2.2.2動物細胞融合技術與單克隆抗體課件-高二下學期生物人教版選擇性必修33

2.2動物細胞工程二、動物細胞融合技術與單克隆抗體什么是動物細胞融合技術？單克隆抗體是如何制備的?在臨床上有哪些應用？本節(jié)聚焦12A細胞B細胞正在融合的原生質體再生出細胞壁高Ca2+—高pH融合法等脫分化再分化移栽植物細胞融合植物組織培養(yǎng)雜種植株愈傷組織A原生質體B原生質體移栽后的植株植物體細胞雜交技術植物體細胞雜交技術的優(yōu)勢：打破生殖隔離，實現遠緣雜交育種，培育出新的作物類型。

回顧舊知實驗：人——鼠細胞熒光標記融合實驗融合細胞細胞融合37℃40min正在融合的細胞紅色熒光染料標記膜蛋白綠色熒光染料標記膜蛋白人細胞小鼠細胞有沒有技術能讓不同種動物的體細胞雜交，培育出集不同細胞的優(yōu)勢于一身的動物細胞呢？

回顧舊知1.概念：2.原理：3.融合方法：4.意義：使兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的技術。細胞膜的流動性PEG融合法、電融合法和滅活病毒誘導法等。（化學法、

物理法、

生物法

）突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能。已成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段，特別是雜交瘤技術，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。動物細胞融合特有雜交細胞：具有原來兩個或多個細胞的遺傳信息01動物細胞融合技術與誘導植物原生質體融合的方法一樣：P37單核

滅活是指用物理或化學手段使病毒或細菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結構。滅活病毒誘導細胞融合的原理是：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞互相凝聚，細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。動物細胞融合實質及完成的標志：細胞核的融合

相關信息2024/4/5

19世紀30年代，科學家曾在患肺結核、天花和麻疹等疾病的病人的病理組織中觀察到多核細胞。如何解釋這一現象？

病人體內的病毒等誘導多個體細胞融合形成了多核細胞。注意說明動物細胞融合與受精作用的區(qū)別（1）受精作用：是在同種生物之間進行的，精子與卵細胞的融合不需要任何誘導劑，受精卵內具備同種生物的兩個親本的遺傳物質。（2）動物細胞融合可在不同物種間進行，由于物種間存在生殖隔離，所以自然條件下不能融合成雜交細胞，必須有誘導劑才能融合。形成的雜交細胞具備兩個親本細胞的遺傳物質，從而體現兩個親本的遺傳特性。植物體細胞雜交動物細胞融合原理細胞融合前的處理方法誘導細胞融合的方法細胞融合成功的標志主要用途意義細胞膜具有一定的流動性、植物細胞的全能性細胞膜具有一定的流動性用果膠酶和纖維素酶去除細胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細胞分散成單個細胞物理法：電融合法、離心法；化學法：聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導法再生出細胞壁細胞核的融合獲得完整的雜種植株主要用于制造單克隆抗體打破生殖隔離，實現遠緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能2024/4/5動物細胞融合和植物體細胞雜交的比較《金》P55例11.抗體是什么？由什么細胞分泌產生？早期獲得抗體的方法及該方法的缺點?2.在體外培養(yǎng)條件下，如何讓一個B淋巴細胞無限增殖?3.給小鼠注射特定抗原的目的是什么？哪里收集B細胞？4.從小鼠體內提取的B淋巴細胞只有一種嗎？為什么？5.誘導融合后有多少類雜交細胞（只考慮兩兩融合）？6.兩次篩選的目的和手段分別是什么？7.如何大規(guī)模進行培養(yǎng)得到大量的單克隆抗體？單克隆抗體的制備二自主學習P48-P49，小組討論，解決下列問題：2.早期獲得抗體的方法向動物體內反復注射某種抗原→從動物血清中分離所需抗體產量低、純度低、特異性差缺點：抗原

反復注射動物從動物的血清中分離抗體單克隆抗體的制備二1.抗體的本質是什么？如何產生的？漿細胞抗體(蛋白質）抗原B細胞激活增殖、分化?若要得到大量的單一抗體，我們該如何去做？3.制造單克隆抗體理論基礎：每一個B細胞只分泌一種特異性抗體。B淋巴細胞不能無限增殖

克隆單一的B淋巴細胞，得到的細胞群就能分泌出化學性質單一、特異性強的抗體制備思路：困難：單克隆抗體的制備二克隆單克隆抗體一個已免疫的B淋巴細胞體外培養(yǎng)，不能無限增殖化學性質單一、特異性強分泌英國米爾斯坦德國科勒

由于發(fā)明了單克隆抗體的制備技術，米爾斯坦和科勒于1984年獲得了諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。大膽設想：B淋巴細胞骨髓瘤細胞（能產生抗體）（能大量增殖）雜交細胞（既能大量增殖，又能產生特定抗體）單克隆抗體的制備二單克隆抗體制備的過程：注射特定的抗原培養(yǎng)骨髓瘤細胞從脾中提取B淋巴細胞多種骨髓瘤細胞誘導融合將骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合①不產生抗體的B細胞：B細胞和記憶B細胞②產生B1、B2、B3等不同抗體的B細胞(漿細胞)目的：

獲得能產生相應抗體的B淋巴細胞融合體系中有多少種類型的細胞？未融合的細胞B淋巴細胞相互融合的細胞骨髓瘤細胞相互融合的細胞雜交瘤細胞√單克隆抗體制備的過程：多種雜交細胞未融合的細胞瘤-瘤、B-B、第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基在該培養(yǎng)基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長雜交瘤細胞（既能迅速大量增殖，又能產生抗體）第二次篩選：克隆化培養(yǎng)、抗體檢測（多次篩選）抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞用96孔板培養(yǎng)和篩選雜交瘤細胞（每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細胞）克隆化培養(yǎng)獲得能產生所需抗體的雜交瘤細胞分泌的抗體能與特定抗原結合瘤-記B、瘤-B1、瘤-B2、瘤-B3…注射到小鼠腹腔內體外培養(yǎng)單克隆抗體從細胞培養(yǎng)液中提取從小鼠腹水中提取能產生所需抗體的雜交瘤細胞單克隆抗體制備的過程：單克隆抗體的優(yōu)點：特異性強、靈敏度高、可大量制備單個雜交瘤細胞增殖產生高度純一的抗體2.制備過程.&1&

.（二）單克隆抗體及其應用3.制備單克隆抗體的過程：動物細胞融合（原理：細胞膜的流動性）

*不是為了得到抗體！第一次篩選：獲得雜交瘤細胞

動物細胞培養(yǎng)（原理：細胞增殖）第二次篩選：獲得足夠數量的能分泌所需抗體的細胞雜交瘤細胞的特點:優(yōu)點：能準確地識別抗原的細微差異，與特定抗原發(fā)生特異性結合，并且可以大量制備應用到的技術：原理：

細胞膜具有一定的流動性、細胞增殖多種雜交細胞及未融合的細胞誘導

融合小鼠骨髓瘤細胞多種B淋巴細胞給小鼠注射特定抗原提取雜交瘤細胞第一次篩選用特定的選擇性培養(yǎng)基第二次篩選足夠數量的能產生所需抗體的雜交瘤細胞體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔大量單克隆抗體克隆化培養(yǎng)、抗體檢測（既能迅速大量增殖，又能產生抗體）（產生抗體）（能無限增殖）從腹腔液中提取從培養(yǎng)液中提?。蛇M行多次）動物細胞融合動物細胞培養(yǎng)

歸納向小鼠注射特定的抗原培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細胞B淋巴細胞骨髓瘤細胞多種細胞多種雜交瘤細胞能分泌所需抗體的雜交瘤細胞第一次篩選：選擇培養(yǎng)基第二次篩選：克隆化培養(yǎng)+專一抗體檢測注射到小鼠腹腔內增殖體外培養(yǎng)單克隆抗體融合★單克隆抗體制備的過程（既能迅速大量增殖，又能產生抗體）（特異性強、靈敏度高、可大量制備）《金》P56例2、例3；P576、12、14第一次篩選第二次篩選原因方法原理結果誘導融合后得到的細胞中，除雜交瘤細胞之外，還有未融合的親本細胞，也有融合的具有同種核的細胞由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經第一次篩選之后獲得的雜交瘤細胞中有能產生其他抗體的細胞用特定的選擇培養(yǎng)基進行篩選用96孔板培養(yǎng)，在每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細胞的情況下，進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測（進行多次篩選）獲得雜交瘤細胞獲得能產生所需抗體的雜交瘤細胞兩次篩選的比較只有融合的雜交瘤細胞可以生長，其他細胞死亡細胞增殖、抗原抗體特異性結合

第一次篩選的雜交瘤細胞并非都是能分泌所需抗體的細胞，通常用“有限稀釋法”來進一步選擇。將雜交瘤細胞稀釋，用多孔培養(yǎng)板培養(yǎng)細胞，在每孔只有一個雜交瘤細胞的情況下，開始培養(yǎng)，讓其增殖。然后檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體（常用酶聯免疫吸附試驗法），那些上清液可與特定抗原結合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細胞還不能保證是來自單個細胞，挑選陽性孔的細胞繼續(xù)進行有限稀釋，一般需進行3～4次，直至確信每個孔中增殖的細胞為單克隆細胞。該過程即為雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)?！暗诙魏Y選”原理知識延伸克隆化培養(yǎng)多孔培養(yǎng)板抗體檢測稀釋單個細胞克隆化培養(yǎng)專一抗體檢驗呈陽性的細胞篩選原因：由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經第一次篩選獲得的雜交瘤細胞中存在產生其他抗體的細胞。原理：抗原——抗體特異性結合【原理】將雜交瘤細胞培養(yǎng)液稀釋后滴入多孔板，如果稀釋度足夠高，多孔板的一個孔里就可能只有1個雜交瘤細胞，培養(yǎng)之后(即克隆化培養(yǎng))，用標記的抗原檢測每個小孔上清液里是否含有我們需要的特異性的抗體（抗原抗體能結合即為陽性孔）。這樣經過多次克隆化培養(yǎng)以及有限稀釋法的篩選，就能選出需要的那種雜交瘤細胞（AB3）。第二次篩選（1）篩選原因：由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經第一次篩選獲得的雜交瘤細胞中存在產生其他抗體的細胞。（2）篩選方法：用多孔培養(yǎng)皿培養(yǎng)，在每個孔內只有一個雜交瘤細胞的情況下開始克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經多次篩選得到能產生特異性抗體的細胞群。（3）篩選目的：得到能分泌所需抗體的雜交瘤細胞。雜交瘤細胞多孔培養(yǎng)板克隆化培養(yǎng)和抗體檢測篩選抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞既能迅速大量增殖又能產生特異性抗體注意說明陽性孔將雜交瘤細胞群稀釋，約每孔1個細胞進行培養(yǎng)（克隆化培養(yǎng)）一段時間后，檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體上清液可與特定抗原結合的培養(yǎng)孔為陽性孔多孔細胞培養(yǎng)板抗體檢測板分泌抗體能跟特定抗原結合的細胞即為所需雜交瘤細胞“第二次篩選”原理知識延伸《報》40期P38

思考·討論

單克隆抗體的應用資料1用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”。在妊娠第8天就可以作出診斷，這比原來的診斷方法提前了10d左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準確率在90%以上。①作為診斷試劑——最廣泛應用

思考·討論

單克隆抗體的應用討論：1.ADC的抗體和藥物各具有什么作用？資料2使用高效的細胞毒素類藥物進行化療可以有效殺傷腫瘤細胞。但細胞毒素沒有特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時還會對健康細胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應用。抗體-藥物偶聯物（ADC）通過將細胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結合，實現了對腫瘤細胞的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物(如細胞毒素)三部分組成，它的作用機制如下圖所示。抗體：靶向運輸藥物，即通過特異性結合靶細胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細胞。藥物：發(fā)揮治療效應，如殺傷靶細胞ADC(2)用于運載藥物

思考·討論

單克隆抗體的應用2.除了細胞毒素，還有哪些物質理論上可以作為ADC偶聯的藥物？3.單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應用上各具有什么優(yōu)勢？①可以用放射性同位素標記單克隆抗體進行靶向放療；②一些作用于細胞信號轉導通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結合進行治療。①檢測的特異性和靈敏度大大提高；有利于控制產品的質量和標準化生產診斷試劑盒；②ADC能夠協同發(fā)揮抗體特異性識別的靶向作用和細胞毒素對腫瘤細胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點清楚、毒副作用小等優(yōu)點單克隆抗體的應用三單克隆抗體能準確地識別抗原的細微差異，與特定抗原發(fā)生特異性結合，并且可以大量制備。

利用同位素或熒光標記的單克隆抗體在特定組織中成像的技術，可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病。1.單克隆抗體的優(yōu)點：2.