細菌類生物農(nóng)藥

關(guān)于細菌類生物農(nóng)藥一、細菌與昆蟲的細菌性病害細菌屬原核生物界細菌門原核生物的特點：

1.擬核由雙鏈DNA構(gòu)成，也是基因載體，染色體沒有結(jié)合蛋白。2.沒有復(fù)雜折疊、分割成不同原生質(zhì)單元的膜系統(tǒng)3.70S的核蛋白體分布于細胞之中，第2頁,共51頁，2024年2月25日，星期天原核與真核細胞的區(qū)別第3頁,共51頁，2024年2月25日，星期天附：古細菌（archaebacteria）

具有原核生物的某些特征，無核膜及內(nèi)膜系統(tǒng)；也有真核生物的特征，甲硫氨酸起始蛋白質(zhì)的合成、核糖體對氯霉素不敏感、RNA聚合酶和真核細胞的相似、DNA具有內(nèi)含子并結(jié)合組蛋白。此外，細胞膜中的脂類是不可皂化的，細胞壁不含肽聚糖。生活在極端環(huán)境中，如：產(chǎn)甲烷菌、極端嗜鹽菌、嗜熱嗜酸菌。第4頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、細菌性感染昆蟲后的癥狀特點：昆蟲活動力降低、食欲減退、口腔和肛門周圍有排泄物病原侵入后導(dǎo)致敗血癥；蟲體死亡后，顏色加深，迅速變?yōu)楹稚蚝谏?，部分蟲體軟化腐爛。死后蟲體一般都有臭味第5頁,共51頁，2024年2月25日，星期天2、細菌類生物農(nóng)藥的類群目前報道的細菌有100種，主要分布在芽孢桿菌科（Bacillaceae）芽孢桿菌屬（Bacillus）、梭狀芽孢桿菌屬（Clostidium）；腸桿菌科（Enterobacteriaceae）沙雷氏菌屬（Serratia）、變形桿菌屬（Proteus）、腸桿菌屬（Enterobacter），弧菌科（Vibrionaceae）氣單胞菌屬（Areomonas）；假單胞菌科（Pseudomonadaceae）假單胞菌屬（Pseudomonas）第6頁,共51頁，2024年2月25日，星期天鏈球菌科（Streptococcaceae）鏈球菌屬（Streptococus）微球菌屬（Micrococus）立克次氏體（Rickettisaceae）沃爾巴立克次氏體屬（Woerbachia）立克次氏小體屬（Rickettisella）枝（支）原體目（Mycoplasmatales）螺屬支原體（Spiroplasma）第7頁,共51頁，2024年2月25日，星期天3殺蟲細菌報道的種類芽孢桿菌屬：(1)蘇云金桿菌（B.thuringiensis）1901日本石渡首次分離，定義為猝倒桿菌，1911年Beliner從德國的蘇云金地區(qū)的地中海粉斑螟中分離得到產(chǎn)伴胞晶體的芽孢桿菌。1938年第一個生物農(nóng)藥制劑1953年人們認識到伴胞晶體的功能，之后是β毒素第8頁,共51頁，2024年2月25日，星期天第9頁,共51頁，2024年2月25日，星期天第10頁,共51頁，2024年2月25日，星期天(2)蘇云金桿菌的分類根據(jù)鞭毛抗原(H)，整體抗原（O抗原），將蘇云金桿菌分為70個血清型，80個變種

有些菌如140，CT-43等無鞭毛，故無H抗原，則用O抗原鑒定。新H型培養(yǎng)體郵寄到Bt國際咨詢中心H.deBarjac博士(法國)，由她建議新H型編號。她自1961年即為巴斯德研究所昆蟲病原細菌領(lǐng)導(dǎo)人，該中心亦是WHO昆蟲病原細菌參考中心，目前保存有3500株芽孢桿菌，由于在Bt血清鑒定及Bti分離鑒定等方面作出突出貢獻，我國分離了近26個亞種，近20個血清型第11頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

命名蘇云金芽胞桿菌新亞種的命名主要是根據(jù)以下四條:(1)采集地:如蘇云金亞種、肯尼亞亞種、加拿大亞種、以色列亞種、九州亞種、東北亞種(九州和東北為日本省名)、云南亞種、武漢亞種、華中亞種、山東亞種等。

(2)根據(jù)寄主蟲名。如蠟螟亞種、玉米螟亞種、松毛蟲亞種等。

(3)根據(jù)分離者名字。如Kurstak、Thompson、Morrison等。

(4)根據(jù)病癥進行命名。如猝倒亞種、亞毒亞種、殺蟲亞種等。

第12頁,共51頁，2024年2月25日，星期天（2）蘇云金桿菌的生長與培養(yǎng)生長過程：芽孢期、營養(yǎng)體期（產(chǎn)生外毒素）：2－4小時形成營養(yǎng)體，4－6h分裂，6－8小時進入對數(shù)生長期。孢子囊時期：生長后期開始形成芽孢，并形成與晶體形成有關(guān)的蛋白酶第13頁,共51頁，2024年2月25日，星期天生長條件：生長條件要求不高，氨基酸對生長有較大影響，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸對生長重要，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸對猝倒亞種有生長促進作用絲氨酸對菌體生長有抑制作用C、N、P的比例對菌體生長有很大影響在紫外或陽光下，易失活，第14頁,共51頁，2024年2月25日，星期天蘇云金桿菌毒素α-外毒素：又稱卵磷酯酶或磷酸酯酶C，是一種對昆蟲腸道有破壞作用的酶。β-外毒素：又稱熱穩(wěn)定外毒素，耐熱毒素，它是一種腺嘌呤核苷酸物質(zhì)，

δ-內(nèi)毒素

又稱晶體毒素。它是一種毒原（protoxin）或稱前毒素，須經(jīng)敏感昆蟲腸道蛋白酶消化后，或在堿性條件下由蛋白酶消化或酶解才釋放出對昆蟲有毒力的較小分子量的毒蛋白。

第15頁,共51頁，2024年2月25日，星期天（3）殺蟲晶體蛋白（δ

－內(nèi)毒素）殺蟲晶體蛋白的結(jié)構(gòu)與功能殺蟲晶體蛋白是一種堿性蛋白，每一種殺蟲晶體蛋白有其專一性晶體蛋白可以根據(jù)大小分為129-132kD；65-78kD；25-28kD根據(jù)晶體蛋白氨基酸序列的相似性和作用范圍分為4種類型，I：鱗翅目；II鱗翅目、雙翅目；III鞘翅目、IV雙翅目第16頁,共51頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共51頁，2024年2月25日，星期天C端為親水性端，功能在于維持晶體蛋白的空間構(gòu)相；含有β－折疊的二級結(jié)構(gòu)，N端為疏水端，與晶體蛋白－腸璧細胞的親和性有關(guān)；含有一個α－螺旋的二級結(jié)構(gòu)第18頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一般認為結(jié)構(gòu)域Ⅰ參與孔道的形成,結(jié)構(gòu)域Ⅱ決定毒素與受體的特異性結(jié)合,結(jié)構(gòu)域Ⅲ主要調(diào)節(jié)毒素的活性。晶體蛋白一般分為3個結(jié)構(gòu)域第19頁,共51頁，2024年2月25日，星期天GeneProteinSubspecies(strain)

ActivitySpectrumcryICryICryI

kurstaki(HD-1),aizawai,sottoLepidoptera

cryII

CryII

CryII

kurstaki(HD-1),kurstaki(HD-263)

LepidopteraandDiptera(mosquitoes)

CryⅢA

CryIIIAtenebrionis

Coleoptera(chrysomelids)cryⅢBCryIIIB

JaponensisColeoptera(scarabaeids)

cryIVCryIVisraelensisDiptera(mosquitoandblackflies)CryVCryVColeoptera-andLepidoptera-specific

第20頁,共51頁，2024年2月25日，星期天回顧微生物農(nóng)藥的概念按照功能作用分類按有效成分分類，各代表種微生物農(nóng)藥的特點細菌性農(nóng)藥：蘇云金芽孢桿菌第21頁,共51頁，2024年2月25日，星期天殺蟲晶體蛋白的殺蟲機理一般認為殺蟲晶體蛋白殺死昆蟲的機理為:1)晶體在昆蟲中腸內(nèi)的溶解;2)中腸蛋白酶的降解;3)中腸膜受體與毒蛋白的結(jié)合;4)毒蛋白插入中腸細胞表層形成離子通道,使敏感細胞的滲透平衡破壞,導(dǎo)致腸體自溶。第22頁,共51頁，2024年2月25日，星期天作用過程：晶體蛋白一般以毒蛋白源的形式存在，在堿性蛋白酶或糜（胰）蛋白酶的作用下，分解為60-80kD的蛋白，改變?yōu)榫哂袣⑾x活性的毒蛋白。第23頁,共51頁，2024年2月25日，星期天第24頁,共51頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共51頁，2024年2月25日，星期天δ-內(nèi)毒素對昆蟲的毒害主要是胃腸毒作用，因此，必須由敏感昆蟲吞食蘇云金芽孢桿菌的δ-內(nèi)毒素和芽孢后才能生效。它們感染的主要途徑是：從口腔經(jīng)食道、嗉囊而至中腸；破壞中腸后，細菌侵入體腔，使血液PH發(fā)生變化；菌體進一步繁殖后就引起幼蟲敗血癥及全身癱瘓而致死亡。第26頁,共51頁，2024年2月25日，星期天β-外毒素的毒效比δ-內(nèi)毒素要低，而且它的作用僅在昆蟲脫皮或變態(tài)時可以明顯看到，這種毒素可殺死多種昆蟲的幼蟲或使幼蟲發(fā)育不正常，蟲體某些部分殘缺不全等。例如，家蠅3齡幼蟲對這種毒素非常敏感，感染3天后可引起幼蟲脫皮時死亡或造成獨特的致病癥狀，使幼蟲發(fā)育受到明顯的影響，如出現(xiàn)半化蛹（上部是幼蟲，下部是蛹）、畸形蛹、不羽化蛹，以及形成畸形的成蟲，包括殘缺翅、窄而光的腹部、上唇萎縮等現(xiàn)象。第27頁,共51頁，2024年2月25日，星期天毒蛋白的基因的克隆與利用1991年,Carrize等首次將技術(shù)用于殺蟲晶體蛋白基因的鑒定和殺蟲活性的預(yù)測，根據(jù)當時已公布的基因序列設(shè)計了12條特異引物,并根據(jù)鑒定的基因?qū)甑臍⑾x活性進行預(yù)測,預(yù)測的結(jié)果與實際生測的結(jié)果相同。1993年,淺野真一郎根據(jù)cry基因的保守區(qū)序列設(shè)計了寡核苷酸引物,擴增后,用限制酶消化,根據(jù)酶切片段的長度差異即可鑒定cryIIA，cryIIB基因，第28頁,共51頁，2024年2月25日，星期天1993，Brousseau和Bourque在總結(jié)前人基礎(chǔ)上創(chuàng)建了RAPD-方法,1996年,Kou分別建立了PCR－RFLP和復(fù)合引物的鑒定方法。1997年,宋福平也通過此方法進行了一些研究工作；截止2001年5月,全世界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)200多種殺蟲晶體蛋白基因第29頁,共51頁，2024年2月25日，星期天該技術(shù)由Grodzicker等于1974年創(chuàng)立。特定生物類型的基因組DNA經(jīng)某一種限制性內(nèi)切酶完全酶解后，會產(chǎn)生分子量不同的同源等位片段，或稱限制性等位片段。RFLP標記技術(shù)的基本原理就是通過電泳的方法分離和檢測這些片段。凡是可以引起酶解位點變異的突變，如點突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點）和一段DNA的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點間的長度發(fā)生變化）等均可導(dǎo)致限制性等位片段的變化，從而產(chǎn)生RFLP。

Restriction

fragment

length

polymorphism補充1：第30頁,共51頁，2024年2月25日，星期天RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)由Williams等于1990年創(chuàng)立。其基本原理與PCR技術(shù)一致。

PCR(Polymerase

chain

reaction

)技術(shù)是一種體外快速擴增特異基因或DNA序列的方法，由Mullis等于1985年首創(chuàng)。

補充2：第31頁,共51頁，2024年2月25日，星期天蘇云金桿菌其他殺蟲蛋白迄今,蘇云金芽胞桿菌已發(fā)現(xiàn)有十幾種生物活性成分，如輔助蛋白可以有利于提高晶體蛋白的殺蟲活性。如雙效菌素(zwitternicinA)除具有增效蘇云金芽胞桿菌的殺蟲活性外,還具有抑制疫霉和腐霉的生長作用,可用于防治植物病原菌病害的目的

存在于蘇云金芽胞桿菌細胞內(nèi)的自身誘導(dǎo)物抑制蛋白(autoinducerinhibitor）可以抑制植物病原菌細胞間信息傳遞的關(guān)鍵分子，達到降低病原菌毒素基因表達的水平,避免植物致病的產(chǎn)生

幾丁質(zhì)酶第32頁,共51頁，2024年2月25日，星期天VIP蛋白（(vegetativeinsecticidialprotein）營養(yǎng)期殺蟲蛋白已被視為蘇云金芽胞桿菌的第二代殺蟲蛋白.但目前對營養(yǎng)期殺蟲蛋白的了解還遠不及殺蟲晶體蛋白。蛋白的殺蟲活性高Vip3A對小地老虎毒殺力比cry1A高260倍，對具有（殺蟲晶體蛋白）抗性的昆蟲有很好的療效。第33頁,共51頁，2024年2月25日，星期天殺蟲基因的應(yīng)用1多基因－復(fù)合殺蟲蛋白基因工程菌的構(gòu)建2轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建第34頁,共51頁，2024年2月25日，星期天蘇云金桿菌發(fā)酵工藝1.發(fā)酵工藝一般流程原料→滅菌→微生物培養(yǎng)→濃縮→晶體蛋白的分離→活性測定菌種2.發(fā)酵培養(yǎng)基：豆餅粉2.5,淀粉2.0,酵母粉2.0,玉米漿2.0,添加劑Ⅰ號0.1,葡萄糖1.0,KH2PO40.3,CaCO30.1,CaCl20.05,MgCl20.01,CuCl20.005,ZnSO40.002,CoCO30.005

第35頁,共51頁，2024年2月25日，星期天3.培養(yǎng)條件溫度：28-30，通氣量：1:0.5~11第36頁,共51頁，2024年2月25日，星期天固體發(fā)酵工藝第37頁,共51頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共51頁，2024年2月25日，星期天蘇云金芽孢桿菌制劑劑型：粉劑，懸浮劑生產(chǎn)廠家：武漢科諾，揚州綠源，重慶聚立信生物工程有限公司（3000t）山西益爾生物制品有限公司（600t）山東龍口格林生物制品有限公司

標準：1964年：在倫敦召開的蘇云金桿菌的分析與鑒定會議提出Lc50和標準品的使用1966年：在荷蘭，巴斯德研究院用E-61為標準制劑，效價標準為1000IU/mg第39頁,共51頁，2024年2月25日，星期天我國Bt殺蟲劑的質(zhì)量檢測技術(shù)已基本與國際接軌，現(xiàn)已分別建立了以棉鈴蟲為試蟲和以小菜蛾為試蟲的生物測定方法，重現(xiàn)性都很好，變異系數(shù)小于20%。1995年6月，我國農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所以生物測定為基礎(chǔ)下達了我國Bt殺蟲劑的部頒標準。第40頁,共51頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)量標準測定死亡率：計算校正死亡率＝(T-C/1-C)×100%

轉(zhuǎn)換成Lc50

轉(zhuǎn)換為效價：樣品效價＝p×S/YP:標準品效價S:標準品Lc50Y:樣品Lc50第41頁,共51頁，2024年2月25日，星期天球形芽孢桿菌（B.sephaericus）（防治雙翅目昆蟲）日本金龜子芽孢桿菌（B.popilliae）（鞘翅目昆蟲）緩病芽孢桿菌桿菌（B.lentimorbus）（鞘翅，無伴胞晶體）蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）（鞘、膜、鱗30多種昆蟲，a毒素）森田芽孢桿菌（B.moritai）（雙翅目，使幼蟲致死、成蟲畸形）蜂房芽孢桿菌（B.alvei）（膜翅目、引起歐洲蜜蜂的腐臭?。┯紫x芽孢桿菌（B.larvae）嗜蟲黏質(zhì)芽孢桿菌，鱗翅目幼蟲有極強的毒力其他殺蟲芽孢桿菌粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratiamarcescens）1886年從病蠶體中分離得到，對鱗翅目、葉蟬、飛虱有致病作用，效果不穩(wěn)定。第42頁,共51頁，2024年2月25日，星期天細菌殺菌劑革蘭氏陰性菌和陽性菌兩類。革蘭氏陰性菌：假單胞菌和放射性土壤桿菌革蘭氏陽性菌：芽孢桿菌第43頁,共51頁，2024年2月25日，星期天假單胞菌：如綠膿桿菌、熒光假單胞菌、敗血假單胞菌、微球菌抗病機理：抑制和抗菌作用第44頁,共51頁，2024年2月25日，星期天枯草桿菌（Bacillussubtilis）生物農(nóng)藥代謝產(chǎn)物枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)

作為殺菌劑，對多種植物病原真菌如多種灰霉病菌、白粉病菌、立枯病菌、枯萎病菌等有很強的抑制作用，能有效提高作物產(chǎn)量，改善作物品質(zhì).作為飼料添加劑，隨同飼料一起進入機體內(nèi)發(fā)生作用，促進飼料的分解利用，并具有拮抗腸道病原細菌，維護和調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡的作用,第45頁,共51頁，2024年2月25日，星期天具體包括：（1）改善體內(nèi)生存環(huán)境，減少氨，胺，硫化氫等有害物質(zhì)的產(chǎn)生；微生態(tài)制劑能分解飼料消化過程產(chǎn)生的氨，胺，硫化氫等有害物質(zhì)，降低體內(nèi)及體外有毒物質(zhì)含量，此作用在水產(chǎn)動物中尤其重要；（2）增強動物體免疫功能，抵御感染；有益微生物細胞壁含有的免疫多糖l類物質(zhì)，可以增強動物的免疫能力，激活巨噬細胞吞噬病菌的能力；第