熒光顯微鏡的基本原理

關(guān)于熒光顯微鏡的基本原理光學(xué)顯微鏡的基本參數(shù)主要技術(shù)參數(shù)數(shù)值孔徑NA第2頁(yè),共14頁(yè)，2024年2月25日，星期天第3頁(yè),共14頁(yè)，2024年2月25日，星期天熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)：

某些物質(zhì)經(jīng)一定波長(zhǎng)的光（如紫外光）照射后，物質(zhì)中的分子被激活，吸收能量后躍遷至激發(fā)態(tài)；當(dāng)其從激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)時(shí)，所吸收的能量除部分轉(zhuǎn)化為熱量或用于光化學(xué)反應(yīng)外，其余較大部分則以光能形式輻射出來(lái)，由于能量沒(méi)能全以光的形式輻射出來(lái)，故所輻射出的光的波長(zhǎng)比激發(fā)光的要長(zhǎng)，這種波長(zhǎng)長(zhǎng)于激發(fā)光的可見(jiàn)光部就是熒光(fluorescence)。所謂熒光就是某些物質(zhì)在一定波長(zhǎng)光（如紫外光）的照射下、在極短時(shí)間內(nèi)所發(fā)出的比照射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的可見(jiàn)光。第4頁(yè),共14頁(yè)，2024年2月25日，星期天第5頁(yè),共14頁(yè)，2024年2月25日，星期天第6頁(yè),共14頁(yè)，2024年2月25日，星期天Figure9-14MolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)Themaximumexcitationandemission

wavelengthsofseveralcommonlyusedfluorescentprobesareshowninrelationtothecorrespondingcolorsofthespectrum.第7頁(yè),共14頁(yè)，2024年2月25日，星期天第8頁(yè),共14頁(yè)，2024年2月25日，星期天熒光顯微鏡的組成1、光源：一般采用高壓汞燈2、濾色系統(tǒng)：由激發(fā)濾板和壓制濾板組成a、激發(fā)濾板：提供一定范圍的激發(fā)光b、壓制濾板：完全阻擋激發(fā)光通過(guò)，提供相應(yīng)濾長(zhǎng)范圍的熒光3、反光鏡：一般采用平面反光鏡4、聚光鏡：用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成5、物鏡和目鏡第9頁(yè),共14頁(yè)，2024年2月25日，星期天Theopticalsystemofafluorescencemicroscope.Afiltersetconsistsoftwobarrierfilters(1and3)andadichroicmirror(beam-splitting2)第10頁(yè),共14頁(yè)，2024年2月25日，星期天第11頁(yè),共14頁(yè)，2024年2月25日，星期天熒光染料的使用1、吖啶橙：吖啶橙是最經(jīng)典的靈敏的熒光染料，它可對(duì)細(xì)胞中的DNA和RNA同時(shí)染色而顯示不同顏色的熒光，DNA呈綠色熒光，RNA呈橙紅色熒光。2、溴化乙錠（EB）:染色DNA和RNA。3、熒光素雙醋酸酯(FDA)：FAD本身無(wú)熒光,無(wú)極性,可透過(guò)完整的原生質(zhì)膜。一旦進(jìn)入原生質(zhì)體后,由于受到酯酶分解而產(chǎn)生具有熒光的極性物質(zhì)熒光素。4、熒光染料Ho33342和羅丹明123:Ho33342能與細(xì)胞中DNA進(jìn)行特異的結(jié)合，羅丹明123能與線粒體進(jìn)行特異的結(jié)合。第12頁(yè),共14頁(yè)，2024年2月25日，星期天熒光組化實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題1、每種熒光染料，均有自己的最適pH值，此時(shí)熒光最強(qiáng)。當(dāng)pH改變時(shí)，不僅熒光強(qiáng)度減弱，而且波長(zhǎng)將有所改變，因此熒光檢測(cè)時(shí)要在一定的pH值的緩沖液中進(jìn)行。2、一放熒光染色在20。C以下時(shí)熒光比較穩(wěn)定，溫度升高常出現(xiàn)溫度猝滅。3、在熒光觀察中，常因激發(fā)光的增強(qiáng)而使樣品熒光很快衰竭，造成觀察和照相困難。為此最好用能量小的長(zhǎng)波長(zhǎng)光進(jìn)行觀察，需照相時(shí)再適當(dāng)增強(qiáng)激發(fā)光。4、一般熒光染液的濃度在萬(wàn)分之一以下，甚至億萬(wàn)分之一，也能使標(biāo)本著色。在一定的限度內(nèi)，熒光強(qiáng)度可隨熒光素的濃度增加而增強(qiáng)，但超過(guò)限度，熒光強(qiáng)度反而下降，這是由于熒光分子間的