白芍標(biāo)準(zhǔn)湯劑的化學(xué)成分鑒定及其質(zhì)量傳遞規(guī)律研究

白芍標(biāo)準(zhǔn)湯劑的化學(xué)成分鑒定及其質(zhì)量傳遞規(guī)律研究摘要目的：系統(tǒng)研究白芍水煎液的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，建立同時(shí)適用于白芍飲片及其標(biāo)準(zhǔn)煎液的多指標(biāo)含量測(cè)定方法，結(jié)合轉(zhuǎn)移率指標(biāo)揭示兩者之間的質(zhì)量傳遞規(guī)律。方法：采用高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Q-OrbitrapHRMS）對(duì)白芍標(biāo)準(zhǔn)湯劑的化學(xué)成分進(jìn)行鑒別，根據(jù)化合物的質(zhì)譜信息，將其與標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)及文獻(xiàn)內(nèi)容比對(duì)，標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)可以與參考文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì),以達(dá)到對(duì)藥物的化學(xué)信息進(jìn)行更迅速、精確地鑒定。采用高效液相色譜-二極管陣列檢查方法（UPLC-PDA）建立白芍藥材及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑的含量測(cè)定方法，測(cè)定三批白芍飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷的質(zhì)量轉(zhuǎn)移規(guī)律。結(jié)果：鑒定了白芍標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的33個(gè)化學(xué)成分，建立了同時(shí)測(cè)定芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的UPLC含量測(cè)定方法，可同時(shí)適用于白芍飲片其標(biāo)準(zhǔn)湯劑的檢測(cè)。芍藥苷從白芍飲片到白芍標(biāo)準(zhǔn)煎液的轉(zhuǎn)移率為70.70%～80.33%，芍藥內(nèi)酯苷從白芍飲片到白芍標(biāo)準(zhǔn)煎液的轉(zhuǎn)移率為11.65%～24.67%。結(jié)論：本研究通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定了白芍標(biāo)準(zhǔn)煎液的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，建立了適用于白芍飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑中含有的芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量測(cè)定方法，明確了二者之間的質(zhì)量傳遞規(guī)律，為含白芍標(biāo)準(zhǔn)煎液制劑的全程質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的建立提供參考。關(guān)鍵詞白芍；液質(zhì)聯(lián)用；質(zhì)量傳遞規(guī)律；標(biāo)準(zhǔn)煎液StudyonchemicalcompositionidentificationandqualitytransferlawofpaeonialactiflorastandarddecoctionAbstractObjective:Tosystematicallystudythechemicalbasisofpaeonialactifloradecoction,establishamulti-indexcontentdeterminationmethodsuitableforpaeonialactifloradecoctionanditsstandarddecoction,andrevealthemasstransferlawbetweenthembycombiningthetransferrateandtheextractionrate.Methods:UHPLC-Q-OrbitrapHRMSwasusedtosystematicallyidentifythechemicalconstituentsofpaeonialactifloradecoction.AccordingtotheMS1andMS/MSinformationofthecompounds,andcomparedwiththestandard,standardspectrallibraryandreferences,thechemicalinformationofthedrugwasquicklyandaccuratelyidentified.UPLC-PDAwasusedtoestablishthecontentdeterminationmethodofpaeonialactifloradecoctionpiecesandpaeonialactiflorastandarddecoction,andthemasstransferrulesofpaeoniflorinandalbiflorininthreebatchesofpaeonialactifloradecoctionpiecesandtheirstandarddecoctionweredetermined.Results:33chemicalconstituentsinthestandarddecoctionofpaeonialactifloraweresystematicallyidentified,andaUPLCmethodforsimultaneousdeterminationofpaeoniflorinandalbiflorinwasestablished,whichcouldbeappliedtothedetectionofpaeonialactifloradecoctionanditsstandarddecoction.Thetransferrateofpaeoniflorinfrompaeonialactifloradecoctionpiecestopaeonialactiflorastandarddecoctionwas70.70%-80.33%,andthetransferrateofalbiflorinfrompaeonialactifloradecoctionpiecestopaeonialactiflorastandarddecoctionwas11.65%-24.67%.Conclusion:Inthisstudy,thechemicalbasisofthestandarddecoctionofpaeonialactiflorawasidentifiedbyliquidchromatography-massspectrometry,andthecontentdeterminationmethodsofpaeoniflorinandalbiflorinsuitableforpaeonialactifloradecoctionpiecesandtheirstandarddecoctionswereestablished.Thequalitytransferlawbetweenthetwowasclarified,whichprovidedareferencefortheestablishmentofthewholequalitycontrolandqualityevaluationmethodofthestandarddecoctionofpaeonialactiflora.KeywordspaeonialactifloraUPLC-MSqualitytransferlawstandarddecoction

目錄1前言 .1.1鞣質(zhì)類(lèi)化學(xué)成分鑒定鞣質(zhì)類(lèi)結(jié)構(gòu)大多數(shù)由沒(méi)食子酸或其衍生物與葡萄糖結(jié)合而成，沒(méi)食子酸碎片[Gallicacid-H]-可用于此類(lèi)成分的靶向識(shí)別（見(jiàn)圖2）。在保留時(shí)間為6.43min下，準(zhǔn)分子離子峰m/z169.013[M-H]-在負(fù)離子模式下，脫去-CO2后形成特征碎片m/z125，再脫去-H2O形成m/z107-等碎片峰，根據(jù)元素組成分析，該化合物分子式C7H6O5，相對(duì)分子質(zhì)量理論值為169.0143，實(shí)測(cè)值為169.013，據(jù)此推測(cè)該化合物為沒(méi)食子酸。常見(jiàn)的中藥如菝葜、白蘞、半夏、赤芍、牡丹皮、木瓜、山茱萸都含有該成分。圖2單寧化合物可能的裂解規(guī)律4.1.2單萜苷類(lèi)化學(xué)成分鑒定單萜苷結(jié)構(gòu)通常由苯甲酸基、α-蒎烯基和葡萄糖基三部分構(gòu)成，在HCD裂解過(guò)程中通常斷裂三個(gè)部分直接相連的化學(xué)鍵。以芍藥苷為例，其分子離子峰m/z479.1559[M-H]-，裂解過(guò)程逐步產(chǎn)生苯甲酸[C7H5O4-]和α-蒎烯[C9H9O3-]的特征碎片（見(jiàn)圖3）。圖3單萜苷類(lèi)化合物可能的裂解規(guī)律4.2白芍質(zhì)量傳遞規(guī)律研究4.2.1方法學(xué)考察4.2.2專(zhuān)屬性試驗(yàn)測(cè)得樣品色譜圖（見(jiàn)圖4）。檢測(cè)空白溶液時(shí)，未發(fā)現(xiàn)與對(duì)照品及白芍藥材中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷成分保留時(shí)間相同的色譜峰，表明空白溶液對(duì)這兩種待測(cè)成分均沒(méi)有干擾，說(shuō)明該方法的專(zhuān)屬性良好。

1:芍藥內(nèi)酯苷；2：芍藥苷A:空白50%乙醇；B:混標(biāo)溶液；C：白芍飲片供試品；D:白芍標(biāo)準(zhǔn)煎液供試品圖4白芍指紋圖譜4.2.3線性關(guān)系考察根據(jù)線性回歸方程（見(jiàn)圖5）和相關(guān)系數(shù)（見(jiàn)表5）可以得知，芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在實(shí)驗(yàn)條件下表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。指標(biāo)成分線性關(guān)系R2線性范圍芍藥苷y=13948x+551660.99906.563μg/ml~210.000μg/ml芍藥內(nèi)酯苷y=10145x+433800.99913.344μg/ml~107.000μg/ml表5芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷的線性關(guān)系及線性范圍（b）（a）（μV*s（b）（a）（μV*s）（μV*s）（μg/ml）（μg/ml）圖5芍藥苷（a）、芍藥內(nèi)酯苷（b）的線性關(guān)系

4.2.4精密度考察對(duì)于同一供試品溶液進(jìn)行連續(xù)進(jìn)樣6次，在實(shí)驗(yàn)條件下，芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的峰面積RSD分別為0.15%和0.14%，表明儀器具有良好的精密性（見(jiàn)表6）。表6精密度考察指標(biāo)成分芍藥內(nèi)酯苷芍藥苷111833651503121182185157523118679516216411859651642251183605145676118549516164RSD0.15%0.14%4.2.5重復(fù)性考察同一樣品，制備6份供試品溶液，測(cè)定其中的芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷含量。結(jié)果顯示，供試品中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷含量的RSD（n=6）分別為0.74%、0.55%，表明供試品溶液制備方法重復(fù)性良好（詳見(jiàn)表7）。表7重復(fù)性考察指標(biāo)成分芍藥內(nèi)酯苷芍藥苷111833651503121188695198213119295512713411721251863651173895138986119058514052RSD0.74%0.55%

4.2.6穩(wěn)定性考察供試品溶液室溫存放30小時(shí)后，供試品中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷含量峰面積的RSD分別為0.61%、0.43%，表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。（見(jiàn)表8）表8穩(wěn)定性考察指標(biāo)成分芍藥內(nèi)酯苷芍藥苷0h1183365150314h11908251240410h11895151497918h11811151487624h11770951724630h117176510962RSD0.61%0.43%4.2.7中間精密度考察 3位不同實(shí)驗(yàn)人員分別制備5份供試品溶液，芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷的峰面積RSD分別為0.69%和0.47%，小于3%,說(shuō)明方法中間精密度好（見(jiàn)表9）。表9中間精密度考察指標(biāo)成分芍藥內(nèi)酯苷芍藥苷111833651503121176975137433119117510035411775651822451177925173496117792516113711863251704081184195154439119235509881101186445145671111909351374312117602519924131192835150311411944851436115118087516267RSD0.68%0.47%4.2.8加樣回收率考察芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷的加樣回收率在99.81%～103.26%，RSD分別為3.42%，1.57%，結(jié)果表明本研究所建立的分析方法準(zhǔn)確性良好（見(jiàn)表10）。表10加樣回收率考察名稱(chēng)比例樣品量（μg）加標(biāo)量（μg）實(shí)際測(cè)得量（μg）回收率平均回收率芍藥內(nèi)酯苷1:17.397.3914.98102.76%98.20%1:17.397.3914.5897.33%1:17.397.3914.6197.70%1:1.27.398.86816.0296.80%1:1.27.398.86816.1398.22%1:1.27.398.86816.2599.92%1:0.87.395.91213.58103.75%1:0.87.395.91212.9395.01%1:0.87.395.91213.40101.35%芍藥苷1:132.9732.9765.94100.01%98.38%1:132.9732.9765.8899.82%1:132.9732.9765.4798.58%1:1.232.9739.56471.2195.99%1:1.232.9739.56473.44102.74%1:1.232.9739.56473.00101.40%1:0.832.9726.37659.44100.28%1:0.832.9726.37658.1296.29%1:0.832.9726.37659.1399.35%4.2.2白芍質(zhì)量傳遞結(jié)果將所得各自芍藥苷及芍藥內(nèi)酯苷色譜峰面積代入線性方程即得質(zhì)量傳遞結(jié)果（見(jiàn)表11）。芍藥內(nèi)酯苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)移率芍藥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)移率白芍粗粉白芍標(biāo)準(zhǔn)煎液白芍粗粉→白芍水煎液白芍粗粉白芍標(biāo)準(zhǔn)煎液白芍粗粉→白芍水煎液浙江磐安白芍1.406%0.185%13.13%1.166%0.824%70.70%安徽亳州白芍0.953%0.161%24.67%2.487%1.866%75.01%四川中江白芍1.527%0.178%11.65%1.198%0.962%80.33%表11白芍質(zhì)量傳遞結(jié)果5結(jié)論本次研究以芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷兩個(gè)化學(xué)成分作為指標(biāo)成分，是基于化學(xué)成分特有性而決定，白芍作為毛茛科芍藥屬植物，芍藥苷類(lèi)為該屬植物最為主要的單萜苷類(lèi)化合物，芍藥苷是芍藥屬植物的特征性成分之一，具有重要的化學(xué)分類(lèi)學(xué)意義，它是芍藥屬?gòu)拿⒖浦歇?dú)立出來(lái)成為一個(gè)獨(dú)立科和獨(dú)立屬的重要證據(jù)之一；是基于化學(xué)成分有效性而決定，其有效性主要從藥性和藥效兩方面入手，白芍性苦、酸，微寒，歸肝、脾經(jīng)，苦寒藥物主要以生物堿及苷類(lèi)成分為物質(zhì)基礎(chǔ)，其中白芍所含有的白芍苷類(lèi)，是其苦寒性味的來(lái)源，白芍所含有的芍藥總苷類(lèi)是其具有保肝以及止痛等作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，這與傳統(tǒng)藥效認(rèn)為白芍具有柔肝止痛功能相同；是基于化學(xué)成分可測(cè)性而決定，2020年版的《中國(guó)藥典》明確規(guī)定了芍藥苷的測(cè)量方法及限度要求，綜上所述，白芍單萜類(lèi)化合物與白芍的藥效密切相關(guān)，因此作為主要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，可被選為指標(biāo)成分。本次研究以芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷為指標(biāo)成分，建立了一種專(zhuān)屬性的測(cè)定方法，這為白芍的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了科學(xué)依據(jù)。本次研究采用UPLC的方法對(duì)3批來(lái)自不同地區(qū)的白芍藥材及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行含量測(cè)定，并計(jì)算其各自的芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷的質(zhì)量轉(zhuǎn)移規(guī)律。在此之前，首先建立指標(biāo)成分含量測(cè)定的方法，確定其色譜條件，對(duì)照品及供試品溶劑的選擇與溶液制備的方法，再進(jìn)行方法學(xué)的考察，確定方法的可行性，在確定了方法具有良好的專(zhuān)屬性、穩(wěn)定性等的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了白芍的指紋圖譜，標(biāo)定了2個(gè)共有峰，指認(rèn)為芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷，并根據(jù)其共有峰相對(duì)峰面積差異，開(kāi)展指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率指標(biāo)參數(shù)的計(jì)算。結(jié)果表明，芍藥苷的轉(zhuǎn)移率為70.70%～80.33%，芍藥內(nèi)酯苷的轉(zhuǎn)移率為11.65%～24.67%，由于芍藥內(nèi)酯苷酯鍵存在，使得其在水中溶解度降低，轉(zhuǎn)移率比芍藥苷的低。此次研究中使用超高效液相色譜-二極管陣列檢查方法(UPLC-PDA)對(duì)白芍樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)的掃描，UPLC-PDA是一種高效液相色譜技術(shù)，能夠同時(shí)分離、定量、鑒定物質(zhì)。PDA檢測(cè)器是一種分光光度計(jì)，它可以進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的多波長(zhǎng)分析，大大提高了分析樣品的效率和準(zhǔn)確性。在UPLC-PDA檢測(cè)過(guò)程中，樣品通過(guò)色譜柱進(jìn)行分離，通過(guò)PDA檢測(cè)器檢測(cè)每個(gè)樣品組分在不同波長(zhǎng)下的光譜。檢測(cè)器可在各種波長(zhǎng)下進(jìn)行化合物檢測(cè)，從而生成一個(gè)光譜圖。這個(gè)光譜圖可以用于定性和定量分析，因?yàn)槊總€(gè)化合物的光譜圖是唯一的。通過(guò)比較白芍樣品的光譜圖與標(biāo)準(zhǔn)樣品或者數(shù)據(jù)庫(kù)中的光譜圖，可以確定樣品中的化合物種類(lèi)和含量，并且在傳統(tǒng)的HPLC中等的檢測(cè)靈敏度進(jìn)一步改善。綜合比較下，230nm處光譜的基線能更穩(wěn)定，色譜峰數(shù)目更多，吸收強(qiáng)度更均勻。因此，選擇230nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

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