【發(fā)酵工程】余龍江版-第11章-發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化

第11章發(fā)酵產(chǎn)物的提取與精制發(fā)酵產(chǎn)物的提取與精制屬于發(fā)酵工程的下游加工技術(shù)。下游加工亦稱發(fā)酵后處理，是指從發(fā)酵液或酶反響中別離純化目的產(chǎn)物并加工成成品的過(guò)程。在多數(shù)情況下是從稀的發(fā)酵液中回收目的產(chǎn)物，整個(gè)過(guò)程有多項(xiàng)單元操作組成，其中有許多是經(jīng)典的化工單元操作。11.1下游加工過(guò)程概述下游加工上游加工一、下游加工過(guò)程的重要性1.獲得商業(yè)產(chǎn)品的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。2.促進(jìn)發(fā)酵工程上游加工技術(shù)或工藝的改進(jìn)。3.擁有市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的重要保證。下游加工上游加工二、下游加工過(guò)程的特點(diǎn)2.發(fā)酵產(chǎn)品在培養(yǎng)液中具有濃度低，穩(wěn)定性差，對(duì)酸堿等外界環(huán)境十分敏感，容易失活。3.下游加工過(guò)程代價(jià)昂貴，產(chǎn)品回收率不是很高。4.發(fā)酵過(guò)程復(fù)雜，要求下游加工工藝應(yīng)具有相當(dāng)?shù)倪m應(yīng)性，以確保最終產(chǎn)品的純度和質(zhì)量。1.發(fā)酵液是復(fù)雜的多相系統(tǒng)，屬非牛頓液體，從中別離所需產(chǎn)品困難大。三、下游加工的原那么和要求原那么：1〕短時(shí)間內(nèi)處理2〕別離時(shí)盡量低溫3〕選擇生物物質(zhì)穩(wěn)定的pH4〕要程序化進(jìn)行清洗，消毒，包括廠房，設(shè)備，管路要求：1〕到達(dá)所需的純度2〕本錢要低，得率高3〕工藝過(guò)程要簡(jiǎn)便，對(duì)別離物質(zhì)特性清楚4〕廢棄物要易處理，能夠做到綜合利用〔零排放；清潔生產(chǎn)〕5〕實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品能夠放大生產(chǎn)四、下游加工工程的一般流程1.粗別離階段〔1〕發(fā)酵液的預(yù)處理和固-液別離?！?〕產(chǎn)物的初別離。2.純化精制階段〔3〕1產(chǎn)物的高度純化?！?〕成品加工。發(fā)酵液細(xì)胞分離提取、分離純化、精制產(chǎn)物胞外產(chǎn)物胞內(nèi)產(chǎn)物離心或過(guò)濾細(xì)胞破碎離心或過(guò)濾離心或過(guò)濾干燥含產(chǎn)物的清液廢物離心或過(guò)濾干燥產(chǎn)物預(yù)處理破碎細(xì)胞碎片分離細(xì)胞分離精制成品加工F發(fā)酵液提取加熱沉降均化離心別離沉淀層析無(wú)菌過(guò)濾調(diào)pH離心別離研磨萃取吸附離子交換濃縮絮凝過(guò)濾溶胞超濾萃取親和超濾膜別離雙水相萃取超濾憎水冷凍枯燥吸附噴霧枯燥電泳結(jié)晶發(fā)酵液胞外產(chǎn)物操作步驟減至最少，并盡可能提高各步驟的收率一、發(fā)酵液的一般特征

1.含水量高，一般可達(dá)90％～99%，處理體積大。2.產(chǎn)品濃度低。3.懸浮物顆粒小，密度與液體相差不大。4.固體粒子可壓縮性大，一壓縮就變形。5.液體黏度大，大多為非牛頓型流體。易吸附在濾布上。6.產(chǎn)物性質(zhì)不穩(wěn)定，不耐熱、等會(huì)酸堿敏感、易被氧化、易被微生物污染及酶分解。11.2發(fā)酵液的預(yù)處理與固-液別離二、發(fā)酵液預(yù)處理的目的和要求1.預(yù)處理的目的〔1〕改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，促進(jìn)懸浮液中別離固形物的速度，提高固液別離器的效率〔2〕盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的某一相中〔多數(shù)是液體〕〔3〕去除發(fā)酵液中局部雜質(zhì)，以利于后續(xù)各步操作。2.發(fā)酵液預(yù)處理的要求:〔1〕菌體的別離〔2〕固體懸浮物的去除〔3〕蛋白質(zhì)的去除〔4〕重金屬離子的去除〔5〕色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機(jī)雜質(zhì)的去除〔6〕改變發(fā)酵液的性質(zhì)〔7〕調(diào)節(jié)適宜pH值和溫度三、發(fā)酵液預(yù)處理的方法1.降低液體的黏度2.絮凝法3.重力法4.等電點(diǎn)法5.參加助濾劑6.繳入反響劑1降低液體黏度〔1〕加水稀釋法采用加水稀釋法雖然能降低液體黏度，但是會(huì)增加發(fā)酵液的體積，因此加大后續(xù)過(guò)程的處理量。而且稀釋后過(guò)濾速率提高的百分比必須大于加水比才算真正有效，即假設(shè)加水一倍，那么稀釋后液體的黏度必須下降50%以上，才能有效提高過(guò)濾效率?！?〕加熱法升高溫度可以降低懸浮液的黏度，除去某些雜蛋白，降低懸浮物的最終體積，破壞凝膠狀結(jié)構(gòu)、增加濾餅的空隙度，提高過(guò)濾效率。不適用熱敏性的物質(zhì)，而且要防止加熱導(dǎo)致細(xì)胞溶解，胞內(nèi)物質(zhì)外溢?！?〕添加酶制劑比方：加酶將多糖轉(zhuǎn)化為單糖

凝聚是在高價(jià)無(wú)機(jī)鹽作用下，由于雙電層排斥電位的降低，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。

絮凝是指在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成粗大的絮凝團(tuán)的過(guò)程，是一種以物理的集合為主的過(guò)程。凝聚和絮凝的概念擴(kuò)散雙電層的結(jié)構(gòu)模型圖膠粒能保持分散狀態(tài)的原因2.凝聚和絮凝法凝聚技術(shù)擴(kuò)散雙電層的結(jié)構(gòu)模型圖凝聚原理：電解質(zhì)將膠體粒子外表上的電荷中和，減少存在于膠體粒子間的靜電斥力，使范德華力占優(yōu)勢(shì)，這樣膠體就會(huì)凝聚成較大、較密實(shí)的粒子。膠粒能保持分散狀態(tài)的原因主要是帶有相同電荷和擴(kuò)散雙電層的結(jié)構(gòu)，一旦由于布朗運(yùn)動(dòng)使粒子間距離縮小到它們的擴(kuò)散層局部重疊時(shí)，即產(chǎn)生使兩個(gè)粒子分開：從而阻止了粒子的聚集。ζ電位越大，電排斥作用就越強(qiáng)，膠粒的分散程度也越大，此外，由于膠粒外表的水化作用，形成了包圍于粒子周圍的水化層，也能阻礙膠粒間的直接聚集。但是，水化膜主要是伴隨膠粒帶電而引起的，一旦ζ電位降低或消除，水化層也會(huì)隨之減弱或消失。常用的凝聚劑Al2(SO4)3.18H2O，AlCl3.6H2O，F(xiàn)eCl3，ZnSO4，MgCl2陽(yáng)離子對(duì)負(fù)電荷的膠粒凝聚能力次序?yàn)椋篈l3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+常用的凝聚方法：在稀溶液中參加電解質(zhì)以促進(jìn)凝聚。試劑包括酸、堿、簡(jiǎn)單電解質(zhì)和合成的高分子電解質(zhì)。絮凝原理：在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成粗大的絮凝團(tuán)使之更容易過(guò)濾。絮凝劑通過(guò)靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，強(qiáng)烈地吸附在膠粒的外表。當(dāng)一個(gè)高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒外表上，產(chǎn)生橋架連接時(shí)，就形成了較大的絮團(tuán)，這就是絮凝作用。絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對(duì)分子質(zhì)量可高達(dá)數(shù)萬(wàn)至一千萬(wàn)以上，長(zhǎng)鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有許多活性官能團(tuán)，包括帶電荷的陰離子〔如---COOH〕或陽(yáng)離子〔如---NH2〕基團(tuán)以及不帶電荷的非離子型基團(tuán)。常用的絮凝劑：明膠、甲基纖維素、多聚丙烯酸、聚胺衍生物、氯化鈣、磷酸氫二鈉++--影響絮凝的因素絮凝劑的添加量發(fā)酵液的pH絮凝劑的分子量攪拌轉(zhuǎn)速攪拌時(shí)間混凝有時(shí)候絮凝劑是高分子非離子型和陰離子型的，主要通過(guò)分子間引力或氫鍵作用產(chǎn)生吸附架橋，因此通常與無(wú)機(jī)凝聚電解質(zhì)搭配使用。首先參加電解質(zhì)，使懸浮粒子間的雙電子層電位降低、脫穩(wěn)，凝聚成微粒，然后再參加絮凝劑凝聚成較大的顆粒。3.重力法在工業(yè)上用的較多的主要是離心和過(guò)濾.過(guò)濾常用板框真空吸濾或電動(dòng)篩等，離心和過(guò)濾能否順利進(jìn)行取決于很多因素。一般溫度高，壓力大，發(fā)酵液粘度小，濾布選用適當(dāng)，助溶劑適宜，攪拌都可以提高過(guò)濾速度。4、等電點(diǎn)法蛋白質(zhì)一般以膠體狀態(tài)存在于發(fā)酵液中。膠體粒子的穩(wěn)定性和其所帶電荷有關(guān)。蛋白質(zhì)在某一pH下，凈電荷為零，溶解度最小，稱為等電點(diǎn)。因此可利用此特性別離或去除良性物質(zhì)。因?yàn)轸然碾婋x度比氨基大，故蛋白質(zhì)的酸性性質(zhì)通常強(qiáng)于堿性，因而很多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都在酸性范圍內(nèi)〔pH4.0－5.5〕。5、添加助濾劑：一般為惰性助濾劑：是一種顆粒均勻、質(zhì)地堅(jiān)硬、不可壓縮的粒狀物質(zhì)作用：助濾劑外表具有吸附膠體的能力，并且由此助濾劑顆粒形成的濾餅具有格子型結(jié)構(gòu)，不可壓縮，濾孔不會(huì)被全部堵塞，可以保持良好的滲透性使用方法〔1〕：在濾布上預(yù)涂，作為過(guò)濾介質(zhì)使用〔2〕：按一定比例混入待濾的懸浮液中常用的助濾劑：硅藻土、膨脹珍珠巖、石棉、纖維素、未活化的碳、爐渣、重質(zhì)碳酸鈣6、添加反響劑：添加可溶解的鹽類，生成不溶解的沉淀；生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)；沉淀本身可作為助濾劑，還能使膠狀物和懸浮物凝固。四、發(fā)酵液的相對(duì)純化1.高價(jià)無(wú)機(jī)離子的去除〔Ca2+、Mg2+、Fe2+等〕2.可溶性雜蛋白的去除高價(jià)無(wú)機(jī)離子的存在，會(huì)影響樹脂對(duì)生化物質(zhì)的交換容量。雜蛋白質(zhì)的存在，不僅在采用離子交換法和大網(wǎng)格樹脂吸附法提煉時(shí)會(huì)降低其吸附能力，而且在采用有機(jī)溶劑或兩水相萃取時(shí)，容易產(chǎn)生乳化，使兩相別離不清，在預(yù)處理時(shí)，應(yīng)盡量除去這些物質(zhì)。1高價(jià)無(wú)機(jī)離子的去除發(fā)酵液中雜質(zhì)很多，其中對(duì)提煉影響最大的是高價(jià)無(wú)機(jī)離子〔Ca2＋、Mg2＋、Fe2＋〕等。去除鈣離子：通常使用草酸。但由于草酸溶解度較小，不適合用量較大的場(chǎng)合，可用其可溶性鹽，草酸價(jià)格昂貴，注意回收。去除鎂離子：參加三聚磷酸鈉，與鎂離子形成絡(luò)合物。用磷酸鹽處理，也能大大降低鈣離子和鎂離子的濃度。例如：環(huán)絲氨酸的提取。去除鐵離子：可參加黃血鹽，使其形成普魯士藍(lán)沉淀而除去。2.雜蛋白質(zhì)的除去〔1〕沉淀法①加熱變性蛋白質(zhì)從有規(guī)那么排列變?yōu)椴灰?guī)那么結(jié)構(gòu)的過(guò)程稱為變性。使蛋白質(zhì)變性的方法有：加熱，調(diào)節(jié)pH，加酒精等有機(jī)溶劑或外表活性劑等。在鏈霉素生產(chǎn)中，在pH3.0時(shí)，加熱至70～75℃，維持30min，黏度降為1/6，過(guò)濾速度提高3倍。變性法的局限性：加熱法只適合于對(duì)熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端pH也會(huì)導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，并且要消耗大量酸堿；而有機(jī)溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場(chǎng)合。②加有機(jī)溶劑、外表活性劑、酸堿等在酸性溶液中，蛋白質(zhì)能與一些陰離子，如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過(guò)氯酸鹽等形成沉淀；在堿性溶液中，蛋白質(zhì)能與一些陽(yáng)離子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀?！?〕吸附法參加某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質(zhì)而除去。例如：在枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中，參加氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，從而可加快過(guò)濾速率。11.3固-液別離過(guò)程及設(shè)備簡(jiǎn)介意義：固-液別離過(guò)程下游加工的重要環(huán)節(jié)，用于發(fā)酵液的預(yù)處理和生物產(chǎn)品的純化、精制等環(huán)節(jié)。方法：常用的方法有過(guò)濾、離心。此外還有膜別離、雙水相萃取和擴(kuò)張床吸附等方法。影響發(fā)酵液固-液別離的主要因素：菌體的大小、形狀及發(fā)酵液的黏度，還有發(fā)酵液的溫度、pH值、加熱時(shí)間等。目的：收集胞內(nèi)產(chǎn)物的細(xì)胞或菌體，別離除去液相，或者是收集含生化物質(zhì)的液相，別離除去固體懸浮物，如細(xì)胞、菌體、細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)的沉淀物和它們的絮凝體等。1.過(guò)濾定義：用過(guò)濾介質(zhì)將懸液中的固形顆粒與液體別離的過(guò)程。常用的過(guò)濾方式：加壓過(guò)濾和真空過(guò)濾典型設(shè)備主要有：板框壓濾機(jī)和鼓式真空過(guò)濾機(jī)〔1〕板框過(guò)濾機(jī)板框壓濾機(jī)由壓濾機(jī)濾板、液壓系統(tǒng)、壓濾機(jī)框、濾板傳輸系統(tǒng)和電氣系統(tǒng)等五大局部組成。真空轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾機(jī)優(yōu)點(diǎn)：真空轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾機(jī)具有自動(dòng)化程度高、操作連續(xù)、處理量大。特別適合固體含量大〔>10％〕的懸浮液的別離，在發(fā)酵工業(yè)中廣泛用于霉菌、放線菌和酵母發(fā)酵液或細(xì)胞懸浮液的過(guò)濾別離。缺點(diǎn)：由于受真空度的限制，不適于菌體較小和粘度較大的細(xì)菌發(fā)酵液的過(guò)濾，且過(guò)濾所得固相的干度不如加壓過(guò)濾。2、離心定義：基于固體顆粒和周圍液體密度存在差異，在離心場(chǎng)中使不同密度的固體顆粒加速沉降的別離過(guò)程。離心別離方法(1)差速離心—工業(yè)上最常用的離心別離方法定義：在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級(jí)離心，用于別離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。對(duì)象：混合樣品中各沉降系數(shù)差異較大的組分。速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀原理：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、別離。分類：1〕移動(dòng)區(qū)帶離心2〕等密度離心常用密度梯度物質(zhì)：蔗糖、甘油、CsCl、NaBr(2)密度梯度離心—多用于生化研究1〕移動(dòng)區(qū)帶離心含幾個(gè)組分的樣品在足夠高的離心場(chǎng)中離心時(shí)，每種顆粒都到達(dá)其最大沉降速度，這時(shí)樣品開始別離。離心管的上層逐漸形成透明的上清液，并形成對(duì)應(yīng)于樣品各組分的一系列濃度界面，界面的移動(dòng)相對(duì)于每種組分來(lái)說(shuō)是特征的。用于別離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。此法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被別離生物顆粒的最小密度。2〕等密度離心細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和夠長(zhǎng)時(shí)間那么沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在該層到達(dá)平衡，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器別離。離心機(jī)分類制備性離心機(jī)分析性離心機(jī)：超速離心機(jī)普通離心機(jī)高速冷凍離心機(jī)超速離心機(jī)實(shí)驗(yàn)型離心機(jī)工業(yè)型離心機(jī)碟片式離心機(jī)是傳統(tǒng)離心機(jī)，為目前工業(yè)上應(yīng)用最廣泛的離心機(jī)。別離因數(shù)可達(dá)1000-20000，最大處理量到達(dá)300m3/h，常用于大規(guī)模的別離過(guò)程。適用范圍細(xì)菌、酵母菌、放線菌、細(xì)胞碎片。管式離心機(jī)管式離心機(jī)是一種別離效率很高的離心別離設(shè)備，其轉(zhuǎn)鼓細(xì)長(zhǎng)，可在15000-50000的高轉(zhuǎn)速下工作，別離因數(shù)可達(dá)104-6×105。它設(shè)備簡(jiǎn)單、操作穩(wěn)定。適用范圍細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器、病毒、蛋白質(zhì)、核酸等。影響固液別離的因素微生物種類真菌的菌體大，固液別離容易，可采用真空轉(zhuǎn)鼓式過(guò)濾或板框過(guò)濾；細(xì)菌和細(xì)胞碎片小，固液別離較難，固液別離前要進(jìn)行預(yù)處理。發(fā)酵液黏度固液別離速度與黏度成反比。其它因素培養(yǎng)基組成、發(fā)酵周期、發(fā)酵液的pH值、溫度和加熱時(shí)間等離心別離〔1〕優(yōu)點(diǎn)：①別離速度快，效率高，②操作時(shí)衛(wèi)生條件好等優(yōu)點(diǎn)，③適合于大規(guī)模的別離過(guò)程?！?〕缺點(diǎn)：①投資費(fèi)用高，②能耗較大。3.其他固-液別離方法〔1〕膜別離：利用不同組分通過(guò)膜的傳遞速度不同而得以別離的方法〔2〕雙水相萃?。豪貌煌M分在雙水相分配系數(shù)不同進(jìn)行別離方法?！?〕擴(kuò)張床吸附：將固-液別離合目的產(chǎn)物吸附合并成一步進(jìn)行的一種別離方法。11.4微生物細(xì)胞的破碎微生物的代謝產(chǎn)物如果是胞內(nèi)物質(zhì)〔如有些酶制劑、干擾素、胰島素等〕，那么首先要收集菌體，進(jìn)行細(xì)胞破碎。1.微生物細(xì)胞壁的組成與結(jié)構(gòu)：〔1〕細(xì)菌細(xì)胞壁：〔2〕酵母菌細(xì)胞壁比G+菌稍厚，主要成分是葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質(zhì)等?！?〕其他真菌細(xì)胞壁主要由多糖組成，如幾丁質(zhì)或纖維素強(qiáng)度比細(xì)菌和酵母菌高。2.常用的細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎的方法很多，根據(jù)外加作用力的方式可分為機(jī)械法和非機(jī)械法兩大類。亦可按所用方法的屬性分為物理法、化學(xué)法和生物法三類。物理破碎法：高壓勻漿法、擠壓法、高速珠磨法、超聲波法；化學(xué)破碎法：滲透沖擊法、增溶法。生物破碎法：酶溶法細(xì)胞破碎機(jī)理圖〔1〕物理破碎法①高壓勻漿法大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法原理：利用高壓使細(xì)胞懸浮液通過(guò)針形閥，由于突然減壓和高速?zèng)_擊撞擊環(huán)使細(xì)胞破碎。適用范圍：適用于酵母菌、大腸桿菌、巨大芽孢桿菌和黑曲霉等。不適用于高度分枝的微生物。特點(diǎn)：在操作方式上，可以采用單次通過(guò)勻漿器或?qū)掖窝h(huán)通過(guò)等方式，也可連續(xù)操作。大、中、小型高壓勻漿器②擠壓法〔X-press法〕將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25℃至-30℃形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出使之破碎。原理：細(xì)胞破碎是由于冰晶體在受壓時(shí)的相變，包埋在冰中的細(xì)胞變形所引起的。主要用于實(shí)驗(yàn)室中。優(yōu)點(diǎn)：適用的范圍廣、破碎率高、細(xì)胞碎片的粉碎程度低以及活性的保存率高。缺點(diǎn)：對(duì)冷凍-融解敏感的生化物質(zhì)不適用。③高速珠磨法原理：進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑〔直徑小于1mm〕一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。優(yōu)點(diǎn)：可連續(xù)操作缺點(diǎn)：破碎中產(chǎn)生的熱量，需采用冷卻措施。膠體磨德國(guó)進(jìn)口珠磨機(jī)④超聲波破碎法超聲波破碎也是應(yīng)用較多的一種破碎方法。通常采用的超聲波破碎機(jī)在15-25千赫〔kHz〕的頻率下操作。原理：在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用，空化泡的急劇膨脹壓縮和內(nèi)向爆破產(chǎn)生沖擊彈性波，將聲能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能，形成粘性消散渦流，如果液體旋渦小于細(xì)胞尺寸，產(chǎn)生不同密度移動(dòng)，當(dāng)細(xì)胞的動(dòng)能超過(guò)細(xì)胞壁強(qiáng)度時(shí)，至使細(xì)胞破碎。特點(diǎn)：桿菌比球菌易破碎，革蘭氏陰性菌細(xì)胞比革蘭氏陽(yáng)性菌易破碎，酵母茵效果較差。菌體濃度太高或介質(zhì)黏度高，均不利于超聲波破碎。最大問(wèn)題是在超聲過(guò)程中聲波被溶液吸收產(chǎn)生大量熱量，不能及時(shí)將熱量移出，細(xì)胞懸浮液的溫度急劇升高，導(dǎo)致酶和其它生物活性物質(zhì)變性失活。因此，在實(shí)驗(yàn)室中往往采取間斷破碎的方法，即經(jīng)短時(shí)間破碎，冷卻降溫，再進(jìn)行破碎，經(jīng)屢次反復(fù)到達(dá)破碎目的。因此在細(xì)胞破碎過(guò)程中，有效冷卻是關(guān)鍵。也因大容量容器的聲波傳遞和散熱困難，限制了超聲破碎的大規(guī)模應(yīng)用。球蘑機(jī)的粉碎球和機(jī)器勻漿機(jī)組織粉碎機(jī)〔2〕化學(xué)破碎法定義：利用化學(xué)試劑改變細(xì)胞壁或膜的結(jié)構(gòu)或完全破除細(xì)胞壁形成原生質(zhì)體后，在滲透壓作用下使從而使細(xì)胞膜破裂而釋放胞內(nèi)物質(zhì)的方法。優(yōu)點(diǎn)：對(duì)產(chǎn)物的釋出選擇性好，細(xì)胞外形較完整、碎片少、核酸等胞內(nèi)雜質(zhì)釋放少，便于后步別離等優(yōu)點(diǎn)，故使用較多。缺點(diǎn)：容易引起活性物質(zhì)失活破壞；化學(xué)試劑的參加，常會(huì)給隨后產(chǎn)物的純化帶來(lái)困難，并影響最終產(chǎn)物純度。特點(diǎn)：較溫和的一種破碎方法，操作也簡(jiǎn)單。應(yīng)用：僅對(duì)細(xì)胞壁較脆弱的菌，或者細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理，或合成受抑制而強(qiáng)度減弱時(shí)才是適宜的。①滲透壓沖擊原理：將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中〔如一定濃度的甘油或蔗糖溶液〕，到達(dá)平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖液或純水中，介質(zhì)被突然稀釋，或者將細(xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞壁的破裂。如：將收集到的細(xì)胞用適當(dāng)?shù)木彌_液或生理鹽水洗滌，除去細(xì)胞沾染的培養(yǎng)基或其它雜質(zhì)，將其懸浮在含10-30%蔗糖的適當(dāng)緩沖液中，為了防止目的酶或蛋白質(zhì)失活，假設(shè)目的酶或蛋白質(zhì)需要金屬離子時(shí)，在緩沖液中參加金屬離子；假設(shè)金屬離子會(huì)使目的酶或蛋白質(zhì)失活，在緩沖液中需參加金屬離子螯合劑，如EDTA等。在低溫下，使細(xì)胞懸浮液混合均勻，放置使細(xì)胞內(nèi)外滲透壓到達(dá)平衡。在低溫下離心，收集細(xì)胞；在劇烈的攪拌下將細(xì)胞快速加到較大體積的低濃度的緩沖液中，由于細(xì)胞外滲透壓突然降低，使細(xì)胞破碎。應(yīng)用用此法處理大腸桿菌，可使磷酸酯酶、核糖核酸酶I以及脫氧核糖核酸酶等釋放到溶液中。釋放的蛋白質(zhì)的量一般僅占細(xì)胞蛋白質(zhì)的4-7%。因此，后序的蛋白質(zhì)別離純化比較簡(jiǎn)單。此法對(duì)細(xì)胞壁外有著牢固的糖蛋白包裹層，使胞內(nèi)滲透壓不受嚴(yán)重影響的格蘭氏陽(yáng)性菌不適用。在高滲透壓環(huán)境下生長(zhǎng)的細(xì)菌,如海洋細(xì)菌，嗜鹽細(xì)菌，更適合該法。如可有效的將海洋發(fā)光細(xì)菌的細(xì)菌熒光素酶釋放，酶釋放率可到達(dá)80-90%。原理：利用某些化學(xué)試劑如有外表活性劑等，增加細(xì)胞壁或膜的通透性，而使細(xì)胞破碎的方法。②增溶法:該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。常用的外表活性劑有SDS、EDTA、TritonX-100，有機(jī)溶劑有甲苯、乙醇、異丙醇、鹽酸胍和尿素。TritonX-100牛黃膽酸鈉十二烷基磺酸鈉A外表活性劑外表活性劑可促使細(xì)胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細(xì)胞的破碎。主要是處理G-細(xì)菌，對(duì)細(xì)胞外層膜有破壞作用。EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內(nèi)層膜的磷脂來(lái)填補(bǔ)，從而導(dǎo)致內(nèi)層膜通透性的增強(qiáng)。BEDTA螯合劑能分解細(xì)胞壁中的類脂，使胞壁膜溶脹，細(xì)胞破裂，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來(lái)。乙醇、異丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高級(jí)醇等。C有機(jī)溶劑與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。鹽酸胍和脲是常用的變性劑。通用性差；時(shí)間長(zhǎng)，效率低；有些化學(xué)試劑有毒?；瘜W(xué)滲透法優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：對(duì)產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過(guò)，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液別離和進(jìn)一步提取。不同細(xì)胞可采用的化學(xué)滲透處理方式細(xì)胞類型變性劑清潔劑有機(jī)溶劑酶抗生素生物試劑螯合劑革蘭氏陰性細(xì)菌******革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌***酵母菌******植物細(xì)胞****巨噬細(xì)胞****表適用〔3〕生物破碎法常用的生物破碎法主要是酶溶法。利用生物酶分解破壞細(xì)胞壁上特殊的鍵，從而到達(dá)破壁的目的。酶溶法的優(yōu)點(diǎn)：選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞外形完整。缺點(diǎn)：溶酶價(jià)格高，溶酶法通用性差〔不同菌種需選擇不同的酶〕，產(chǎn)物抑制的存在。常用的溶酶溶菌酶β-1,3-葡聚糖酶β-1,6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽鍵內(nèi)切酶殼多糖酶等溶菌酶主要用于細(xì)菌類細(xì)胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物溶菌酶是應(yīng)用最多的酶，它能專一地分解細(xì)胞壁上糖蛋白分子的α-1,4糖苷鍵，使脂多糖解離，經(jīng)溶菌酶處理后的細(xì)胞移至低滲溶液中使細(xì)胞破裂。利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到局部或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。利用溶酶系統(tǒng)處理細(xì)胞時(shí)必須根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿?，并確定相應(yīng)的次序。酶溶法的優(yōu)點(diǎn)：選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞外形完整。酶溶法的缺點(diǎn)：溶酶價(jià)格高，溶酶法通用性差，產(chǎn)物抑制的存在?！?〕自溶作用定義：是一種特殊的酶溶方法，所需溶胞的酶是由微生物本身產(chǎn)生的，而不需要外加其它的酶。影響自溶過(guò)程的因素有溫度、時(shí)間、pH緩沖液濃度、細(xì)胞代謝途徑等。應(yīng)用：在一定程度上能用于工業(yè)規(guī)模，但是，對(duì)不穩(wěn)定的微生物容易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后的細(xì)胞培養(yǎng)液過(guò)濾速度也會(huì)降低。將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復(fù)屢次而到達(dá)破壁作用。一方面使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細(xì)胞膨脹而破裂。適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)屢次。(3)反復(fù)凍結(jié)-融化法此法使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。氣流枯燥主要適用于酵母菌，一般在25-30℃的氣流中吹干；真空枯燥多用于細(xì)菌。(4)枯燥法氣流干燥真空干燥噴霧干燥冷凍干燥2.破碎率的測(cè)定測(cè)定細(xì)胞破碎率的常用方法：①直接計(jì)數(shù)法②測(cè)定釋放的蛋白質(zhì)含量或酶活量③測(cè)定導(dǎo)電率4.破碎技術(shù)的研究方向多種破碎方法相結(jié)合與上游過(guò)程相結(jié)合與下游工程相結(jié)合11.5濃縮技術(shù)濃縮過(guò)程是發(fā)酵工業(yè)提取與精制過(guò)程常用的單元操作。濃縮的目的是將低溶質(zhì)濃度的溶液通過(guò)除去溶質(zhì)變?yōu)楦呷苜|(zhì)濃度的溶液。它廣泛用于有機(jī)酸、氨基酸、核苷酸、酶制劑及抗生素等發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的提取別離過(guò)程。常用的濃縮技術(shù)有蒸發(fā)濃縮法、冷凍枯燥法、吸收濃縮法?！?〕蒸發(fā)濃縮法蒸發(fā)濃縮法概念及原理蒸發(fā)是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中常用的發(fā)酵產(chǎn)品濃縮方法之一。蒸發(fā)的目的是使溶液中的溶劑在一定的溫度和壓力下加熱后汽化除去，從而提高溶液中溶質(zhì)的濃度。這里所指的溶液是由不揮發(fā)的溶質(zhì)與液體溶劑所組成，蒸發(fā)過(guò)程只有溶劑汽化而溶質(zhì)不汽化。蒸發(fā)濃縮裝置的設(shè)計(jì)蒸發(fā)是溶液外表的溶劑分子獲得的動(dòng)能超過(guò)了溶液內(nèi)溶劑分子間的吸引力脫離液面進(jìn)入空間的過(guò)程。蒸發(fā)快慢與溫度、蒸發(fā)面積及液面蒸汽分子密度等因素有關(guān)。因此，蒸發(fā)濃縮裝置常按照加熱、擴(kuò)大液體外表積、減壓、和加速空氣流動(dòng)等因素而設(shè)計(jì)蒸發(fā)濃縮裝置的分類常用的蒸發(fā)濃縮過(guò)程可分為常壓蒸發(fā)濃縮和真空減壓蒸發(fā)濃縮過(guò)程。按照結(jié)構(gòu)型式不同，常壓蒸發(fā)設(shè)備有中央循環(huán)管式蒸發(fā)器、橫管式蒸發(fā)器、夾套式蒸發(fā)器、夾套帶攪拌外循環(huán)蒸發(fā)器、強(qiáng)制循環(huán)蒸發(fā)器等.真空減壓蒸發(fā)設(shè)備根據(jù)二次蒸氣的利用的情況，可分為單效蒸發(fā)和多效蒸發(fā)。分子蒸餾分子蒸餾克服了傳統(tǒng)蒸餾操作溫度高，受熱時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，可解決大量傳統(tǒng)蒸餾無(wú)法解決的工業(yè)化難題，尤其適用于目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)之間沸點(diǎn)相差較大的物質(zhì)的別離。分子蒸餾的原理是根據(jù)分子運(yùn)動(dòng)理論，液體混合物的分子受熱后運(yùn)動(dòng)會(huì)加劇，當(dāng)接受到足夠能量后，就會(huì)從液體溢出而成為氣相分子。2、冷凍濃縮法冷凍濃縮法：是工業(yè)發(fā)酵中生物大分子和具有生理活性的發(fā)酵產(chǎn)品濃縮常用的一種有效方法。冷凍濃縮法原理：在冷凍時(shí)水分結(jié)成冰，鹽類及發(fā)酵產(chǎn)品不進(jìn)入冰內(nèi)而留在冰外，濃縮時(shí)先將待濃縮的溶液冷凍使之變成固態(tài)，然后緩慢的融解，利用溶劑與溶質(zhì)熔點(diǎn)的差異而到達(dá)除去大局部溶劑的目的。如酶制劑和蛋白質(zhì)。3吸收濃縮法吸收濃縮法：是一種通過(guò)吸收劑直接吸收出去溶液中溶劑分子使溶液濃縮的方法。應(yīng)用吸收濃縮法時(shí)要求吸收劑不與溶液起化學(xué)反響，而且對(duì)大分子類的發(fā)酵產(chǎn)品不起吸收作用，易于溶液分開，吸收劑除去溶劑后能重復(fù)使用。11.6沉淀技術(shù)定義：通過(guò)改變條件或參加某種試劑，使發(fā)酵產(chǎn)物離開溶液，生成不溶性顆粒而沉降析出的過(guò)程。作用：濃縮作用大于純化作用，是初步別離的一種手段。優(yōu)點(diǎn)：沉淀法具有設(shè)備簡(jiǎn)單、本錢低、原料易得、收率高、濃縮倍數(shù)高和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)：于過(guò)濾困難、產(chǎn)品質(zhì)量較低、需要重新精制。1.鹽析原理：高濃度中性鹽存在下，使生物分子在水溶液中溶解的溶解度降低而產(chǎn)生沉淀的方法，多用于蛋白質(zhì)〔酶〕的別離。常用的鹽類是硫酸銨。優(yōu)點(diǎn)：①本錢低，不需要特別昂貴的設(shè)備。②操作簡(jiǎn)單、平安。③對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用?！?〕鹽析機(jī)制①鹽溶：[鹽]低時(shí)，S〔蛋白質(zhì)的溶解度〕隨[鹽]增加而增加；②鹽析：[鹽]高時(shí)，S〔蛋白質(zhì)的溶解度〕隨[鹽]增加而降低；〔2〕溶解度與鹽濃度的關(guān)系可用下式表示：logS=β－KS·IS：蛋白質(zhì)的溶解度；I：離子強(qiáng)度；β：常數(shù)，與蛋白質(zhì)種類有關(guān)，與鹽的種類無(wú)關(guān)；KS：鹽析常數(shù)，與鹽種類有關(guān)，與溫度和pH無(wú)關(guān)；①鹽的種類：影響KS，KS越大，效果越好②溶質(zhì)的起始濃度③鹽析劑用量④溫度和pH：影響β值而影響S。尤其是影響相對(duì)溶解度⑤雜質(zhì)〔3〕影響鹽析的因素2.等電點(diǎn)沉淀原理：利用兩性電解質(zhì)在在低離子強(qiáng)度下，調(diào)節(jié)至等電點(diǎn)，可使各種兩性電解質(zhì)所帶凈電荷為零，能大大降低其溶解度，形成沉淀。不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，從而將其別離開。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，試劑消耗少，引入雜質(zhì)少。缺點(diǎn):不能完全沉淀析出，常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和別離效果。應(yīng)用：主要用于在別離純化流程中去除雜蛋白，而不用于沉淀目的物。等電點(diǎn)操作時(shí)要注意：①溶液中離子的種類和濃度對(duì)生物分子等電點(diǎn)的影響。②等電點(diǎn)附近的鹽溶作用③目的產(chǎn)物的不穩(wěn)定性。等電點(diǎn)鋅鹽法

3.有機(jī)溶劑沉淀定義：于水互溶的有機(jī)溶劑〔乙醇、丙酮等〕能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。多用于生物小分子、多糖、核酸和蛋白質(zhì)等產(chǎn)品的提取。機(jī)理：降低溶液的介電常數(shù)，因?yàn)榉肿娱g的靜電引力和溶劑的介電常數(shù)成反比，參加有機(jī)溶劑，蛋白質(zhì)分子間的引力增加，溶解度降低。常用有機(jī)溶劑：乙醇、甲醇、丙酮等。缺點(diǎn)：容易引起蛋白質(zhì)變性失活，并且有機(jī)溶劑易燃、易爆，對(duì)平安要求較高。優(yōu)點(diǎn)：①分辨能力比鹽析法高，一種溶質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑范圍內(nèi)沉淀；②沉淀不需脫鹽；③有機(jī)溶劑密度低，與沉淀物密度差大，容易進(jìn)行固液別離；④有機(jī)溶劑容易蒸發(fā)，不會(huì)在成品中殘留，適用于食品、藥品的制備。4.非離子型多聚物沉淀定義：水溶性的非離子多聚物如聚乙二醇〔PEG〕、葡聚糖右旋糖酐硫酸鈉等，可用于沉淀別離蛋白質(zhì)〔尤其是不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)〕、DNA和RNA等。。機(jī)制：多聚物與有機(jī)溶劑相似，能降低水化度使蛋白質(zhì)沉淀；與大分子形成復(fù)合物，發(fā)生共沉淀作用等應(yīng)用最多的是PEG。優(yōu)點(diǎn)：其操作條件溫和，不易引起生物大分子的變性，沉淀效能高，很少量的沉淀劑就可以使相當(dāng)多的生物大分子沉淀，且沉淀后的多聚物也容易除去，無(wú)毒、不可燃，對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)有保護(hù)作用。應(yīng)用：廣泛用于蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)菌和病毒等的別離純化。11.7萃取別離技術(shù)定義：利用不同物質(zhì)在選定溶劑中具有不同的溶解度的原理來(lái)進(jìn)行不同物質(zhì)的別離純化。優(yōu)點(diǎn)：①選擇性好，別離效果好；②對(duì)熱敏性物質(zhì)破壞小，且耗能低；③生產(chǎn)能力大，周期短；④便于連續(xù)操作，容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制等。應(yīng)用：適用于抗生素等小分子物質(zhì)的別離純化定義：是利用萃取目標(biāo)物質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解度的不同，使其從一種溶劑轉(zhuǎn)入另一種溶劑從而實(shí)現(xiàn)別離。1.溶劑萃取在溶劑萃取中，被提取的溶液稱為料液，從料液中提取出來(lái)的物質(zhì)稱為溶質(zhì)，用來(lái)進(jìn)行萃取的溶劑稱為萃取劑，溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到萃取劑中與萃取劑形成的溶液為萃取液，被萃取出溶質(zhì)的料液稱為萃余液?！?〕生產(chǎn)中萃取操作一般應(yīng)包括下面三個(gè)過(guò)程①混合——料液和萃取劑密切接觸；②別離——萃取相與萃余相別離；③溶劑回收——萃取劑從萃取相(有時(shí)也需從萃余相)中除去，并加以回收。萃取操作流程分為單級(jí)萃取和多級(jí)萃取，多級(jí)萃取又分為多級(jí)錯(cuò)流萃取和多級(jí)逆流萃取。〔2〕溶劑的選擇萃取用的有機(jī)溶劑應(yīng)對(duì)產(chǎn)物有較大的溶解度和良好的選擇性。遵循一個(gè)簡(jiǎn)單的規(guī)律：“相似物容易溶解在相似物中”，即分子的極性。極性液體互相混和并溶解鹽類和極性固體，而非極性化合物溶劑是低極性或沒(méi)有極性的液體。選擇溶劑時(shí)還應(yīng)注意：①與料液的互溶度應(yīng)盡可能??；②毒性低；③化學(xué)穩(wěn)定性高，腐蝕性低，揮發(fā)性??；④價(jià)格廉價(jià)，來(lái)源方便，便于回收。工業(yè)上常用的溶劑：乙酸乙酯、乙酸戊酯和丁酯等?！?〕水相條件的影響①pH值：直接影響表觀分配系數(shù)。另外對(duì)選擇性有影響。②溫度：溫度會(huì)影響生化物質(zhì)的穩(wěn)定性，所以一般在室溫或低溫下進(jìn)行。同時(shí)影響分配系數(shù)K和萃取的速度。③鹽析：硫酸銨、氯化鈉等可降低產(chǎn)物在水中的溶解度，還能減小有機(jī)溶劑在水相中的溶解度。④帶溶劑：能和產(chǎn)物形成復(fù)合物，使產(chǎn)物更易溶于有機(jī)溶劑相中，提高分配系數(shù)。〔4〕乳化和去乳化定義：乳化是一種液體(分散相)分散在另一種不相混溶的液體(連續(xù)相)中的現(xiàn)象。害處：乳化產(chǎn)生后會(huì)使有機(jī)溶劑相和水相分層困難，產(chǎn)生乳化后使有機(jī)相和水相分層困難，原因：是發(fā)酵液中存在的蛋白質(zhì)和固體顆粒等物質(zhì)，這些物質(zhì)具有外表活劑性的作用，使有機(jī)溶劑和水的外表張力降低，水易于以微小液滴的形式分散于油相稱為油包水型W/O乳濁液；相反，為O/W型乳濁液。①乳化方法：a.過(guò)濾或離心別離破乳法；b.化學(xué)法：加電解質(zhì)中和離子型乳油液的電荷；c.物理法：加熱、稀釋、吸附等；d.頂替法：參加外表活性更大，但因其碳鏈較短難以形成鞏固的保護(hù)膜的物質(zhì)，取代界面上的乳化劑；e.轉(zhuǎn)型法：如在O/W中參加親油性乳化刑，使乳化液有生成W/O的傾向，但又不穩(wěn)定，從而到達(dá)破乳目的。最好的方法是防止乳化，如蛋白質(zhì)是乳化起因，就應(yīng)設(shè)法去除蛋白質(zhì)。②去乳化：破壞乳濁液〔5〕萃取的方式根據(jù)混合-別離的操作方式，可以分為單級(jí)萃取和多級(jí)萃取。①單級(jí)萃?。褐皇褂靡粋€(gè)混合器和一個(gè)別離器的萃取。特點(diǎn)：流程最簡(jiǎn)單，單收率不高。②多級(jí)錯(cuò)流萃?。好考?jí)都參加新鮮萃取溶劑，溶劑消耗多，萃取液產(chǎn)物平均濃度較稀，但萃取較完全。多級(jí)錯(cuò)流萃取〔F料液；S溶劑；L萃取液；R萃余液〕③多級(jí)逆流萃?。毫弦鹤呦蚺c萃取走向相反，萃取劑只在最后一級(jí)參加，萃取劑消耗少，萃取液產(chǎn)物平均濃度高，產(chǎn)物收率最高。多級(jí)逆流萃取〔F料液；S溶劑；L萃取液；R萃余液〕2.雙水相萃取法定義：利用物質(zhì)在互不相溶的兩水相間分配系數(shù)的差異來(lái)進(jìn)行萃取的方法?！?〕雙水相形成大多數(shù)親水性聚合物水溶液與第二種親水性聚合物混合，到達(dá)一定濃度時(shí)，會(huì)產(chǎn)生兩相，兩種高聚物分別溶于互不相溶的兩相中。高聚物之間的不相溶性，使得它們無(wú)法相互滲透，不能形成均一相，從而具有相別離的傾向，在一定條件下，即能分為兩相。聚合物與鹽類溶液也能形成兩相?！?〕影響雙水相分配的因素①成相聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量②成相聚合物的濃度③鹽的種類和濃度④pH⑤溫度〔3〕雙水相萃取的應(yīng)用可用于別離和純化酶、核酸、生長(zhǎng)素、病毒、干擾素等。常用的雙水相系統(tǒng)為聚乙二醇/葡聚糖和聚乙二醇/無(wú)機(jī)鹽，后者中聚乙二醇/硫酸鹽或磷酸鹽系統(tǒng)最為常用。①目的分子與雜質(zhì)〔如細(xì)胞等〕應(yīng)分配在不同的相。②分配系數(shù)應(yīng)足夠大。③容易離心別離?！?〕兩水相別離條件3.反膠團(tuán)萃取定義：利用外表活性劑在有機(jī)溶劑中自發(fā)形成的內(nèi)含親水微環(huán)境的反膠團(tuán)，使生物分子溶于此親水微環(huán)境，進(jìn)而進(jìn)行萃取的別離方法。假設(shè)將外表活性劑溶于非極性的有機(jī)溶劑中，并使其濃度超過(guò)某一臨界濃度，便會(huì)在有機(jī)溶劑內(nèi)形成聚集體，稱為反膠束，在反膠束中，外表活性劑的非極性基團(tuán)在外與非極性的有機(jī)溶劑接觸，而極性基團(tuán)那么排列在內(nèi)形成一個(gè)極性核。此極性核具有溶解極性物質(zhì)的能力，極性核溶解于水后，就形成了“水池”。反相膠團(tuán)萃取的優(yōu)點(diǎn)：①本錢低②選擇性高③操作方便④放大容易⑤萃取劑(反膠團(tuán)相)可循環(huán)利用⑥蛋白質(zhì)不易變性等優(yōu)點(diǎn)。4.超臨界流體萃取定義：是將超臨界流體作為萃取劑，從固體或液體中萃取出某些高沸點(diǎn)或熱敏性成分，到達(dá)別離和提純目的。超臨界流體是物質(zhì)處于臨界溫度、臨界壓力之上的一種流體狀態(tài)，具有氣體和液體雙重，即密度接近液體，而黏度與氣體相似，擴(kuò)散系數(shù)約比液體大100倍。不僅具有與液體溶劑相當(dāng)?shù)妮腿∧芰?，而且具有傳質(zhì)擴(kuò)散速度快的優(yōu)點(diǎn)。①具有較高的擴(kuò)散性，從而減小了傳質(zhì)阻力，這對(duì)多孔疏松的固態(tài)物質(zhì)和細(xì)胞材料中的化合物的萃取特別有利。②對(duì)改變操作條件(如壓力、溫度)特別敏感，這就提供了操作上的靈活性和可調(diào)性。③具有低的化學(xué)活性和毒性?！?〕超臨界流體具有以下特點(diǎn)：超臨界CO2成為目前最常用的萃取劑，它具有以下特點(diǎn)：1.CO2臨界溫度為31.1℃，臨界壓力為7.2MPa，臨界條件容易到達(dá)。2.CO2化學(xué)性質(zhì)不活波，無(wú)色無(wú)味無(wú)毒，平安性好。3.價(jià)格廉價(jià)，純度高，容易獲得。因此，CO2特別適合天然產(chǎn)物有效成分的提取?！?〕超臨界CO2的特點(diǎn)：〔3〕應(yīng)用超臨界萃取技術(shù)具有低能耗。無(wú)污染和適用于別離易受熱分解的高沸點(diǎn)物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)。最適用于別離價(jià)值高、難于用常規(guī)方法別離的生物化合物。除了用在化工、醫(yī)藥等行業(yè)外，還可用在煙草、香料、食品等方面。超臨界流體萃取過(guò)程由萃取階段與別離階段組成別離〔4〕超臨界萃取典型流程①等溫法：等溫條件下，萃取相減壓、膨脹，溶質(zhì)從別離槽下部取出。氣體經(jīng)壓縮機(jī)加壓后返回萃取槽。②等壓法：等壓條件下，萃取相加熱、升溫，氣體和溶質(zhì)別離。溶質(zhì)從別離槽下部取出，氣體冷卻、壓縮后回到萃取槽。③吸附法：溶質(zhì)被別離槽中的吸附劑吸附，氣體壓縮后回到別離槽。等溫法〔T1=T2，P1＞P2〕等壓法〔T1＜T2，P1=P2〕吸附法〔T1=T2，P1=P2〕11.8膜別離法定義：是物質(zhì)通過(guò)膜的傳遞速度不同而得到別離。優(yōu)點(diǎn)：過(guò)程一般較簡(jiǎn)單，操作方便，費(fèi)用較低，效率較高，無(wú)相變，可在常溫下操作，既節(jié)能又特別適用于熱敏性物質(zhì)的別離純化，便于維修，有利于生產(chǎn)自動(dòng)化的推廣與普及。1、膜別離特點(diǎn)

※膜的種類、孔徑可以根據(jù)需要選擇

※膜對(duì)于阻止大的粒子或分子透過(guò)的能力很強(qiáng)※把產(chǎn)物分在兩側(cè)，很容易收集樣品※節(jié)能、環(huán)保膜的特性及別離原理所謂的膜，是指在一種流體相內(nèi)或是在兩種流體相之間有一層薄的凝聚相，它把流體相分隔為互不相通的兩局部，并能使這兩局部之間產(chǎn)生傳質(zhì)作用。膜的特性：◆不管膜多薄,它必須有兩個(gè)界面。這兩個(gè)界面分別與兩側(cè)的流體相接觸◆膜傳質(zhì)有選擇性，它可以使流體相中的一種或幾種物質(zhì)透過(guò)，而不允許其它物質(zhì)透過(guò)。膜別離過(guò)程原理：以選擇性透膜為別離介質(zhì)，通過(guò)在膜兩邊施加一個(gè)推動(dòng)力〔如濃度差、壓力差或電壓差等〕時(shí)，使原料側(cè)組分選擇性地透過(guò)膜，以到達(dá)別離提純的目的。通常膜原料側(cè)稱為膜上游，透過(guò)側(cè)稱為膜下游。膜上游透膜膜下游選擇性透膜別離膜種類別離膜高分子膜液體膜生物膜帶電膜非帶電膜陽(yáng)離子膜陰離子膜過(guò)濾膜精密過(guò)濾膜超濾膜反滲透膜納米濾膜膜別離的物理化學(xué)原理截流機(jī)理和篩孔效應(yīng)滲透和滲透壓Donnan效應(yīng)機(jī)械截留〔篩孔效應(yīng)〕物理作用或吸附截留架橋作用網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部截流2.膜別離方法的分類透析超濾反滲透微濾電滲析液膜技術(shù)氣體滲透滲透蒸發(fā)〔1〕微濾：微孔過(guò)濾，利用孔徑0.025μm~14μm的多孔膜，過(guò)濾含有微粒的溶液，將微粒從溶液中除去，到達(dá)凈化、別離和濃縮的目的。推動(dòng)力為壓力差，通常為0.1MPa~0.5MPa?！?〕超濾：濾膜孔徑為lnm~20nm，用于過(guò)濾含有微粒和大分子的溶液。以壓力差為推動(dòng)力，通常為0.1MPa~0.6MPa?！?〕反滲透：用反滲透膜(孔徑0.1nm~1nm)，對(duì)溶液施加壓力，使溶劑通過(guò)反滲透膜，截留所有可溶物而得到別離的操作。反滲透也是以壓力差為推動(dòng)力，操作壓達(dá)3MPa~10MPa。3.膜的材料、結(jié)構(gòu)和性能參數(shù)膜的要求：透過(guò)速度大，選擇性高，非特異性吸附低，機(jī)械強(qiáng)度好，不易被微生物侵襲，耐熱、可高溫滅菌，耐化學(xué)試劑，廉價(jià)等?！?〕制膜的材料種類：天然高分子材料、合成高分子材料和特殊材料。實(shí)際應(yīng)用中，目前以纖維素膜和聚砜膜使用最廣?！?〕表征膜性能的參數(shù)①孔徑的性質(zhì)(包括孔徑、孔徑分布和孔隙度)②水通量③截留率和截?cái)喾肿恿竣芸箟耗芰Β輕H適用范圍⑥對(duì)熱和溶劑的穩(wěn)定性。4.膜的污染與清洗污染：膜在使用中，盡管操作條件保持不變，但通量仍逐漸降低的現(xiàn)象。原因：膜與料液中某一溶質(zhì)的相互作用，或吸附在膜上的溶質(zhì)和其它溶質(zhì)的相互作用而引起的。〔1〕膜的污染②膜的清洗方法a.機(jī)械方法：加海綿球，增大流速，逆洗〔對(duì)中空纖維超濾器〕，脈沖流動(dòng)，超聲波等。b.化學(xué)方法：水、鹽溶液、稀酸、稀堿、外表活性劑、螯合劑、過(guò)氧化氫、酶溶液等清洗劑?！?〕膜的清洗①減輕膜污染的方法a.對(duì)料液進(jìn)行預(yù)處理b.制模時(shí)改變膜的外表極性和電荷〔3〕過(guò)濾方式與裝置膜過(guò)濾的方式有常規(guī)過(guò)濾和切向過(guò)濾兩種。膜別離設(shè)備：平板式膜器管式膜器螺旋卷式膜器中空纖維膜器〔4〕膜別離技術(shù)的應(yīng)用：①菌體、細(xì)胞的別離和收集；②小分子產(chǎn)物的純化，如抗生素、檸檬酸等；③大分子產(chǎn)物的純化，主要是酶制劑等；④純水的制備；⑤純潔水和最終制品中的除菌和除熱源。⑥作膜反響器中的別離部件。11.9吸附別離技術(shù)定義：利用不同組分〔溶質(zhì)〕在吸附劑外表吸附和解吸能力的差異進(jìn)行別離的方法吸附劑吸附質(zhì)脫附：吸附的逆過(guò)程吸附過(guò)程通常包括：待別離料液與吸附劑混合、吸附質(zhì)被吸附到吸附劑外表、料液流出、吸附質(zhì)解吸回收等四個(gè)過(guò)程。料液與吸附劑混合吸附質(zhì)被吸附料液流出吸附質(zhì)解吸附Step1Step2Step3Step4常用于從稀溶液中將溶質(zhì)別離出來(lái)，由于受固體吸附劑的限制，處理能力較??；對(duì)溶質(zhì)的作用較小，這一點(diǎn)在蛋白質(zhì)別離中特別重要；可直接從發(fā)酵液中別離所需的產(chǎn)物，成為發(fā)酵與別離的耦合過(guò)程，從而可消除某些產(chǎn)物對(duì)微生物的抑制作用；溶質(zhì)和吸附劑之間的相互作用及吸附平衡關(guān)系通常是非線性關(guān)系，故設(shè)計(jì)比較復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)的工作量較大。1.吸附法的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：有機(jī)溶劑摻入少操作簡(jiǎn)便，平安，設(shè)備簡(jiǎn)單pH變化小，適于穩(wěn)定性差的物質(zhì)缺點(diǎn)：選擇性差收率低無(wú)機(jī)吸附劑性能不穩(wěn)定不能連續(xù)操作，勞動(dòng)強(qiáng)度大碳粉等吸附劑有粉塵污染2.吸附機(jī)理固體的外表性質(zhì)——固體外表分子〔或原子〕所處的狀態(tài)與固體內(nèi)局部子〔或原子〕所處的狀態(tài)不同。界面固體外表分子(或原子)處于特殊的狀態(tài)。固體內(nèi)局部子所受的力是對(duì)稱的，故彼此處于平衡。但在界面分子的力場(chǎng)是不飽和的，即存在一種固體的外表力，它能從外界吸附分子、原子、或離子，并在吸附外表上形成多分子層或單分子層。實(shí)際過(guò)程中物理和化學(xué)吸附是主要的，比較如下吸附性能物理吸附化學(xué)吸附作用力分子引力（范德華力）剩余化學(xué)鍵力選擇性沒(méi)有選擇性有選擇性吸附層單分子或多分子吸附層只能形成單分子吸附層吸附熱較小，?41.9kj/mol較大，相當(dāng)于化學(xué)反應(yīng)熱，83.7-418.7kj/mol吸附速度快，幾乎不要活化能較慢，需要活化能溫度放熱過(guò)程，低溫有利于吸附溫度升高，吸附速度增加可逆性可逆，較易解析化學(xué)鍵大時(shí)，吸附不可逆2.吸附的類型：〔1〕疏水或非極性吸附劑〔2〕親水和極性吸附劑〔3〕各種離子交換劑多孔型：活性炭、硅膠、硅藻土；大網(wǎng)格吸附劑：有機(jī)高分子材料，如聚苯乙烯，聚酯。凝膠型：纖維素凝膠，瓊脂糖凝膠，匍聚糖凝膠等。吸附別離介質(zhì)〔1〕吸附樹脂指的是一類高分子聚合物。常用的有聚苯乙烯樹脂和聚丙烯酸酯樹脂等。吸附樹脂品種很多，單體的變化和單體上官能團(tuán)的變化賦予樹脂以各種特殊的性能?！?〕吸附樹脂分為非極性、中極性、極性及強(qiáng)極性四類?！?〕吸附樹脂可用于除去廢水中的有機(jī)物，糖液脫色，天然產(chǎn)物和生物化學(xué)制品的別離與精制等。吸附樹脂1)組成結(jié)構(gòu)：有機(jī)高分子聚合物的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)2)特點(diǎn)：選擇性好；解吸容易；機(jī)械強(qiáng)度好；流體阻力較小；價(jià)格高3〕類型：非極性吸附劑——芳香族〔苯乙烯等〕中等極性吸附劑——脂肪族〔甲基丙烯酸酯等〕極性吸附劑——含硫氧、酰氨、氮氧等基團(tuán)吸附,沖洗和洗脫時(shí)間/體積y吸附?jīng)_洗洗脫吸附過(guò)程的影響因素1.吸附劑的特性〔組成結(jié)構(gòu)、容量、穩(wěn)定性〕2.吸附物的性質(zhì)〔熔點(diǎn)、締合、離解、氫鍵等〕3.溶劑〔單、混合〕4.吸附操作條件1〕溫度2〕pH值3〕鹽的濃度應(yīng)用：大孔吸附樹脂廣泛應(yīng)用于制藥及天然植物中活性成分如皂甙、黃酮、內(nèi)脂、生物堿等大分子化合物的提取別離。對(duì)人參皂甙、三七皂甙、淫羊藿黃酮、大豆異黃酮、茶多酚、洋地黃強(qiáng)心甙、麻黃精粉、柚甙、紅豆杉生物堿、多種天然色素、中藥復(fù)方藥物提取等以及生物化學(xué)制品的凈化、別離、回收都有良好的效果。并在抗生素、維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)提純，生化制藥方面有很廣泛的應(yīng)用。11.10離子交換層析技術(shù)定義：利用離子交換劑上的可交換離子與周圍介質(zhì)中被別離的各種離子間的親和力不同，經(jīng)過(guò)交換平衡到達(dá)別離的目的的一種柱層析法。在以離子交換劑為固定相，液體為流動(dòng)相的系統(tǒng)中進(jìn)行。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，重復(fù)性、選擇性好，分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前最常用的層析法之一?！?〕離子交換劑的組成結(jié)構(gòu)及其特性基質(zhì)電荷基團(tuán)反離子商品名纖維素—O—CH2——COO-

·Na+CM-纖維素纖維素-O-（CH2）2-N+H（C2H5）2·Cl-DEAE-纖維素聚苯乙烯——SO3-·

Na+732陽(yáng)離子樹脂聚苯乙烯——N+（CH2）4·Cl-717陰離子樹脂〔2〕離子交換樹脂的形狀結(jié)構(gòu)示意圖示意圖〔離子交換過(guò)程〕電離基團(tuán)〔磺酸根〕可交換離子〔鈉離子〕交換離子不交換離子三、離子交換柱層析原理示意圖柱層析系統(tǒng)的組裝線性和階梯式梯度溶液別離牛血清白蛋白的圖譜11.11凝膠色譜技術(shù)凝膠過(guò)濾法又稱為分子篩層析，是利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)為固定相，根據(jù)分子大小進(jìn)行別離的一種方法。凝膠過(guò)濾所用的介質(zhì)是由交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝膠珠。凝膠珠的內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。單個(gè)凝膠珠本身象“篩子”，不同類型凝膠的篩孔的大小不同。

Services根本原理凝膠過(guò)濾層析過(guò)程示意圖〔1〕要?jiǎng)e離的分子分為三類：A類：dA＞最大孔徑，全排阻〔出〕凝膠對(duì)它無(wú)阻滯，最早流出；C類：dC＜最小孔徑，能進(jìn)入全部孔隙區(qū)，阻滯最大，流速最慢，最晚流出；B類：最小孔徑＜dB＜最大孔徑，進(jìn)入局部孔隙區(qū)大小不同B類分子之間阻滯不同，可以別離把B類分子的別離稱為分級(jí)別離B′B″…把A、B、C類分子間別離稱為組別別離ABC典型的凝膠類型交聯(lián)葡聚糖凝膠：Sephadex聚丙烯酰胺凝膠：Sephacryl瓊脂糖凝膠：Sepharose和Bio-Gel其它：有機(jī)凝膠Sepharon，交聯(lián)聚醚Toyopeal，纖維素凝膠，改性剛性填料等。11.12親和層析技術(shù)定義：利用生物分子物質(zhì)具有的特異的親和力而進(jìn)行別離的一種層析技術(shù)。許多生物大分子具有與其結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的特異分子可逆結(jié)合的特性，如抗原與抗體、酶與底物或抑制劑、激素與受體等，這種結(jié)合往往是特異的而且是可逆的，生物大分子間的這種結(jié)合力稱為親和力?！?〕親和層析的根本特點(diǎn)①純化過(guò)程簡(jiǎn)單、迅速，且別離效率高②特別適用于別離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子③純化倍數(shù)大，產(chǎn)物純度高④必須針對(duì)某一別離對(duì)象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件⑤價(jià)格相對(duì)較昂貴；⑥在洗脫中，交聯(lián)在層析介質(zhì)上的配基可能脫落并進(jìn)入產(chǎn)品中，從而造成不良影響，如抗體、染料等配基。選擇并制備適宜的親和吸附劑是親和層析能否取得成功的關(guān)鍵之一。它包括基質(zhì)和配體的選擇、基質(zhì)的活化、配體與基質(zhì)的偶聯(lián)等。根據(jù)配體對(duì)待別離物質(zhì)的親和性的不同，可以將其分為兩類：特異性配體和通用性配體。特異性配體一般是指只與單一或很少種類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體。如生物素和親和素、抗原和抗體、酶和它的抑制劑、激素－受體等，它們結(jié)合都具有很高的特異性，用這些物質(zhì)作為配體都屬于特異性配體。配體的特異性是保證親和層析高分辨率的重要因素。通用性配體一般是指特異性不是很強(qiáng)，能和某一類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體，如各種凝集素可以結(jié)合各種糖蛋白，核酸可以結(jié)合RNA、結(jié)合RNA的蛋白質(zhì)等。通用性配體對(duì)生物大分子的專一性雖然不如特異性配體，但通過(guò)選擇適宜的洗脫條件也可以得到很高的分辨率。通用配體還具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、偶聯(lián)率高、吸附容量高、易于洗脫、價(jià)