁,共79頁，2024年2月25日，星期天化學(xué)鍵合固定相的特點（1）傳質(zhì)快：表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長：化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；（3）耐水、耐光、耐有機溶劑，穩(wěn)定；（4）選擇性好：可鍵合不同官能團，提高選擇性；（5）有利于梯度洗脫。第57頁,共79頁，2024年2月25日，星期天二、液相色譜流動相（1）稱為淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。1.液相色譜流動相的特性第58頁,共79頁，2024年2月25日，星期天①合適的溶解力與極性。②化學(xué)穩(wěn)定性要好，與固定相和被測組分不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。③與檢測器相匹配。④溶劑的純度要高。一般使用色譜純試劑。⑤溶劑的流動性要好，黏度要低。2.流動相應(yīng)滿足以下要求第59頁,共79頁，2024年2月25日，星期天3.流動相類別

按流動相組成分：單組分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、乙腈、水。第60頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)液相色譜法的主要類型

一、液-固吸附色譜二、液-液分配色譜三、離子交換色譜四、離子色譜五、離子對色譜六、排阻色譜第61頁,共79頁，2024年2月25日，星期天一、液-固吸附色譜

固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑；

基本原理：組分在固定相吸附劑上吸附與解吸；主要適用范圍：相對分子量中等的油溶性試樣，對具有不同官能團的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾。第62頁,共79頁，2024年2月25日，星期天

分離機制：

各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心利用吸附劑對不同組分的吸附能力差異而實現(xiàn)分離吸附→解吸→再吸附→再解吸→無數(shù)次洗脫→分開

第63頁,共79頁，2024年2月25日，星期天吸附系數(shù)

Ka與組分的性質(zhì)、吸附劑的活性、流動相的性質(zhì)及溫度有關(guān)。吸附平衡

Xm+nYa→Xa+nYm

第64頁,共79頁，2024年2月25日，星期天二、液-液分配色譜

固定相與流動相均為液體（互不相溶）基本原理：組分在固定相和流動相上的分配；流動相：親水性固定液—疏水性流動相疏水性固定液—親水性流動相固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用化學(xué)鍵合固定相：將各種不同基團通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。第65頁,共79頁，2024年2月25日，星期天正相色譜——固定液極性>流動相極性分離順序：極性小的組分先出柱；極性大的組分后出柱。分離對象：適于分離極性組分反相色譜——固定液極性<流動相極性分離順序：極性大的組分先出柱；極性小的組分后出柱。分離順序：適于分離非極性組分第66頁,共79頁，2024年2月25日，星期天三、離子交換色譜

固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂流動相：陰離子離子交換樹脂作固定相—酸性水溶液

陽離子離子交換樹脂作固定相—堿性水溶液基本原理：組分在固定相上發(fā)生反復(fù)離子交換反應(yīng)，基于組分與離子交換劑之間親和力的差異進行分離。應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。第67頁,共79頁，2024年2月25日，星期天選擇性系數(shù)

注：Ks與離子的電荷數(shù)、水合離子半徑、流動相性質(zhì)、離子交換樹脂性質(zhì)以及溫度有關(guān)固定離子可交換離子待測離子

以陽離子離子交換為例：

RSO3-H++X+→RSO3-X++H+第68頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第69頁,共79頁，2024年2月25日，星期天四、離子色譜

傳統(tǒng)離子交換色譜存在著兩個難于解決的問題：(1)需要高濃度淋洗液洗脫且洗脫時間很長；(2)洗脫后的組分缺乏靈敏、快速的在線檢測方法。第70頁,共79頁，2024年2月25日，星期天1.離子色譜法原理

離子色譜法：以離子交換樹脂為固定相，以電解質(zhì)溶液為流動相，用于分離陰陽離子。離子色譜中，應(yīng)用最為廣泛的的檢測器為電導(dǎo)檢測器。為消除流動相中強電解質(zhì)背景離子對檢測器的干擾，常設(shè)置一個抑制柱，稱為雙柱型離子色譜法或化學(xué)抑制型離子色譜法。第71頁,共79頁，2024年2月25日，星期天2.離子色譜法基本裝置離子色譜連續(xù)抑制裝置圖

(以測定陰離子為例)第72頁,共79頁，2024年2月25日，星期天分離分析Br-為例分離柱上發(fā)生離子交換：NaOH洗脫：分離柱上流出Na+

（大量）

、Br-、OH-（大量）抑制柱上發(fā)生離子交換：進入檢測器：H2O、HBr第73頁,共79頁，2024年2月25日，星期天

雙柱；薄殼型陰離子交換樹脂分離柱(3×25