利用HPLC和UV-vis測定一種無載體納米顆粒中藥物含量

-127-利用HPLC和UV-vis法測定一種無載體納米顆粒中藥物的含量摘要目的：建立測定無載體納米藥物Ru-T中釕配合物和TH287的含量分析方法，并對該方法進行方法學驗證。方法：利用高效液相色譜法(HPLC)測定無載體納米藥物Ru-T中TH287的含量，利用紫外-可見分光光度法(UV-vis)測定該藥物中釕配合物的含量，并對分析方法進行方法學考察。結果：建立的方法在各項指標下均表現(xiàn)出合理有效的特點，標準曲線線性相關系數(shù)均大于0.999，精密度、重復性、穩(wěn)定性的結果均符合要求，TH287、釕配合物的平均加樣回收率分別為90.01%、98.9%。測定3批不同的無載體納米藥物中TH287的平均含量為171.60μmol/L,釕配合物的平均含量為301.2μmol/L。結論：建立的方法均準確、精密度高、重復性好，適用于該藥物的含量測定。關鍵詞：高效液相色譜法；紫外可見分光光度法；TH287；釕配合物；含量DeterminationofdrugcontentinacarrierfreenanoparticleusingHPLCandUV-vismethodsABSTRACTObjective:ToestablishamethodfordeterminingthecontentofrutheniumcomplexesandTH287incarrierfreenanomedicine,andtovalidatethemethodologyofthismethod.Method:HPLCwasusedtodeterminethecontentofTH287incarrierfreeNanomedicineRu-T,andUV-viswasusedtodeterminethecontentofrutheniumcomplexintheNanomedicine.

Theestablishedmethodwasalsoinvestigatedformethodology.Result:Theestablishedmethodsareallreasonableandeffective,withlinearcorrelationcoefficientsofstandardcurvesgreaterthan0.999.Theprecision,repeatability,andstabilitymeettherequirements.TheaveragesamplerecoveryratesofTH287andrutheniumcomplexesare90.01%and98.9%,respectively.TheaveragecontentofTH287inthreedifferentbatchesofcarrierfreenanomedicinewasdeterminedtobe171.60μmol/L,theaveragecontentofrutheniumcomplexis301.2μmol/L。Conclusion:Theestablishedmethodsexhibitaccuracy,precision,andreproducibility,renderingthemsuitableforthereliabledeterminationofthedrugcontent.Keywords:HPLC;UV-vis;TH287;Rutheniumcomplex;content利用HPLC和UV-vis法測定一種無載體納米顆粒中藥物的含量前言近年來，在生物醫(yī)藥領域，納米藥物受到了廣泛的重視，并且納米藥物在促進癌癥治療方式進步方面發(fā)揮了一定的推動作用[1，2]。納米藥物具有極佳的靶向性，它們可以降低藥物向非目標器官或組織的分布，從而降低藥物的劑量，提高治療效率并減少對正常器官的副作用[3]。本課題組在此之前以TH287與釕配合物為原料，制備了一種無載體納米藥物Ru-T,從而改善此藥物的疏水性，并增強藥物的光動力療效以及靶向性，該藥物是一類抗腫瘤藥物。過渡金屬配合物作為抗癌藥物，一直以來都是無機抗腫瘤藥物研發(fā)的一個熱點[4]。其中釕配合物是目前研究相對廣泛和深入的過渡金屬配合物之一。光動力療法（PDT）是一種新型腫瘤治療方法，在臨床上得到了認可[5]。釕配合物能在黑暗條件下保持穩(wěn)定，在光照的條件下，產(chǎn)生單態(tài)氧（1O2）氧化斷裂DNA，解離后生成的配位不飽和釕配合物與DNA等生物大分子配位交聯(lián)從而發(fā)揮抗癌作用。此外，癌細胞為了避免氧化的dNTP加入需要MutT同源酶1（MTH1）活性，從而導致DNA損傷和細胞死亡，MTH1是體內(nèi)的抗癌靶點，TH287作為MTH1的一種高效選擇性抑制劑，能有效且選擇性地參與并抑制細胞內(nèi)MTH1蛋白而發(fā)揮抗癌作用[6，7]。合適的藥物輸送系統(tǒng)必須要有很高的藥物封裝效率才能達到其治療目標[8]。因此，需要對該無載體納米藥物Ru-T進行含量測定。一般情況下，可采用容量分析法、光譜分析法和色譜分析法對藥物進行含量分析，此外，還可運用電化學分析法等其他方法進行含量分析。不同的分析方法具有各自的優(yōu)缺點和適用范圍，選擇合適的方法有助于提高研究效果的準確性和試驗效率。其中，容量分析法作為一種方便、精確且具有高耐用性的分析方法，被廣泛應用，但是該方法的專屬性較差；光譜分析法則是一種常用且性價比較高的分析方法，因為其操作快速簡易，靈敏度較高，且具有一定的準確度，只是方法專屬性略差；色譜分析法具有高分離效能、快速、高專屬性與高靈敏度，準確度高的優(yōu)點，只是定性能力稍差。其次，在對藥物進行質量考核時，必須要有一個科學且可靠的含量測定方法，因此含量測定方法必須進行適當驗證，才能確保所采用的方法適合于相應檢測要求[9]。本次研究通過對該藥物進行含量測定并進行方法學驗證，期望能夠給該藥物的進一步研究學者提供理論依據(jù)和技術支持，也希望能為無載體納米藥物的含量的檢測提供參考與思路。1高效液相色譜法的建立高效液相色譜法是一種常采用的定量分析方法，其工作原理是通過使用液體作為流動相，并利用高壓輸液系統(tǒng)將流動相泵入固定相填充的色譜柱，由于不同物質和固定相之間相互作用不同，它們在色譜柱中停留的時間也不相同，隨著流動相逐漸通過固定相，物質分離并進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對樣品的定性或定量分析[10，11]。本次研究擬用高效液相色譜法測定TH287的含量。首先使用紫外分光光度計確定TH287的最大吸收峰處的波長，通過標準曲線法，建立測定該無載體納米藥物中TH287的含量測定方法。本次研究將對測定方法進行線性關系、精密度、重復性、穩(wěn)定性以及加樣回收率的驗證，并判斷檢測方法的有效性。1.1儀器與試劑、試藥儀器UV-2600型紫外可見分光光度計（日本島津株式會社）LC-2030Plus高效液相色譜儀（日本島津株式會社）試劑與試藥表1.1實驗藥材與試劑耗材試劑與藥材來源批號超純水————釕配合物本課題組前期合成——TH287上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司16869無載體納米藥物本課題組前期合成——甲醇成都市科隆化學品有限公司2023030602乙酸銨上海泰坦科技股份有限公司P18508171.2檢測方法1.2.1測定條件色譜柱：HypersilODS2C18柱(4.6mm×250mm,5μM）；流動相：甲醇－10mmol/L乙酸銨（65∶35）；紫外檢測波長：285nm；流速：1mL·min－１；柱溫：27.7℃；進樣量：10μL。1.2.2溶液制備標準儲備液的制備：取37.16mmol/L的TH287溶液適量，并使用超純水稀釋，以獲得物質的量濃度為100μmol/L的TH287標準儲備液，將制備好的標準儲備液儲存于4℃冰箱。標準溶液的制備：取100μmol/LTH287儲備液適量，用超純水制成5、10、20、30、40、50μmol/L的標準溶液，即得。供試品溶液的制備：取適量無載體納米藥物Ru-T原液，用超純水將其稀釋10倍，即得。1.3方法學考察1.3.1檢測波長的確定精密量取1.2.2項下標準溶液制備的20μmol/LTH287溶液2mL，以超純水作空白，在200～700nm處使用紫外-可見分光光度計進行掃描，繪制紫外吸收圖譜。結果見圖1.1所示，確定285nm為檢測波長。圖1.1TH287的紫外吸收圖譜Fig.1UV-visimagesofrutheniumcomplex1.3.2方法專屬性取1.2.2項下制備的標準溶液、供試品溶液和釕配合物溶液，在1.2.1測定條件下，TH287的保留時間為6.290min，峰形良好，釕配合物對TH287的含量測定不存在干擾，方法專屬性好，TH287、釕配合物、無載體納米藥物的色譜圖見圖1.2所示。abc圖1.2TH287(a)釕配合物(b)納米藥物(c)的高效液相色譜圖Fig.2HPLCimagesofTH287(a),rutheniumcomplex(b),nanodrug(c)1.3.3線性關系考察使用1.2.2項下制備的標準溶液，按照1.2.1項下的色譜條件進行分別進樣，并記錄峰面積。隨后，根據(jù)峰面積對TH287標準溶液的濃度進行線性回歸分析，得到線性方程及相關系數(shù)，詳見表1.2。表1.2TH287回歸方程及相關系數(shù)回歸方程相關系數(shù)R線性范圍TH287Y=3139.7X－1508.70.99975.00~50.00μmol/L1.3.4精密度考察使用1.2.2項下制備的標準溶液低、中、高三種物質的量濃度（10，30，50μmol/L），根據(jù)1.2.1項下測定條件，連續(xù)進行6次進樣，并記錄每次的峰面積。計算每種濃度的峰面積的相對標準偏差（RSD），結果詳見表1.3。表1.3高效液相色譜法精密度實驗結果濃度峰面積RSD%10μmol/L3024830382301533081731114312420.6230μmol/L9164393256940479183893751937690.4650μmol/L1559891581141589581539821563481583381.19根據(jù)表1.3所示，10μmol/LTH287溶液的精密度RSD為0.62%、30μmol/L溶液的精密度RSD為0.46%、50μmol/L溶液的精密度RSD為1.19%，結果表明實驗儀器具有優(yōu)異的精密度。1.3.5重復性考察取1.2.2項下制備的供試品溶液適量，平行制備6份樣品，并分別編號1~6。根據(jù)1.2.1項下的測定條件進行進樣測定，并記錄峰面積。根據(jù)峰面積計算各樣品的含量，并計算RSD，結果詳見表1.4。表1.4高效液相色譜法重復性實驗結果樣品123456RSD%峰面積5185952122518805196952109514890.54含量（μmol/L）17.1817.2117.1916.9217.2017.17由表1.4所見，樣品的RSD為0.67%，結果符合2020年版《中國藥典》四部9101分析方法驗證指導原則中，在重復性方面對應待測成分含量的要求[12]，說明方法重復性良好。1.3.6穩(wěn)定性考察取1.2.2項下制備的供試品溶液，并根據(jù)1.2.1項下測定條件，在不同時間點（0，2，4，6，8，12h）進行進樣測定，記錄峰面積并計算RSD，詳細結果見表1.5。表1.5高效液相色譜法穩(wěn)定性實驗結果測定時間/h及峰面積RSD%02468125185952122518805196952109514890.54由表1.5可知，RSD為0.54%，說明供試品溶液室溫下12h穩(wěn)定。1.3.7加樣回收率試驗按照1.2.2項下方法制備供試品溶液，共9份，將其分為3組，分別精密加入3種標準溶液適量（80%、100%、120%），在符合1.2.1項下的測定條件，測定并記錄峰面積，然后計算回收率，結果詳見表1.6?；厥章?=｜C－A｜/B×100%（eq.1.1)式中A為供試溶液中TH287濃度；B為加入的TH287標準溶液濃度；C為實測濃度表1.6高效液相色譜法加樣回收率實驗結果樣品含量(μmol/L)加入標準品的量(μmol/L)峰面積實測含量(μmol/L)回收率平均回收率%1085285417.3191.4% 90.015211517.0888.5%5257717.2390.3%105849219.1191.1%5792418.9389.3%5620718.3883.8%126584821.4595.4%6394920.8590.4%6370820.7789.9%實驗結果表明：該無載體納米藥物中TH287的平均回收率為：90.01%，這一結果符合2020年版《中國藥典》四部9101分析方法驗證指導原則中準確度項下的相關標準，表明該方法回收率良好，方法有效可行。1.3.8樣品中的TH287含量測定分別精密量取3批1.2.2項下制備的供試品溶液，分別根據(jù)1.2.1項下測定條件，進行進樣測定，并記錄峰面積，代入回歸方程，計算得到其濃度，并根據(jù)稀釋倍數(shù)n(此處n為10)可以得到無載體納米藥物中TH287的含量，樣品溶液中的TH287含量如表9所示。表9TH287含量批次峰面積含量（μmol/L）平均含量（μmol/L）P152271171.29171.60P252537172.13P352295171.37實驗結果表明3批無載體納米藥物中TH287的平均含量為171.60μmol/L。2紫外-可見分光光度法的建立紫外-可見分光光度法是一種基于被測物質對單色光輻射的吸收特性而建立的可用于定性和定量的光譜分析方法[13]。它是常用的光譜分析法，因其具有操作簡便，快速等優(yōu)點。本次研究首先使用紫外分光光度計測量并確定TH287和釕配合物的最大吸收峰處波長，在釕配合物的最大吸收峰波長處，TH287無吸光度值，因此擬用紫外-可見分光光度法測定釕配合物的含量。通過標準曲線法，建立測定該無載體納米顆粒中釕配合物的含量測定方法。本次研究將對測定方法進行線性關系、精密度、重復性、穩(wěn)定性以及加樣回收率的驗證，并判斷檢測方法的有效性。2.1儀器與試劑、試藥2.1.1儀器UV-2600型紫外可見分光光度計（日本島津株式會社）2.1.2試劑與試藥表2.1實驗藥材與試劑耗材試劑與藥材來源批號超純水————釕配合物本課題組前期合成——TH287上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司16869無載體納米藥物本課題組前期合成——2.2檢測方法2.2.1溶液制備標準儲備液的制備：精密量取2mmol/L釕配合物溶液適量，用超純水稀釋后制成物質的量濃度為100μmol/L的釕配合物標準儲備液，放至4℃冰箱保存。標準溶液的制備：取100μmol/L的釕配合物儲備液，并用超純水稀釋，以制備一系列濃度的標準溶液，包括5、10、20、30、40、50μmol/L釕配合物溶液。供試品溶液的制備：取適量無載體納米藥物原液，用超純水將其稀釋12倍，即得。2.3方法學考察2.3.1檢測波長的確定分別精密量取1.2.2項下標準溶液制備的20μmol/LTH287溶液2mL，2.2.1項下標準溶液制備的20μmol/L釕配合物溶液2mL，用超純水作空白，在200～700nm處使用紫外-可見分光光度計分別對其進行掃描，并繪制紫外吸收圖譜。結果見圖2.1，釕配合物的最大吸收波長為405nm。圖2.1釕配合物和TH287的紫外吸收圖譜Fig.2.1UV-visimagesofTH287andrutheniumcomplex2.3.2線性關系考察精密量取2.2.1項下制備的標準溶液，各2mL，并以超純水作空白，在405nm處分別測定，并記錄吸光度值。然后根據(jù)吸光度值對釕配合物標準溶液的濃度進行線性回歸，得到線性方程及相關系數(shù)，具體結果見表2.2。表2.2釕配合物回歸方程及相關系數(shù)回歸方程相關系數(shù)R線性范圍釕配合物Y=0.0133X＋0.00130.99975.00~50.00μmol/L2.3.3精密度考察取2.2.1項下制備的標準溶液低、中、高三種物質的量濃度（10，30，50μmol/L），分別在405nm處連續(xù)進行6次吸光度值測定，記錄吸光度值并計算各濃度下吸光度的RSD，結果詳見表2.3。 表2.3紫外-可見分光光度法精密度實驗結果 濃度吸光度RSD%10μmol/L0.1350.1350.1350.1340.1360.1360.5730μmol/L0.4640.4640.4640.4640.4650.4650.1450μmol/L0.7660.7660.7660.7660.7670.7670.08由表2.3所示，10μmol/L標準溶液的精密度RSD為0.57%、30μmol/L標準溶液的精密度RSD為0.14%、50μmol/L標準溶液的精密度RSD為0.08%，結果表明實驗儀器具有出色的精密度。2.3.4重復性考察取2.2.1項下制備的供試品溶液并制備6份，各2mL，編號為1~6，分別在405nm處進行吸光度值測定，記錄測定數(shù)據(jù)，并計算其RSD。結果詳見表2.4。表2.4紫外-可見分光光度法重復性實驗結果樣品123456RSD%吸光度0.3290.3420.3300.3360.3370.3351.43由表2.4所見，樣品的RSD為0.67%，結果符合2020年版《中國藥典》四部9101分析方法驗證指導原則中，在重復性方面對應待測成分含量的要求，說明方法重復性良好。2.3.5穩(wěn)定性考察精密量取2.2.1項下制備的供試品溶液2ml，在405nm處，在不同時間點（0，2，4，6，8，12h）進行吸光度值測定，記錄測定數(shù)據(jù)，并計算RSD，結果見表2.5。表2.5紫外-可見分光光度法穩(wěn)定性實驗結果測定時間/h及吸光度RSD%02468120.3680.3640.3620.3600.3590.3551.24由表2.4可知，RSD為1.24%，說明供試品溶液室溫下12h穩(wěn)定。2.3.6加樣回收率試驗根據(jù)2.2.1項下的方法制備供試品溶液，分為3組，每組3份，每組精確加入3種標準溶液適量（80%、100%、120%），在405nm處測定吸光度值，記錄測定數(shù)據(jù)，并計算回收率。詳細結果見表2.6。回收率%=｜C－A｜/B×100%（eq.2.1）式中A為供試溶液中釕配合物濃度；B為加入的釕配合物標準溶液濃度；C為實測濃度表2.6紫外-可見分光光度法加樣回收率實驗結果樣品濃度(μmol/L)加入標準品的濃度(μmol/L)吸光度實測濃度(μmol/L)回收率%平均回收率%1080.24118.02100.398.90.24017.9599.30.24017.9599.3100.26319.6896.80.26820.05100.50.26719.9899.8120.29221.8698.80.28821.5696.30.29321.9399.4實驗結果表明：無載體納米藥物中釕配合物的平均回收率為：98.9%，符合2020年版《中國藥典》四部9101分析方法驗證指導原則回收率項下的相關標準，表明該方法回收率良好，方法有效可行。2.3.7樣品中的釕配合物含量測定精密量取3批按照2.2.1項下制備的供試品溶液，分別在405nm處測量吸光度，記錄吸光度值，代入回歸方程，計算其濃度，并根據(jù)稀釋倍數(shù)n(此處n為12)得到無載體納米藥物中釕配合物的含量，樣品溶液中的釕配合物含量見表2.7。表2.7釕配合物含量批次吸光度含量（μmol/L）平均含量（μmol/L）P10.309277.2301.2P20.340306P30.357320.4 實驗結果表明3批無載體納米藥物中釕配合物的平均含量為301.2μmol/L。3結論與展望3.1結論紫外吸收光譜圖顯示在TH287的檢測波長處，釕配合物有較強的吸光度值。因此，本次研究采用高效液相色譜法對無載體納米藥物Ru-T中TH287進行含量測定。本次研究建立的含量檢測方法，方法學驗證結果表明，該無載體納米藥物Ru-T中的TH287與釕配合物的濃度在范圍5-50內(nèi)μmol/L分別與峰面積、吸光度具有較好的線性關系，相關系數(shù)均大于0.999，并且建立的兩種方法均靈敏度高，專屬性和重復性較好，精密度和準確度均符合中國藥典規(guī)定。綜上所述，建立的方法適用于該藥物的含量測定。其次，本次研究對該無載體納米藥物Ru-T隨后的細胞實驗和動物實驗等提供了依據(jù)，同時也可為無載體納米藥物的含量分析方法提供參考與思路。3.2展望目前，納米藥物的含量測定方法多采用高效液相色譜法[14-16]和紫外分光光度法[17-19]。測定部分納米藥物含量時需要涉及把封裝藥物與游離藥物分離，根據(jù)文獻報道，分離方法多采用超濾離心法、葡聚糖凝膠柱過濾法等[20-23]。納米藥物的研究和開發(fā)依然是當前研究的重點，伴隨著創(chuàng)新的納米藥物的出現(xiàn)，納米藥物的分析方法和技術也會進一步發(fā)展和創(chuàng)新。如何利用合理的分析方法對納米藥物進行安全、有效性的檢驗是需要深入研究和迫切解決的問題[23-26]。相信在未來，我們不僅能夠制造出安全有效的納米藥物，并且同時能夠建立出簡單方便而又精確的分析方法。參考文獻毛宗萬.納米技術在生物醫(yī)藥中的應用及展望[J].藥學進展,2019,43(5):321-323HuangL,ZhaoS,FangF,XuT,LanM,ZhangJ.Advancesandperspectivesincarrier-freenanodrugsforcancerchemo-monotherapyandcombinationtherapy.Biomaterials.2021Jan;268:120557.doi:10.1016/j.biomaterials.2020.120557.Epub2020Nov23.PMID:33260095.趙爽,張少芳,穆曉宇.納米藥物的研究進展[J].天津藥學,2020,32(2):57-61遲紅訓,王幸幸,梁景松.鈷(Ⅱ)與芳香氮堿金屬有機配合物的合成及熒光性能[J].沈陽化工大學學報,2014,28(02):111-114.GaoA,ChenB,GaoJ,ZhouF,SaeedM,HouB,LiY,YuH.SheddableProdrugVesiclesCombatingAdaptiveImmuneResistanceforImprovedPhotodynamicImmunotherapyofCancer.NanoLett.2020Jan8;20(1):353-362.doi:10.1021/acs.nanolett.9b04012.Epub2019Dec3.PMID:31793787.GadH,KoolmeisterT,JemthAS,EshtadS,JacquesSA,Str?mCE,SvenssonLM,SchultzN,Lundb?ckT,EinarsdottirBO,SalehA,G?ktürkC,BaranczewskiP,SvenssonR,BerntssonRP,GustafssonR,Str?mbergK,SanjivK,Jacques-CordonnierMC,DesrosesM,GustavssonAL,OlofssonR,JohanssonF,HomanEJ,LosevaO,Br?utigamL,JohanssonL,H?glundA,HagenkortA,PhamT,AltunM,GaugazFZ,VikingssonS,EversB,HenrikssonM,VallinKS,WallnerOA,Hammarstr?mLG,WiitaE,Alml?fI,KalderénC,AxelssonH,DjureinovicT,PuigvertJC,H?ggbladM,JeppssonF,MartensU,LundinC,LundgrenB,GranelliI,JensenAJ,ArturssonP,NilssonJA,StenmarkP,ScobieM,BerglundUW,HelledayT.MTH1inhibitioneradicatescancerbypreventingsanitationofthedNTPpool.Nature.2014Apr10;508(7495):215-21.doi:10.1038/nature13181.Epub2014Apr2.Erratumin:Nature.2017Apr26;544(7651):508.PMID:24695224.杜鳳華,閔旭紅,梅曉冬.MTH1抑制劑在癌癥治療中的研究進展[J].臨床肺科雜志,2019,24(8):1528-1531QiC,ChenY,JingQZ,WangXG.Preparationandcharacterizationofcatalase-loadedsolidlipidnanoparticlesprotectingenzymeagainstproteolysis.IntJMolSci.2011;12(7):4282-93.doi:10.3390/ijms12074282.Epub2011Jul4.PMID:21845078;PMCID:PMC3155351.李超,趙海旭,周凱翔,王志霞,羅萬和,謝書宇.HPLC法檢測替米考星納米內(nèi)服混飲劑含量的方法學研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2019,0(15):124-127王麗峰.高效液相色譜在中草藥質量控制中的應用[D].西南大學,2009.陳艷蕊.黃芪多糖、皂苷、黃酮、枸杞多糖和黃精多糖的閃式提取工藝及指紋圖譜的研究[D].華中科技大學,2011.國家藥典委員會.2020版中國藥典.[M].四部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020:480王花.博落回藥材中生物堿的分離分析研究[D].山西醫(yī)科大學,2021.DOI:10.27288/ki.gsxyu.2021.000373.吳碩文,李明璐,張啟迪等.HPLC法測定伊曲康唑納米乳中伊曲康唑的含量[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2017,No.535(19):281-284.DOI:10.13881/ki.hljxmsy.2017.1856.毛麗燕,鄔文珠,路文娟,趙剛.HPLC測定多烯紫杉醇納米粒包封率[J].食品與藥品,2018,20(3):194-197付麗娜,李偉澤,趙寧,李維鳳.HPLC法測定黃藤素納米柔性脂質體的含量及包封率[J].西北藥學雜志,2019,34(01):80-83.張慧輝,楊雪峰,胡建和,寧紅梅,范素輝.紫外分光光度法測定恩諾沙星納米乳含量方法的建立[J].廣東農(nóng)業(yè)科學,2013(3):92-94萬坤,孫立力,胡雪原,楊梅,張景勍.紫外分光光度法測定靶向修飾固體脂質納米粒中姜黃素的含量[J].激光雜志,2014,35(01):42-43.趙亞鑫,汪海洋,姚慶強.紫外分光光度法測定眼用固體脂質納米粒中氟比洛芬含量[J].濟寧醫(yī)學院學報,2015,38(05):375-377.趙暖暖,仵文英,張抗懷,王娜.HPLC法測定5-氟尿嘧啶納米粒的藥物包封率[J].藥物分析雜志,2014,34(05):939-942.DOI:10.16155/j.0254-1793.2014.05.008.張茜,SAHITOBenazir,李翎旭,彭麟,江善祥,郭大偉.UC-HPLC法測定替米考星納米結構脂質載體的包封率與載藥量[J].畜牧與獸醫(yī),2019,51(03):56-61.鄒東娜,張典瑞,劉向紅.HPLC法測定苦參堿白蛋白納米粒的包封率[J].藥物分析雜志,2008,28(01):93-96.管慶霞,華曉丹,張喜武,李秋紅,李偉男,趙宇巍.HPLC法測定馬錢子堿納米結構脂質載體的主藥含量及包封率[J].中國藥房,2015,26(21):2983-2986.耿志旺,何蘭,張啟明,楊永健.納米藥物粒度分析方法[J].藥學學報,2012,47(7):856-862GioriaS,CaputoF,UrbánP,MaguireCM,Bremer-HoffmannS,Prina-MelloA,CalzolaiL,MehnD.Areexistingstandardmethodssuitablefortheevaluationofnanomedicines:somecasestudies.Nanomedicine(Lond).2018Mar1;13(5):539-554.doi:10.2217/nnm-2017-0338.Epub2018Jan30.PMID:29381129.劉銀麗.納米藥物的質量控制研究[C]//《藥學服務與研究》雜志社.第六屆全國藥學服務與研究學術論壇論文集.[出版者不詳],2015:449-452.

納米藥物的分析方法研究摘要：納米藥物具有出色的靶向性，它們可以降低藥物向非目標器官或組織的分布，從而降低藥物的用藥劑量提升治療效率，減少對正常器官的副作用[1]。因此，在醫(yī)藥領域，納米藥物吸引了越來越多的關注。目前，納米藥物尤其在腫瘤治療方面具有較高的價值，并且已經(jīng)在臨床上取得了一定的成就[2,3]。納米藥物一般可分為兩類：一類是指通過納米制備技術把原料藥制備成納米顆粒；另一類是把合適的載體材料（如脂質體、膠束和微乳等）與原料藥結合，制成納米顆粒[4]。然而，納米藥物的制備和表征方法與傳統(tǒng)藥物存在顯著差異，加之其復雜的性質特征，在實際應用中存在較大的挑戰(zhàn)，因此納米藥物研究仍是一個較新的領域，尚需進一步探索和發(fā)展，以進一步完善納米藥物的表征、性質分析等方面的技術和方法[5]。一些監(jiān)管機構認為，粒徑分布、化學成分、包封率或載藥量、藥物釋放動力學等物理化學參數(shù)對于評估納米藥物制劑的質量、療效和安全性至關重要，因此應當加以重視[6]。因此，本文旨在對納米藥物的分析方法進行深入探索，通過查閱相關文獻，并對相關方法資料進行整理，探討了納米藥物的載藥量或包封率分析方法，希望為納米藥物進一步研究和開發(fā)提供參考。關鍵詞：納米藥物；載藥量；包封率；分析方法；納米藥物在生物醫(yī)藥領域得到了越來越廣泛的關注和應用。目前，許多有成果的納米藥物正處于臨床應用的轉化階段，全球市場趨勢表明該行業(yè)在未來幾年將持續(xù)增長，納米藥物的臨床轉化和隨后的商業(yè)化需要監(jiān)管機構開發(fā)新的標準或調整現(xiàn)有標準，以確保此類產(chǎn)品的質量、安全性和有效性[6]。同時，隨著研究的不斷深入，更復雜和創(chuàng)新的納米藥物的出現(xiàn)使其分析方法的建立和標準化成為一項重要的任務。雖然已經(jīng)有多種標準化方法來表征納米藥物的理化性質，但通常不適用于復雜和創(chuàng)新納米制劑。并且不同類型的納米藥物具有不同的性質，適用的分析方法也不同，因此，選擇合適的分析方法對各種納米藥物進行科學有效的質量控制是一個待解決的問題[7]。本文通過整理歸納相關資料和文獻，對可用于納米藥物的載藥量或包封率分析方法進行如下綜述。1納米藥物的分析方法納米藥物載藥量是載體結合或封裝的藥物與載體總量的比值，包封率是封裝的藥物與投料量的比值[8,9]。納米藥物的負載的效率以及載體結合或封裝的藥物與游離藥物的比例決定了產(chǎn)品的質量和生物活性，理想情況下載體應將藥物直接靶向遞送至病變細胞，故血液中的游離藥物是靶向不完美的標志。因此，納米藥物載藥量或包封率是藥物遞送系統(tǒng)的一個關鍵特性，也是納米藥物分析的一個重要參數(shù)。同時，納米技術的快速發(fā)展使得納米藥物的分析技術也在不斷創(chuàng)新。納米藥物的分析需要準確、科學的方法，以提升其質量控制水平，并為其應用和發(fā)展提供有力支持。然而，由于不同類型的納米藥物具有獨特的性質，因此需要針對性地選擇適用的分析方法。本文通過對多種可用于納米藥物載藥量或包封率分析的方法進行深入分析和比較，為制定納米藥物質量標準和選擇合適的檢驗方法提供了一些參考和借鑒。1.1納米載體藥物的分析方法納米載體藥物，即將藥物載入一定形式的納米載體中,如脂質體、納米膠束、納米粒、納米乳等[10]。脂質體是一種常見的納米載體藥物形式，也是在臨床轉化方面取得最大成功的一類納米藥物。脂質體由圍繞水室的層狀磷脂雙層組成，其成分可以改變，以控制靶向、分布、藥物輸送和毒性[11]。脂質體和游離藥物分離是該類藥物測量載藥量或包封率的關鍵[12]。一般分離封裝藥物和游離藥物的分離方法有：膜過濾（例如透析、超濾）、超速離心法、凝膠柱過濾法和液-液萃取離心超濾法等[13]。分離后，可采用特定的液相色譜方法并配合多種檢測技術（紫外-可見分光光度計、熒光、氣溶膠檢測器、質譜）進行定量測定[14-16]。相關方法如下：葡聚糖凝膠微柱-高效液相色譜法：管慶霞等采用葡聚糖凝膠微柱對游離藥物進行分離，再用高效液相色譜法測定主藥的含量從而計算包封率，結果表明分離效果較好且該方法方便，效率高[17]。超濾離心-高效液相色譜法：鄒東娜等[18]和張茜等[19]均采用超濾離心法來分離游離藥物，并使用HPLC法測定和計算包封率，該方法簡單易行，準確可靠。低速離心-高效液相色譜法：王雪婷等采用低速離心法成功分離姜黃素納米脂質體與未包載的姜黃素，該方法操作簡便，但在實驗前期試用薄膜透析法、凝膠柱色譜法、超速離心法都未能成功將姜黃素納米脂質體與未包載的姜黃素分離[20]。上述方法的缺陷在于離心時，可能會因為納米藥物的破損引起藥物釋放以及納米藥物未能完全沉淀等因素，影響含量的測定[21]。為了克服這些缺陷，分析型超速離心（AUC）方法被提出，該方法已被證明是一種快速而簡單的方法用于測量游離藥物和包封藥物的比率。分析超速離心法將分離、濃縮和檢測步驟結合到一個單獨的測量中，提高了總分析效率，降低了實驗復雜性。DoraMehn等[22]采用分析型超速離心法用于測量人類血清中阿霉素含量脂質體的藥物分布，實驗結果表明這種創(chuàng)新方法將大大有助于開發(fā)改進的方法，以解決在相關生物基質中表征納米醫(yī)學這一具有挑戰(zhàn)性的問題。Sarah

Skoczen等[23]開發(fā)了一種利用穩(wěn)定同位素示蹤劑的新型方法。該方法將穩(wěn)定同位素標記的藥物刺入待分析的血漿中，然后該藥物與結合到蛋白質和制劑組分的藥物平衡。通過超濾將游離藥物從血漿中分離出來，然后可以在超濾液中使用質譜法確定的標記與未標記游離藥物的比例進行明確定量。結果表明該方法準確性高，精密度好。NaokiItoh等[24]開發(fā)了一種簡單快捷的方法，該方法采用二氧化硅柱，通過高效液相色譜法測定納米藥物中封裝藥物的相對數(shù)量，結果顯示該方法簡便并可用于多種納米藥物的定量檢測。一種基于液相色譜的分析方法，用于量化藥物加載脂質體產(chǎn)品中的總離子、內(nèi)部和外部離子的方法被提出，Jiewei

Wu等采用了一種基于高效液相色譜的分析方法，使用荷電氣溶膠檢測（CAD）來量化銨和硫酸鹽的內(nèi)部和外部的離子濃度，為了量化總離子濃度，該過程使用了簡單的凍干-重組的技術；為了量化外部離子濃度，使用了簡單的離心過濾，該方法具有簡單的制備過程，并且離子回收效率高[25]。1.2無載體納米藥物的分析方法無載體納米藥物是基于非共價鍵的弱作用力（如：氫鍵、π-π堆積、疏水作用、靜電作用和范德華力等）自組裝形成的納米結構[26]。傳統(tǒng)的納米藥物通常裝載能力很低、載體可能存在全身毒性和生物降解等缺點[27]。無載體納米藥物與傳統(tǒng)的納米藥物相比，其具有無載體，高載藥量、低毒副作用、成本更低，合成方法簡便等特點[28]。不同的藥物采用的定量檢測方法不同，其方法需根據(jù)藥物的性質來決定。例如，杜倩采用紫外分光光度法對新吲哚菁綠/阿托伐醌無載體納米藥物中的藥物含量進行定量測定[29]。該方法具有操作簡便快捷，分析速度快等優(yōu)點。高效液相色譜法是一種常用于藥物含量測定的方法，其具有靈敏度高，專屬性好，方便快捷等優(yōu)點。龍玲采用高效液相色譜法對吲哚美辛/紫杉醇無載體納米藥物中的藥物含量進行定量測定[30]。Park,Joonyoung等利用高效液相色譜法測定納米晶體中紫杉醇的含量[31]。2總結納米技術的興起為癌癥治療開辟了新的視野[32]。因此，納米藥物的研究和開發(fā)仍是目前的熱點之一，可靠的分析方法將有利于納米藥物開發(fā)的臨床前階段，也有利于支持監(jiān)管機構評估藥物的質量和安全性。值得注意的是，隨著納米藥物研究的不斷深入，越來越多的復雜性和創(chuàng)新性納米藥物也將隨之出現(xiàn)，這些新型納米藥物具有更加多樣化的結構和功能，需要開發(fā)相應的分析方法來確保其藥效和安全性。與此同時，納米藥物的分析方法和技術的進一步發(fā)展和創(chuàng)新勢在必行。因此，如何使用合理的分析方法來建立納米藥物質量標準檢測是一個仍需要不斷深入研究和不斷完善的問題[33]。參考文獻趙爽,張少芳,穆曉宇.納米藥物的研究進展[J].天津藥學,2020,32(2):57-61DavisME,ChenZG,ShinDM.Nanoparticletherapeutics:anemergingtreatmentmodalityforcancer.NatRevDrugDiscov.2008Sep;7(9):771-82.doi:10.1038/nrd2614.PMID:18758474.SteichenSD,Caldorera-MooreM,PeppasNA.Areviewofcurrentnanoparticleandtargetingmoietiesforthedeliveryofcancertherapeutics.EurJPharmSci.2013Feb14;48(3):416-27.doi:10.1016/j.ejps.2012.12.006.Epub2012Dec20.PMID:23262059;PMCID:PMC3619023.劉君,許銀銀,李萌,錢海.納米藥物的研究進展[J].藥學與臨床研究,2020,28(1):51-55KaraosmanogluS,ZhouM,ShiB,ZhangX,WilliamsGR,ChenX.Carrier-freenanodrugsforsafeandeffectivecancertreatment.JControlRelease.2021Jan10;329:805-832.doi:10.1016/j.jconrel.2020.10.014.Epub2020Oct9.PMID:33045313.靳雅麗,楊德智,楊世穎,張麗,呂揚.納米藥物分析技術方法研究新進展[J].醫(yī)藥導報,2021,40(4):491-495耿志旺,何蘭,張啟明,楊永健.納米藥物粒度分析方法[J].藥學學報,2012,47(7):856-862OberoiHS,NukolovaNV,KabanovAV,BronichTK.Nanocarriersfordeliveryofplatinumanticancerdrugs.AdvDrugDelivRev.2013Nov;65(13-14):1667-85.doi:10.1016/j.addr.2013.09.014.Epub2013Oct8.PMID:24113520;PMCID:PMC4197009.鄒東娜,張典瑞,劉向紅.HPLC法測定苦參堿白蛋白納米粒的包封率[J].藥物分析雜志,2008,28(01):93-96.高彩芳,夏加璇,朱穎,任宏偉,洪超,陸偉根,王建新.納米技術在改善中藥有效成分成藥性中的應用[J].中草藥,2018,49(12):2754-2762KnudsenKB,NorthevedH,KumarPE,PerminA,GjettingT,AndresenTL,LarsenS,WegenerKM,LykkesfeldtJ,JantzenK,LoftS,M?llerP,RoursgaardM.Invivotoxicityofcationicmicellesandliposomes.Nanomedicine.2015Feb;11(2):467-77.doi:10.1016/j.nano.2014.08.004.Epub2014Aug25.PMID:25168934.ZununiVahedS,SalehiR,DavaranS,SharifiS.Liposome-baseddrugco-deliverysystemsincancercells.MaterSciEngCMaterBiolAppl.2017Feb1;71:1327-1341.doi:10.1016/j.msec.2016.11.073.Epub2016Nov23.Erratumin:MaterSciEngCMaterBiolAppl.2018Feb1;83:247.PMID:27987688.Ambardekar,V.,Stern,S.(2015).NBCDPharmacokineticsandBioanalyticalMethodstoMeasureDrugRelease.In:Crommelin,D.,deVlieger,J.(eds)Non-BiologicalComplexDrugs.AAPSAdvancesinthePharmaceuticalSciencesSeries,vol20.Springer,Cham./10.1007/978-3-319-16241-6_8GioriaS,CaputoF,UrbánP,MaguireCM,Bremer-HoffmannS,Prina-MelloA,CalzolaiL,MehnD.Areexistingstandardmethodssuitablefortheevaluationofnanomedicines:somecasestudies.Nanomedicine(Lond).2018Mar1;13(5):539-554.doi:10.2217/nnm-2017-0338.Epub2018Jan30.PMID:29381129.Gómez-HensA,Fernández-RomeroJM.Analyticalmethodsforthecontrolofliposomaldeliverysystems.

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