紅心火龍果果皮甜菜紅素提取工藝優(yōu)化及其對(duì)氧化損傷修復(fù)作用研究

紅心火龍果果皮甜菜紅素提取工藝優(yōu)化及其對(duì)氧化損傷修復(fù)作用研究【摘要】目的：優(yōu)化紅心火龍果果皮甜菜紅素的提取工藝，研究甜菜紅素對(duì)氧化損傷后斑馬魚的修復(fù)作用。方法：通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化紅心火龍果果皮中甜菜紅素提取工藝。測(cè)定谷胱甘肽（GSH）含量，建立氧化應(yīng)激模型作為甜菜紅素對(duì)氧化損傷的修復(fù)作用指標(biāo)。利用微分脈沖伏安法測(cè)定，得到斑馬魚腦組織中多巴胺含量并使用ImageJ運(yùn)動(dòng)跟蹤軟件測(cè)量自發(fā)運(yùn)動(dòng)，考察甜菜紅素對(duì)其神經(jīng)毒性的修復(fù)作用。結(jié)果：采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取條件，得到最優(yōu)條件為：乙醇濃度：55%，提取溫度：37℃，總甜菜紅素含量為12.8mg/100g。斑馬魚經(jīng)過(guò)氧化應(yīng)激造模后GSH平均含量為：234.4mg/100g，多巴胺含量為5624ng/g，自發(fā)活動(dòng)表現(xiàn)為行為增強(qiáng)。0.2g/L、0.1g/L、0.05g/L三組實(shí)驗(yàn)組的斑馬魚給藥168h后GSH平均含量分別為258.8mg/100g、289.8mg/100g、365.8mg/100g，多巴胺含量分別為4255ng/g、4248ng/g、4060ng/g，自發(fā)行為表現(xiàn)為平靜。結(jié)論：紅心火龍果果皮甜菜紅素對(duì)氧化損傷后的斑馬魚有修復(fù)作用。【關(guān)鍵詞】紅心火龍果果皮；甜菜紅素；提取工藝；抗氧化活性；氧化應(yīng)激修復(fù)作用；StudyonextractiontechnologyofbetacyaninsfromPitayapeelanditsrepairtooxidativedamage【Abstract】Objective:Optimizetheextractionprocessofbetacyaninsinredpitayapeelandinvestigatethereparativeeffectofbetacyaninsonoxidativedamageinzebrafish.Methods:Optimizetheextractionprocessofbetacyaninfromthepeelofredpitayafruitviaresponsesurfacemethodologyanddeterminetheoptimalextractionconditionsbasedonbetacyanincontent.Determinethecontentofglutathioneandinvestigatetheestablishmentofanoxidativestressmodelandthereparativeeffectsofbetacyaninonoxidativestress.Scanthedopaminecontentinzebrafishbraintissueusingdifferentialpulsevoltammetrytoevaluatethereparativeeffectsofbetacyaninonzebrafishneurotoxicity.MeasurespontaneousmovementsusingImageJmotiontrackingsoftware.Comparetheresultsobtained,andexaminethereparativeeffectsofbetacyaninonoxidativestress.Results:Byusingresponsesurfacemethodologytooptimizetheextractionconditions,theoptimalconditionsweredeterminedtobe:ethanolconcentrationof55%,extractiontemperatureof37°C,andatotalbetacyanincontentof12.8mg/100g.Afterundergoingoxidativestressmodeling,theaverageGSHcontentofzebrafishwas234.4mg/100g,andthedopaminecontentwas5624ng/g.Spontaneousactivitywasenhanced.Followingadministrationof0.2g/L,0.1g/L,and0.05g/Loftheextractfor168hours,theaverageGSHcontentofzebrafishinthethreeexperimentalgroupswas258.8mg/100g,289.8mg/100g,and365.8mg/100g,respectively.Thedopaminecontentinthethreeexperimentalgroupswas4255ng/g,4248ng/g,and4060ng/g,respectively,andspontaneousactivityappearedtobecalm.Conclusion:Betacyaninsfromtheredpitayafruitpeelhavearepairingeffectonzebrafishafteroxidativedamage.【Keywords】RedPitayapeel;Betacyanins;Extractiontechnology;Antioxidantactivity;Oxidativestressrepair目錄TOC\o"1-3"\h\u1前言 前言甜菜紅素（betacyanin）是水溶性色素，屬于吡啶類衍生物，分為紅色的甜菜紅素（Betacyanins）和黃色的甜菜黃素（Betaxanthins）REF_Ref14782\r\h[1]。甜菜紅素是一類含氮的天然色素，由甜菜醛氨酸和環(huán)-3,4-二羥基苯丙氨酸（cyclo-Dopa）共軛生成（如圖1所示），甜菜醛氨酸的共軛雙鍵部分構(gòu)成發(fā)色團(tuán)REF_Ref14835\r\h[2]；最常見(jiàn)的甜菜紅素是甜菜苷（Betanin），即Betanidin-5-O-葡萄糖苷，為游離的Betanidin與葡萄糖結(jié)合形成的糖苷REF_Ref14946\r\h[3，4]。甜菜紅素具有較高的親水性和著色強(qiáng)度，因而可作為食品、藥品及化妝品的重要且有效天然著色劑REF_Ref28885\r\h[4]。紅心火龍果果皮中甜菜紅素作為著色劑添加到相關(guān)食品中且由于其結(jié)構(gòu)的特殊性，除著色作用外甜菜紅素還可以作為天然抗氧化劑，其機(jī)制可能是通過(guò)增強(qiáng)肝細(xì)胞的抗氧化酶活性，降低脂質(zhì)過(guò)氧化，并清除自由基來(lái)實(shí)現(xiàn)的[5]。圖1甜菜醛氯酸（A）、cyclo-Dopa（B）、甜菜苷配基（C）、甜菜苷（D）的化學(xué)結(jié)構(gòu)紅甜菜根、紅火龍果和紅莧菜是甜菜紅素的三大主要來(lái)源，據(jù)統(tǒng)計(jì)其中甜菜紅素的含量范圍為44-51mg/g凍干提取物[6]。其中在紅皮火龍果果皮以及紅皮紅肉的果肉中均含有甜菜紅素，值得注意的是，果皮占整果18%-24%，其甜菜紅素含量為6-22mg/100g[7]，但果皮常被丟棄，故與此同時(shí)丟棄了大量甜菜紅素資源。火龍果來(lái)源的甜菜紅素有8種，其中甜菜苷（betanin）占比最大[8]。目前沒(méi)有單一結(jié)構(gòu)的甜菜紅素標(biāo)品，這在某種程度上制約了相關(guān)研究，其含量測(cè)定方法為大部分學(xué)者利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量其在最大吸收波長(zhǎng)下的吸光度值后計(jì)算[8,9]。用于火龍果源甜菜紅素提取的方法有浸提法、微波輔助提取、超聲波輔助提取、超臨界萃取及雙水相萃取，其中，采用乙醇浸提法的提取量最高，但浸提法耗時(shí)長(zhǎng)，溶劑用量大，總體成本較高[10-14]。氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種刺激時(shí),體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS)過(guò)量產(chǎn)生，超出機(jī)體的清除能力，致氧化和抗氧化狀態(tài)失去平衡，進(jìn)而引起組織氧化損傷[15]，是導(dǎo)致衰老、神經(jīng)退行性疾病、癌癥、高血壓、阿爾茨海默病、帕金森病等疾病的重要因素之一[16-20]。而肝臟是生物代謝主要器官，其中谷胱甘肽含量豐富，毒害后會(huì)出現(xiàn)明顯反應(yīng)[21]。谷胱甘肽(glutathione，GSH)是細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的低分子質(zhì)量硫醇化合物，廣泛分布于人的肝臟、脾臟、腎臟、肺等器官組織和細(xì)胞中[22]。GSH是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的一種三肽（圖2），其主要特點(diǎn)是具有游離的巰基（—SH），易受氧化，是兩種酶GSH-PX和GST的底物，為分解水和過(guò)氧化物必需的，它可以穩(wěn)定含硫醇基團(tuán)的酶，并防止血紅蛋白和其他輔因子的氧化損傷，GSH缺乏或耗盡可能會(huì)導(dǎo)致或加重許多化學(xué)物質(zhì)或環(huán)境因素的中毒，GSH是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的非酶類抗氧化劑，含量豐富，不僅是細(xì)胞內(nèi)抵御氧化應(yīng)激的重要機(jī)制，也是對(duì)抗ROS的重要抗氧化系統(tǒng)防御線，因而GSH的量的多少是衡量機(jī)體的重要因素[23]，谷胱甘肽的測(cè)量方法有比色法、HPLC法、熒光法等。圖2谷胱甘肽結(jié)構(gòu)式氧化應(yīng)激是多巴胺功能細(xì)胞神經(jīng)紊亂的重要原因[24]，是大腦中含量最豐富的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)（圖3），作為調(diào)控人類情緒和能力的重要物質(zhì)，它在人類的運(yùn)動(dòng)功能中也發(fā)揮重要作用。許多研究表面，多巴胺的含量與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種退行性疾病有密切聯(lián)系[25]，同時(shí)許多治療疾病的有效藥物也圍繞著多巴胺的研究而產(chǎn)生。多巴胺作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，主要參與運(yùn)動(dòng)、情感和神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)，多巴胺系統(tǒng)是近30年來(lái)神經(jīng)科學(xué)研究的焦點(diǎn)問(wèn)題之一，一些疾病如帕金森?。≒D）、精神分裂癥、Tourette綜合征（TS）、注意缺陷多動(dòng)障礙（ADHD）等均與多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)傳遞障礙有關(guān)[26]，檢測(cè)多巴胺含量的方法有HPLC法、液相質(zhì)譜聯(lián)用和電化學(xué)分析法。圖3多巴胺結(jié)構(gòu)式關(guān)于體內(nèi)氧化損傷的研究對(duì)象，陳晨[27]研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚是一種常見(jiàn)的神經(jīng)經(jīng)損傷程度的重要因素科學(xué)模式生物，它擁有與人類類似的神經(jīng)發(fā)育等特征，斑馬魚和人類的基因有著70%的同源性，且84%的人類疾病相關(guān)基因都能在斑馬魚組織中找到，作為主要模式生物之一被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和藥物篩進(jìn)等科研領(lǐng)域，所以在對(duì)斑馬魚做出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也多適用于人體，可用于藥物恢復(fù)性的研究及篩選關(guān)于斑馬魚氧化應(yīng)激建模。較多學(xué)者是利用醋酸鉛、AAPH、脂多糖對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行氧化脅迫的造模[28]，并進(jìn)行了幾種建模類型的比較。戊唑醇是一種三唑類殺菌農(nóng)藥，具有高效、廣譜和內(nèi)吸性的特點(diǎn)，該農(nóng)藥可實(shí)現(xiàn)植物的保護(hù)、治療和鏟除三種農(nóng)藥功能，并具備殺菌范圍廣、持續(xù)性強(qiáng)等顯著的特性[29]。對(duì)于暴露在戊唑醇下的斑馬魚，則有氧化應(yīng)激損傷[30]，且伴有神經(jīng)毒性[31]，涉及氧化磷酸化、線粒體功能和脂質(zhì)調(diào)節(jié)的受損。本實(shí)驗(yàn)將圍繞著甜菜紅素出發(fā)，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取紅心火龍果皮甜菜紅素提取的條件，以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用戊唑醇建立氧化應(yīng)激模型，利用比色法測(cè)定斑馬魚肝臟谷胱甘肽含量作為氧化應(yīng)激修復(fù)作用指標(biāo)，利用電化學(xué)分析法測(cè)定斑馬魚大腦多巴胺含量；利用ImageJ斑馬魚運(yùn)動(dòng)行為學(xué)作為神經(jīng)損傷修復(fù)作用指標(biāo)[32]，研究甜菜紅素的體內(nèi)修復(fù)作用。2實(shí)驗(yàn)材料2.1試劑和儀器本實(shí)驗(yàn)所用試劑及儀器如下表1。表1儀器的型號(hào)及廠家名稱型號(hào)/規(guī)格生產(chǎn)廠家電子分析天平ML-204梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司恒溫水浴鍋金壇市科析儀器有限公司烘箱ST-01佛山市順德區(qū)柏吳金屬制品有限公司紫外分光光度計(jì)UV-1750日本島津公司離心機(jī)TD-WS/55湖南平凡科技有限公司電化學(xué)工作站CHI660E/CH上海辰華儀器有限公司無(wú)水乙醇分析純廣州化學(xué)試劑廠紅心火龍果購(gòu)于廣州市小谷圍街道南亭村市場(chǎng)戊唑醇農(nóng)藥生許（浙）0016拜耳股份公司谷胱甘肽試劑盒20220713南京建城生物工程研究所濃鹽酸化學(xué)純廣州化學(xué)試劑廠二甲基亞砜分析純天津市科密化學(xué)試劑有限公司2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Tubingen品系斑馬魚：購(gòu)于南京一樹梨花生物科技有限公司。3實(shí)驗(yàn)方法3.1響應(yīng)面法優(yōu)化甜菜紅素提取根據(jù)響應(yīng)面分析法的原理，參考琚常鑫[4]設(shè)置響應(yīng)面試驗(yàn)影響因素與水平，見(jiàn)表2。表2響應(yīng)面試驗(yàn)影響因素水平與編碼水平水平及編碼-101A乙醇濃度（%）506070B提取溫度（℃）405060C料液比（g/ml）1：51：12.51：20D提取時(shí)間（h）0.511.5稱取紅心火龍果果皮干燥粉末每份1g，分別按照響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素條件進(jìn)行提取。3.2總甜菜紅素的含量測(cè)定參考JiangH等REF_Ref28905\r\h[9]的方法，按式（1），采用紫外-可見(jiàn)分光光度法，計(jì)算其總甜菜紅素含量（TotalBetacyaninsContent(TBC)）的相對(duì)含量。TBC=A538式中：MW=甜菜苷的摩爾質(zhì)量(550gmol?1)，V=樣品的體積(mL)，DF=稀釋倍數(shù)，ε=甜菜苷的摩爾消光系數(shù)(65,000Lmol?1cm?1),L=液層厚度(1cm),W=粗提物重量(g).3.3氧化損傷模型的建立取50尾斑馬魚，分為5組放入培養(yǎng)皿中，每組10尾斑馬魚于1L溶液，分別置于戊唑醇商業(yè)制劑濃度為0.0mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L。暴露48h后記錄每組的死亡個(gè)體數(shù)。3.3.1斑馬魚的運(yùn)動(dòng)行為學(xué)觀察取每組5尾斑馬魚，每尾分別放入培養(yǎng)皿中。將斑馬魚轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿后，待其適應(yīng)培養(yǎng)皿環(huán)境2-3分鐘后，拍攝視屏長(zhǎng)度為2min的動(dòng)作捕捉畫面。使用ImageJ運(yùn)動(dòng)跟蹤軟件以每秒25幀的速度測(cè)量游泳活動(dòng)，在預(yù)定義的場(chǎng)地內(nèi)捕捉游泳動(dòng)作(一個(gè)場(chǎng)地對(duì)應(yīng)一個(gè)孔洞，內(nèi)徑約為120毫米)REF_Ref7054\r\h[32]。對(duì)每個(gè)動(dòng)畫文件設(shè)置檢測(cè)變量，以保證對(duì)所有幼魚的最佳檢測(cè)。隨后，使用ImageJ軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并提供其移動(dòng)距離和靜止時(shí)間，以表征每個(gè)個(gè)體的游泳活動(dòng)。將得到結(jié)果對(duì)比，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。3.3.2斑馬魚組織多巴胺含量測(cè)定將需要解剖的斑馬魚放入冰水混合物中20-30分鐘，觀察斑馬魚不再活躍游動(dòng)。將麻醉后的魚置于泡沫板上，在斑馬魚眼部與尾部固定兩根針。從斑馬魚的腹鰭開始，用解剖剪將斑馬魚腹部劃開至頭部，再沿著脊椎剪至尾部，向下剪至排泄孔，挑開腹部皮膚，可以清晰觀察斑馬魚的內(nèi)臟結(jié)構(gòu)，如下圖4。圖4斑馬魚的內(nèi)臟分布將表面皿清潔干凈后滴入幾滴生理鹽水，后內(nèi)臟團(tuán)置于表面皿內(nèi)生理鹽水滴中，使用解剖針與鑷子將內(nèi)臟團(tuán)分離，只取肝臟部分，將分離出的肝臟置于加入了生理鹽水的離心管中。再將斑馬魚的頭部剪下，使用眼科剪沿著脊椎向著斑馬魚兩眼之間剪開，暴露出腦組織，使用解剖針將腦組織從顱骨中分離，分離后將腦組織置于加入了生理鹽水的離心管中。將已放入肝組織或腦組織的離心管35攝氏度的恒溫水浴，保證組織活性，放置待用。從離心管中取出制得的斑馬魚腦組織，用冰鹽水漂洗，吸水紙吸干，稱重記錄數(shù)據(jù)后放入研磨缽中，加入適量的人工腦脊液，在冰水浴下手動(dòng)研磨5min使組織勻漿化。將勻漿液倒入1.5mL離心管中，2500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上清液進(jìn)行測(cè)定。取1mL上述步驟制得的腦組織上清液于燒杯中，再加入19mL的人工腦脊液，將溶液混合均勻，等待測(cè)定。使用CHI660E電化學(xué)工作站，采用飽和甘汞電極參比電極、鉑片對(duì)電極、制得的修飾碳纖維電極作為工作電極，使用差分脈沖伏安法(DPV)作為測(cè)定方法REF_Ref3029\r\h[33]，在起始電壓為?0.3，終止電壓為0.6V，脈沖振幅為50mV，脈沖寬度為0.2s，脈沖周期為0.5s的條件下測(cè)定，記錄峰高REF_Ref18871\r\h[34]。實(shí)驗(yàn)最佳條件下，在pH=8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，調(diào)節(jié)掃描速率為10mv/s,從-0.4v—0.6v之間進(jìn)行掃描，多巴胺的濃度在至1μg/L—3μg/L范圍內(nèi)與峰電流呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，以縱坐標(biāo)為多巴胺濃度，橫坐標(biāo)為峰電流大小建立多巴胺含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，電流單位為A，濃度單位為μg/L。按下列公式計(jì)算（2）斑馬魚腦組織中多巴胺含量。斑馬魚腦組織中多巴胺含量=溶液中多巴胺濃度*20*103.3.3斑馬魚肝組織谷胱甘肽含量測(cè)定從離心管中取出制得的斑馬魚肝組織，用冰鹽水漂洗，吸水紙吸干，稱重記錄數(shù)據(jù)后放入研磨缽中，加入適量的勻漿遞質(zhì)，在冰水浴下手動(dòng)研磨5min使組織勻漿化。將勻漿液倒入1.5mL離心管中，2500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上清液進(jìn)行測(cè)定。使用谷胱甘肽測(cè)定試劑盒進(jìn)行斑馬魚肝臟組織谷胱甘肽測(cè)定，按照試劑盒說(shuō)明書配置好需要的試液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液（100μmol/LGSH）。于420nm處，1cm光徑，測(cè)定各管吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照試劑盒說(shuō)明書配置好需要的試液，準(zhǔn)備上述步驟制得的肝臟組織勻漿液，開始測(cè)定。首先取10%肝臟勻漿液上清液0.5mL，與試劑盒中試劑一應(yīng)用液2mL混勻，3500-4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清液1mL進(jìn)行顯色反應(yīng)。在測(cè)定管中加入1mL上述步驟制得的肝組織上清液，與試劑盒中試劑二1.25mL，試劑三0.25mL，試劑四0.05mL混合均勻。在空白管加入試劑盒中試劑一應(yīng)用液1.0mL，試劑二1.25mL，試劑三0.25mL，試劑四0.05mL。靜置五分鐘顯色，使用紫外可見(jiàn)光光度計(jì)，在420nm處，1cm光徑，雙蒸水調(diào)零比色后測(cè)量各管OD值，平行測(cè)量三次，記錄數(shù)據(jù)，所得OD值查標(biāo)準(zhǔn)曲線上所對(duì)應(yīng)的濃度，并計(jì)算給藥組與正常組肝臟中谷胱甘肽含量比值。按照3.3.1方法測(cè)定模型組斑馬魚的運(yùn)動(dòng)軌跡及其軌跡參數(shù)后與正常組斑馬魚相比較，比較數(shù)據(jù)；按照3.3.2和3.3.3的方法測(cè)定模型組斑馬魚的谷胱甘肽含量及其多巴胺含量進(jìn)行比較，以上數(shù)據(jù)作為評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激模型建立成功與否的指標(biāo)。確定氧化應(yīng)激模型建立的給藥濃度后，以此濃度給藥，養(yǎng)殖96h，作為模型組備用。3.4甜菜紅素的氧化應(yīng)激修復(fù)作用取0.2g/L、0.1g/L、0.05g/L作為三組實(shí)驗(yàn)組的給藥濃度，1%的DMSO為溶劑，給藥期為168h，每組1L，10尾斑馬魚。以1L1%DMSO養(yǎng)殖264h，10尾斑馬魚作為溶劑（DMSO）組。以1L蒸餾水養(yǎng)殖264h，10尾斑馬魚作為空白組。損傷96h后的實(shí)驗(yàn)組繼續(xù)給予1%DMSO養(yǎng)殖168h，作為模型組。按照3.3.2方法測(cè)定實(shí)驗(yàn)組、空白組、溶劑組和模型組斑馬魚的運(yùn)動(dòng)軌跡及其軌跡參數(shù)，記錄數(shù)據(jù)。按照3.3.2和3.3.3的方法測(cè)定實(shí)驗(yàn)組、空白組、溶劑組和模型組斑馬魚的谷胱甘肽含量及其多巴胺含量，記錄數(shù)據(jù)，作為判斷甜菜紅素氧化應(yīng)激修復(fù)作用的指標(biāo)。4結(jié)果與討論4.1響應(yīng)面分析法優(yōu)化甜菜紅素的提取4.1.1響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析在單因素的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面方案進(jìn)一步試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表3。表3響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果編號(hào)No.A乙醇濃度/（%）B溫度/（°C）C料液比/（0.01mL·g-1）D提取時(shí)間/（min）TBC(mg/100g)140300.125604.94260300.1256010.7340500.125602.86460500.125604.52550400.05305.87650400.2309.48750400.059011.5850400.29012.5940400.125303.871060400.125307.281140400.125907.591260400.1259011.71350300.05609.531450500.05605.261550300.26011.51650500.2605.861740400.05606.341860400.056010.71940400.2608.512060400.26012.32150300.125304.232250500.125303.032350300.1259010.02450500.125904.552550400.1256011.32650400.1256012.42750400.1256012.02850400.1256012.42950400.1256011.34.1.2響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性檢驗(yàn)用DesignExpert8.0.6分析軟件建立方程：Y=11.94+1.94×A-2.08×B+0.9194×C+2.02×D-1.04×AB-0.1469×AC+0.1780×AD-0.3559×BC-1.07×BD-0.6444×CD-2.24×A2-4.03×B2+0.0216×C2-2.20×D2,模型的回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)及結(jié)果見(jiàn)圖7。由模型的“P值”＜0.0001可知該回歸方程模型達(dá)到了極顯著的水平，可靠性較高；決定系數(shù)R2=98.71%；注：R2=0.9871,RAdj2圖5模型回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)及結(jié)果4.1.3單因素交互作用由DesignExpert8.0.6分析軟件得到最佳提取為乙醇濃度55%，溫度37℃，料液比1：7.6g/mL，提取時(shí)間69min，甜菜紅素的理論含量為12.8mg/100g。反應(yīng)面更陡峭，意味著各個(gè)因素之間的相互影響更大，各因子相互作用等高線和曲面圖在圖6-11中顯示。A:乙醇濃度B：溫度圖6乙醇濃度和提取溫度對(duì)甜菜紅素含量的等高線及曲面圖由圖6知，乙醇濃度一定時(shí)，甜菜紅素含量隨著提取溫度的增加而增加，達(dá)到最大值后逐漸下降。且曲面陡峭、等高線偏向橢圓，說(shuō)明乙醇濃度（A）和溫度（B）之間交互作用較強(qiáng)。A：乙醇濃度C：料液比圖7乙醇濃度和料液比對(duì)甜菜紅素含量的等高線及曲面圖由圖7知，乙醇濃度一定時(shí)，甜菜紅素含量隨著料液比的增加而增加，達(dá)到最大值后逐漸下降。且曲面較為平淡，表面乙醇濃度（A）和料液比（C）之間的交互作用較弱。A:乙醇濃度D：提取時(shí)間圖8乙醇濃度和提取時(shí)間對(duì)甜菜紅素含量的等高線及曲面圖由圖8知，乙醇濃度一定時(shí)，甜菜紅素含量隨著提取時(shí)間的增加而增加，達(dá)到最大值后逐漸下降。且曲面陡峭、等高線偏向橢圓，說(shuō)明乙醇濃度（A）和提取時(shí)間（D）之間交互作用較強(qiáng)。B：提取溫度C：料液比圖9提取溫度和料液比對(duì)甜菜紅素含量的等高線及曲面圖由圖9知，提取溫度一定時(shí)，甜菜紅素含量隨著料液比的增加而增加，達(dá)到最大值后逐漸下降。且曲面陡峭、等高線偏向橢圓，說(shuō)明提取溫度（B）和料液比（C）之間交互作用較強(qiáng)。B：提取溫度D：提取時(shí)間圖10提取溫度和提取時(shí)間對(duì)甜菜紅素含量的等高線及曲面圖由圖10知，提取溫度一定時(shí)，甜菜紅素含量隨著提取時(shí)間的增加而增加，達(dá)到最大值后逐漸下降。且曲面陡峭、等高線偏向橢圓，說(shuō)明提取溫度（B）和提取時(shí)間（D）之間交互作用較強(qiáng)。C：料液比D：提取時(shí)間圖11液料比和提取時(shí)間對(duì)甜菜紅素含量的等高線及曲面圖由圖11知，料液比一定時(shí)，甜菜紅素含量隨著提取時(shí)間的增加而增加，達(dá)到最大值后逐漸下降。且曲面較為平淡，表面料液比（C）和提取時(shí)間（D）之間的交互作用較弱。4.2氧化應(yīng)激模型的建立如表4所示，當(dāng)戊唑醇濃度為0.5mg/L死亡個(gè)體為0，致死率為0%，故使用0.5mg/L的戊唑醇作為我們的安全劑量組。表4戊唑醇給藥濃度及其致死率戊唑醇濃度（mg.L）死亡數(shù)（尾）致死率（%）0.0000.5000.74401.07702.010100空白組、模型組斑馬魚2min內(nèi)運(yùn)動(dòng)軌跡捕捉如圖12所示。由運(yùn)動(dòng)軌跡可明顯看出，在建模后斑馬魚自發(fā)行為軌跡明顯混亂，產(chǎn)生明顯行為增強(qiáng)。模型組的斑馬魚更喜愛(ài)想中央?yún)^(qū)域游動(dòng)，活躍性較高；而空白組則相對(duì)安靜，活躍性較低。從行為參數(shù)上分析，模型組靜止時(shí)間為最短，即其運(yùn)動(dòng)最為活躍；空白組則相較靜止時(shí)間長(zhǎng)，即其運(yùn)動(dòng)更為安靜。靜止時(shí)間對(duì)比，空白組與模型組差異較顯著，說(shuō)明氧化應(yīng)激模型建立成功。從移動(dòng)距離上分析可知，模型組移動(dòng)距離較長(zhǎng)，處于活躍狀態(tài)，與空白組相比，移動(dòng)距離差異較顯著。結(jié)果表明，模型組行為學(xué)上表現(xiàn)為明顯行為增強(qiáng)。注：*與空白組相比，p＜0.05，差異較顯著;**與空白組相比，差異顯著；p<0.01，差異高度顯著；***與空白組相比，p<0.001，差異極顯著A:空白組與模型組運(yùn)動(dòng)軌跡B：2min內(nèi)運(yùn)動(dòng)距離對(duì)比及顯著性差異C：2min內(nèi)靜止時(shí)間對(duì)比及顯著性差異圖122min內(nèi)斑馬魚自發(fā)行為運(yùn)動(dòng)對(duì)比多巴胺含量標(biāo)準(zhǔn)曲線：多巴胺的濃度在至1μg/L-3μg/L范圍內(nèi)與峰電流呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(如圖13)，回歸方程為：，縱坐標(biāo)為多巴胺濃度，橫坐標(biāo)為峰電流大小。電流單位為A，濃度單位為μg/L，相關(guān)系數(shù)r=0.9957。圖13多巴胺含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖將空白組與模型組斑馬魚解剖后，將腦組織按照“3.3.3斑馬魚腦組織多巴胺含量測(cè)定”方法檢測(cè)，結(jié)果如表5和圖14。對(duì)比可看出模型組多巴胺含量有較顯著上升，說(shuō)明建模后斑馬魚有神經(jīng)損傷，氧化應(yīng)激模型建立成功。表5不同組魚的多巴胺峰電流與含量斑馬魚腦組織質(zhì)量（mg）平均峰電流（10-6A）溶液中多巴胺濃度（μg/L）斑馬魚組織多巴胺含量（ng/g）空白組10.62.0282.0684595模型組10.32.3892.5315624注：*與空白組相比，p＜0.05，差異較顯著;**與空白組相比，差異顯著；p<0.01，差異高度顯著；***與空白組相比，p<0.001，差異極顯著圖14模型組與空白組多巴胺含量對(duì)比圖谷胱甘肽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線：如圖16所示，谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0038-0.0021，r=0.9987，擬合程度較好。空白組與模型組肝組織中GSH含量如圖15所示，可明顯看出模型組斑馬魚肝組織內(nèi)GSH含量明顯下降，說(shuō)明建模后斑馬魚肝臟存在明顯氧化應(yīng)激損傷，該模型可應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。A:GSH含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖B:GSH含量對(duì)比圖圖15GSH含量圖4.3甜菜紅素的氧化應(yīng)激修復(fù)作用空白組、溶劑（DMSO）組、實(shí)驗(yàn)組、模型組組斑馬魚2min內(nèi)運(yùn)動(dòng)軌跡捕捉如圖16,17所示。模型組的斑馬魚更喜愛(ài)想中央?yún)^(qū)域游動(dòng)，活躍性較高；而實(shí)驗(yàn)組則相對(duì)安靜，活躍性較低。由圖中可知，模型組運(yùn)動(dòng)距離最長(zhǎng)，且其運(yùn)動(dòng)距離顯著高于空白組，說(shuō)明其有明顯行為增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)組運(yùn)動(dòng)距離與空白組無(wú)明顯差距，說(shuō)明甜菜紅素對(duì)斑馬魚氧化應(yīng)激造成的行為增強(qiáng)有明顯修復(fù)作用。模型組靜止時(shí)間為最短，即其運(yùn)動(dòng)最為活躍，且模型組靜止時(shí)間與空白組相比顯著降低；實(shí)驗(yàn)組靜止時(shí)間最長(zhǎng)，即其運(yùn)動(dòng)最為安靜，且其靜止時(shí)間與空白組相比無(wú)明顯差異，說(shuō)明甜菜紅素對(duì)氧化應(yīng)激有明顯修復(fù)作用。結(jié)果表明，正常組的斑馬魚活動(dòng)規(guī)律正常，勻速平緩在觀察孔中游動(dòng)，戊唑醇導(dǎo)致斑馬魚行為增強(qiáng)，給予甜菜紅素則會(huì)使斑馬魚有所恢復(fù)。另外，溶劑（DMSO）組與正常組無(wú)明顯差異，可以認(rèn)為溶劑毒性不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。A:空白組B:模型組C:溶劑（DMSO）組D：0.05g/L組E:0.1g/L組F:0.2g/L組圖162min內(nèi)斑馬魚運(yùn)動(dòng)軌跡注：*與空白組相比，p＜0.05;**與空白組相比，p<0.01；***與空白組相比，p<0.001；ns與空白組相比，p>0.05A:斑馬魚運(yùn)動(dòng)距離對(duì)比B:斑馬魚靜止時(shí)間對(duì)比圖172min內(nèi)斑馬魚自發(fā)行為運(yùn)動(dòng)數(shù)據(jù)對(duì)比將空白組、模型組和溶劑（DMSO）組和實(shí)驗(yàn)組（0.05g/L）斑馬魚解剖后，將腦組織按照“3.3.2斑馬魚腦組織多巴胺含量測(cè)定”方法檢測(cè)，結(jié)果如圖18。由數(shù)據(jù)可知，三組實(shí)驗(yàn)組組給藥后多巴胺濃度均恢復(fù)至正常水平，說(shuō)明給藥可以緩解其氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的神經(jīng)毒性作用。另外，溶劑（DMSO）組與正常組無(wú)明顯差異，可以認(rèn)為溶劑毒性不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖18空白組、模型組和溶劑（DMSO）組和實(shí)驗(yàn)組多巴胺含量對(duì)比圖給予0.2g/L、0.1g/L、0.05g/L甜菜紅素濃縮物養(yǎng)殖后的斑馬魚、空白組、溶劑（DMSO）組和毒性組肝臟中GSH含量如圖19所示，模型組相較于空白組GSH含量顯著下降，給藥后明顯恢復(fù)，且劑量越高恢復(fù)作用越好。0.2g/L劑量組與正常組之間不存在顯著差異，可以認(rèn)為基本上恢復(fù)到正常水準(zhǔn)。說(shuō)明甜菜紅素給藥后可以起到明顯的氧化應(yīng)激修復(fù)作用。另外，溶劑（DMSO）組與正常組無(wú)明顯差異，可以認(rèn)為溶劑毒性不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖19斑馬魚GSH含量對(duì)比及顯著性檢測(cè)注：*與空白組相比，p＜0.05，差異較顯著;**與空白組相比，差異顯著；p<0.01，差異高度顯著；***與空白組相比，p<0.001，差異極顯著5結(jié)論采用響應(yīng)面法得到最佳提取為乙醇濃度55%，溫度37℃，料液比1：7.6g/mL，提取時(shí)間69min，此條件下甜菜紅素的平均含量為12.8mg/100g。模型組斑馬魚自發(fā)行為更為頻繁，其運(yùn)動(dòng)參數(shù)皆高于空白組，呈差異顯著，說(shuō)明戊唑醇可造成斑馬魚行為增強(qiáng)，氧化應(yīng)激模型建立成功。模型組多巴胺含量相較于空白組增加，說(shuō)明戊唑醇有神經(jīng)毒性作用。模型組斑馬魚谷胱甘肽含量明顯低于正常組，模型組與空白組GSH含量存在顯著性差異，說(shuō)明以戊唑醇喂養(yǎng)斑馬魚建立氧化應(yīng)激模型效果好。模型組斑馬魚肝組織GSH含量顯著低于空白組，實(shí)驗(yàn)組GSH含量與空白組無(wú)顯著性差異；斑馬魚腦組織中模型組的多巴胺含量略高于空白組，實(shí)驗(yàn)組給藥后皆恢復(fù)到與空白組無(wú)顯著差異；模型組斑馬魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)靜止時(shí)間顯著低于其他組，自發(fā)運(yùn)動(dòng)距離顯著高于其他組，實(shí)驗(yàn)組皆與空白組無(wú)顯著性差異，說(shuō)明紅心火龍果果皮甜菜紅素對(duì)氧化損傷有修復(fù)作用，且0.2g/L為紅心火龍果果皮甜菜紅素最有效劑量。參考文獻(xiàn)CelliGB,BrooksMS.Impactofextractionandprocessingconditionsonbetalainsandcomparisonofpropertieswithanthocyanins-Acurrentreview[J].FoodResearchInternational,2017,100:501-509.Rodriguez-AmayaDB.Updateonnaturalfoodpigments-Amini-reviewoncarotenoids,anthocyanins,andbetalains[J].FoodResearchInternational,2019,124:200-205.AzeredoHMC.Betalains:properties,sources,applications,andstability-Areview[J].InternationalJournalofFoodScienceandTechnology,2009,44:2365-2376.琚常鑫.紅心火龍果甜菜紅素對(duì)楊梅花色苷的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)及相互作用研究[D].杭州:浙江大學(xué),2022.劉琪龍.甜菜紅素對(duì)酒精性肝損傷保護(hù)作用及其咀嚼片的研制[D].烏魯木齊:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué).2020.XIYUY,YANQ,MANZ,etal.Developmentofactiveandsmartpackagingfilmsbasedonstarch,polyvinylalcoholandbetacyaninsfromdifferentplantsources[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2021,183:358-368.陳冠林．紅肉火龍果色素提取、純化及其抗氧化、降血脂作用的研究[D]．廣州:廣東藥科大學(xué),2013．呂亞文,朱文嫻,廖紅梅.火龍果來(lái)源甜菜紅素的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè):1-11.JiangH,ZhangW,LiX,etal.Nutrition,phytochemicalprofile,bioactivitiesandapplicationsinfoodindustryofpitaya(Hylocereusspp.)peels:Acomprehensivereview[J].TrendsinFoodScience&Technology,2021,116:199-217朱文嫻,夏必幫,廖紅梅,等.四種紅肉火龍果品種制汁適宜性評(píng)價(jià)研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2020,46:167-173．HERBACHKM,ROHEM,STINTZINGFC,etal.Structuralandchromaticstabilityofpurplepitaya(Hylocereuspolyrhizus[Weber]Britton&Rose)betacyaninsasaffectedbythejuicematrixandselectedadditives[J].FoodResearchInternational,2006,39:667-677.StintzingFC,SchieberA,CarleR.Betacyaninsinfruitsfromred-purplepitaya,Hylocereuspolyrhizus(Weber)Britton&Rose[J].FoodChemistry,2002,77:101-106.JalgaonkarK,MahawarMK,BibweB,etal.Postharvestprofile,processingandwasteutilizationofdragonfruit(HylocereusSpp.):Areview[J].FoodReviewsInternational,2020:1-27.FerreiraVC,AmpeseLC,SganzerlaWG,etal.Anupdatedreviewofrecentapplicationsandfutureperspectivesonthesustainablevalorizationofpitaya(Hylocereusspp.)by-products[J].SustainableChemistryandPharmacy,2023,33,101070:1-18.葉青青,袁鳳梅,袁際學(xué)等.高原有氧訓(xùn)練對(duì)機(jī)體還原型谷胱甘肽水平的影響及機(jī)制[C].第十二屆全國(guó)體育科學(xué)大會(huì).中國(guó)山東日照.2022-03-25.施偉麗,袁蓉,信琪琪等.氧化應(yīng)激與高血壓[J].醫(yī)學(xué)綜述,2018,24:642-650.張維,王紅芳,胥保華.生物衰老的主要分子機(jī)制概述[J].生物技術(shù)進(jìn)展,2023,13:228-233.楊麗嬪,朱珍珠,雷紅等.花青素對(duì)神經(jīng)退行性疾病保護(hù)作用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2021,27:40-45.陳渝春,馮蘭超