醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)在新型冠狀肺炎檢測中的進展

摘要2019年12月在湖北武漢出現(xiàn)不明原因的肺炎，發(fā)生了一定規(guī)模程度的感染，出現(xiàn)了不同程度聚集性傳入，最終被專家均明確診斷為病毒性肺炎和肺部感染，世界衛(wèi)生組織將該病毒命名為2019新型冠狀病毒（2019-nCoV），SARS-CoV-2是β屬冠狀病毒。該病毒傳染性強，隱蔽性高，主要通過接觸傳播和飛沫傳播，患者初期會出現(xiàn)全身發(fā)熱，干咳，乏力及呼吸困難等癥狀，嚴重者表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征，甚至死亡。因此，選擇合適的檢測技術(shù)和方法可以做出準確，快速的鑒定，在發(fā)生大規(guī)模的聚集性疫情和疫情多區(qū)域爆發(fā)流行提供更好的檢測方法，同時應(yīng)盡量減少外出活動并避免去疾病正在流行的地區(qū)，新型冠狀病毒可以在人與人之間傳播，通常是在與被感染的患者密切接觸或接觸被污染的物品而所造成的感染，在出現(xiàn)發(fā)熱，乏力，呼吸困難和與發(fā)病病例接觸后，應(yīng)及時去醫(yī)院規(guī)定的發(fā)熱門診就診，不可乘坐公共交通工具，避免造成二次感染。關(guān)鍵詞：肺炎；新型冠狀；病毒檢測；檢測技術(shù)引言新型冠狀病毒為β種屬冠狀病毒，為單鏈正股RNA病毒[1]，它與2002年在中國廣東省首次發(fā)生的嚴重急性呼吸綜合征，2012年在沙特阿拉伯暴發(fā)的中東呼吸綜合征都屬于同一種病毒。它的表面為圓形或橢圓形，并且有向外突起的包膜，新型冠狀病毒的直徑為40-160nm。病毒的表面有三種蛋白,S蛋白.M蛋白.E蛋白，S蛋白可以與宿主表面受體相結(jié)合[2]，M蛋白參與病毒包膜和人體細胞包膜相融合的過程。該病毒癥狀一般為發(fā)熱、乏力、干咳、逐漸出現(xiàn)呼吸困難，嚴重者表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征，膿毒癥休克。該病毒已確認存在人傳人現(xiàn)象，且潛伏期具有傳染性。新型冠狀病毒總體上來說它的結(jié)構(gòu)非常簡單，并且沒有完整的細胞結(jié)構(gòu)，需要通過人、動物等宿主吸取宿主本身的營養(yǎng)去進行生存，所以在自然界中的病毒十分脆弱，我們可以通過高溫高壓紫外線照射和乙醇來進行室內(nèi)消毒，可以通過改變新型冠狀病毒的理化性質(zhì)，采取實際的方法進行日常消毒，同時及時接種疫苗可以有效預(yù)防新型冠狀病毒型肺炎。1新型冠狀病毒的檢測技術(shù)1.1實時熒光定量PCR（RT-PCR)實時熒光定量PCR屬于第二代PCR技術(shù)，也稱聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)，可以對核酸進行定量檢測，該方法利用核酸擴增時產(chǎn)生的擴增曲線來對初始濃度進行定量計算[3]，通過聚合酶鏈式反應(yīng)，在體外對病毒的RNA進行擴增，通過觀察Y熒光來判斷人體內(nèi)含有的病毒，感染者本身病毒量很少，需要進行擴增才可以觀察到病毒RNA，CT值即病毒RNA在體外擴增的次數(shù)。SARS-CoV-2實時熒光RT-PCR法試劑盒檢測主要分為開放閱讀框1ab(openreadingframe1ab，OＲF1ab)基因、核殼蛋白基因N片段和包膜蛋白基因E片段3個靶點或ORF1ab和N片段2個靶點已有研究證實，SARS－CoV-2基因組結(jié)構(gòu)自上而下依次由５′非翻譯區(qū)（UTR）、轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物（orf1ab）、S基因、E基因、M基因、N基因和３′UTR及幾個未知非閱讀編碼框序列組成[4]。根據(jù)理論上，檢測的位點越多，其準確度就約高，但在實際的操作應(yīng)用中，目的點越多，引物和探針的設(shè)計就越復(fù)雜，因此現(xiàn)有的核酸檢測試劑盒分為單個位點，雙位點和三位點[5]，位點設(shè)計的不完全，還會導(dǎo)致檢測陽性率下降，造成檢測結(jié)果的不準確，新型冠狀病毒的遺傳物質(zhì)為單鏈RNA。在進行核酸檢測的過程中包括逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增兩部分，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下被逆轉(zhuǎn)錄為cRNA,然后在DNA聚合酶的作用下對cDNA進行擴增，通過對擴增曲線ct值，可以判斷出是否含有病毒和病毒的載量。根據(jù)最新的防疫政策，將新冠病毒陰性診斷標準從CT值＞40調(diào)整到CT值＞35，實際上是下調(diào)了核酸檢驗陽性的敏感度，可以很大的減少了定點醫(yī)院的收治壓力，優(yōu)化了醫(yī)療資源的分配，也是為了讓感染者盡早回歸正常的生活，CT值＞35病毒載量較低，并不會導(dǎo)致傳染，或者是已治愈的新冠患者在恢復(fù)期內(nèi)也可能存在這種狀況。如果標本中的RNA數(shù)量很低可能影響最終的擴增效果，導(dǎo)致結(jié)果呈假陰性[6]，盡管實時熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測針對于病毒的保守區(qū)域進行設(shè)計，但由于RNA病毒本身易于出現(xiàn)基因變異，引物，探針和目標序列之間由于病毒改變了基因位點而造成檢測性能的下降而造成假陰性的后果，用于檢測新型冠狀病毒的標本類型有上呼吸道吸物.支氣管灌洗液.肺泡灌洗液.深咳痰液.眼結(jié)膜拭子.糞便標本和抗凝血標本，根據(jù)目前進行大規(guī)模核酸采集和快速檢測的方向，咽拭子和鼻咽拭子為最佳選擇。1.2基因測序技術(shù)基因測序技術(shù)通過對病毒全基因組的序列，可以幫助人們?nèi)チ私獠《镜倪z傳信息，指導(dǎo)研究核酸檢測產(chǎn)品開發(fā)新的治療方法和研究疫苗，研究病毒的進化或阻止疫情大規(guī)模爆發(fā)和控制疫情的發(fā)展起到了至關(guān)重要的作用。宏基因組二代測序(mNGS)主要是用來對微生物基因組序列進行高通量的測序，無須再分離培養(yǎng)微生物，mNGS可以直接從原始臨床樣本中調(diào)查感染微生物[7]，但在未知病原體是何類型病毒時，基于RNA的mNGS方法可以揭示生物體內(nèi)的整個感染情況，包括DNA病毒RNA病毒、細菌、真菌等[8]，而且錯誤率低，對新型冠狀病毒分析和鑒定的完成，明確病毒的起源和進化，對疾病的控制、預(yù)防和針對性治療有重大意義，但基因測序的時間長，對操作人員和儀器設(shè)備的要求高，不適合用于在發(fā)生大規(guī)模的聚集性疫情和疫情多區(qū)域爆發(fā)流行進行檢測。同時，新型冠狀病毒會產(chǎn)生不斷發(fā)生變異，如果病毒的校對機制較為完整和嚴格，上下代的基因會保持完全一致。但是新型冠狀病毒屬于RNA病毒，在復(fù)制的過程中校對機制相對不嚴格，所以會產(chǎn)生變異，如最近由外國傳入我國的德爾塔新冠肺炎病毒和奧秘克戎新型冠狀病毒，已經(jīng)出現(xiàn)了不同程度的變異，我們應(yīng)及時對病毒進行基因分析，可為后續(xù)該病毒研究新的治療方法和檢測較為穩(wěn)定的保守區(qū)設(shè)計試劑盒。如果試劑盒的靶點相對應(yīng)的基因位點發(fā)生突變，有可能造成檢測結(jié)果的不準確，還有可能會使新冠病毒的傳染性加強，甚至使現(xiàn)有的疫苗效果變差，具體還需要通過基因測序技術(shù)進行分析。1.3特異性抗體檢測在一般情況下，機體受到病毒的侵害時，會誘發(fā)固有免疫應(yīng)答。機體針表面因子產(chǎn)生的特異性的T細胞和B細胞，病毒的表面因子與細胞表面受體相結(jié)合，感染初期IgM抗體大量產(chǎn)生，并且迅速達到峰值，但維持的時間短，是急性感染期的重要診斷指標，之后IgG抗體為主要，IgG持續(xù)時間長[9]，可在痊愈后的一段時間內(nèi)高水平維持，提示感染后期或有既往感染史。目前，已經(jīng)有大量關(guān)于抗體檢測方法的報道。SARS-CoV-2IgM抗體的膠體金免疫層析試劑盒[10]，據(jù)介紹只需一滴血15分鐘就可以出結(jié)果，該測對場所及人員的限制，縮短檢測用時，已經(jīng)與核試劑盒檢測具有簡單高效的特點，打破了現(xiàn)有檢驗。例如，鐘南山院士指導(dǎo)研發(fā)的基于檢測血液中酸檢測等技術(shù)聯(lián)合用于一線病毒感染的監(jiān)測評估[11]。近期針對奧秘克戎的傳播特點，推廣抗原篩查、核酸診斷的監(jiān)測模式，有利于早發(fā)現(xiàn)，提高監(jiān)測靈敏度，隔離觀察場所是抗原檢測最重要的應(yīng)用場景，可以減輕核酸檢測人員的壓力，同時減少核酸檢測人員感染的風(fēng)險，對特定人群篩查起到了重要的作用。特異性抗體檢驗最重要的是獲得病毒感染后T細胞產(chǎn)生特異性應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體，由于抗體的產(chǎn)生和消失是一個動態(tài)過程，選擇合適的采樣時機非常重要，但是由于對SARA-Cov-2免疫問題缺乏深入的研究，對SARS-CoV-2的抗體試劑研發(fā)也帶來了極大的困難，并且血液中的有些成分如類風(fēng)濕因子、非特異IgM、溶血所致的高濃度血紅蛋白等可能存在假陽性的結(jié)果?；瘜W(xué)發(fā)光法靈敏度高準確度好，但由于需要對被檢測人員進行抽血，離心，還有需要全自動化學(xué)發(fā)光儀，在面對規(guī)模的聚集性疫情和疫情多區(qū)域爆發(fā)流行進行檢測時無法快速檢測出結(jié)果，需要的試劑也較為昂貴，所以不太適用于大規(guī)模檢測，免疫膠體金法靈敏度高準確度好，結(jié)果判定明顯，并且不需要特殊的設(shè)備和儀器，操作方法易短時間掌握，較為適合與基層檢驗及大批量檢測等，但只能進行單個檢測，劣于實時熒光定量RT-PCR方法。1.4化學(xué)發(fā)光法檢測化學(xué)發(fā)光法是將免疫反應(yīng)的高靈敏性與化學(xué)發(fā)光的高靈敏性結(jié)合起來，建立的一種用于檢測微量抗原，抗體，激素，酶等的新型免疫學(xué)分析方法，通過新冠病毒抗原的磁珠與血清樣本中的IgG/IgM抗體結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物，復(fù)合物濃度和化學(xué)發(fā)光的信號強度成線性關(guān)系，通過線性關(guān)系可以計算出抗體濃度，可以用于臨床標本的檢測。1.5免疫膠體金法檢測免疫膠體金法屬于快速病毒診斷技術(shù)，它的主要原理是通過微孔濾膜來作為病毒主要的固相載體，并且將血清中的新型冠狀病毒抗體與膠體金標記的新型冠狀病毒抗原結(jié)合形成復(fù)合物，如果該復(fù)合物與抗體結(jié)合成復(fù)合物，就會有特殊的顯色反應(yīng)，判斷是否陽性，此方法方便快捷，結(jié)果判定明顯，并且不需要特殊的設(shè)備和儀器，操作方法易短時間掌握，較為適合與基層檢驗及大批量檢測等。2新型冠狀病毒的預(yù)防做好新型冠狀病毒的預(yù)防至關(guān)重要。新型冠狀病毒是傳染性非常強的呼吸道感染性疾病，它的流行范圍廣，傳入能力強，目前全球各地已經(jīng)出現(xiàn)不同程度的蔓延，我國疫情防控有著豐富的經(jīng)驗和嚴格的措施，需要做好個人的自我防護。出門一定要戴口罩；不參加聚集性活動；不接觸外來人員，盡量減少人員流動，支持就地過年，這是個人衛(wèi)生的防護。在家時要經(jīng)常注意保持家中的整潔。手不要直接觸摸電梯、門把手等容易病毒攜帶的地方，外出回家時必須及時洗手，不要觸摸粘膜和傷口，因為手在外有機會接觸病菌，而這些部位可以導(dǎo)致病毒很容易的直接侵入人體，做好自我的衛(wèi)生防護。新型冠狀病毒的傳播方式有飛沫傳播和密切接觸傳播，長時間在空氣不流通的高濃度氣溶膠情況下，會加大感染幾率。我國現(xiàn)在目前最大的威脅來自國外輸入人員和物品，面對變種的奧秘克戎和德爾塔毒株存在潛伏期長的狀況，入境人員應(yīng)當(dāng)按照要求配合落實健康管理措施。我國也發(fā)生幾起入境物品攜帶病毒而導(dǎo)致人員造成感染的事例，說明病毒在離開宿主后，在自然環(huán)境中仍然存在感染的風(fēng)險，所以在出入境商品的港口和機場應(yīng)及時進行消殺，可采取0.5%的過氧乙酸和84消毒液。同時也應(yīng)及時接種疫苗，保護易感人群。在社會中，比疫情更可怕的是謠言，我們更需要在疫情下保持理智，不要過度恐慌，保持清醒的狀態(tài)，也不要以謠傳謠，造成社會恐慌。從目前的疫情形勢來看，全球疫情形勢依然嚴峻復(fù)雜，國內(nèi)疫情呈多點散發(fā)，局部爆發(fā)，我們更不能有絲毫的麻痹和松懈，堅持外放輸入，內(nèi)放反彈的政策，科學(xué)精準的做好疫情防控工作。總結(jié)實時熒光定量PCR檢測技術(shù)目前還有一定的缺陷，目前經(jīng)常使用的實時熒光定量PCR法，其原理主要是根據(jù)對病毒的特異性基因進行識別，如果病毒的目的基因序列發(fā)生突變，或由于PCR抑制而造成的模板和引物無法匹配，進而影響擴增，就會造成假陰性的后果。同時，采集時間，部位、方法的不同，或者樣品處理前操作不當(dāng)，還有可能患者在疾病初期，本身病毒載量小而造成的漏檢，比如，臨床上發(fā)現(xiàn)部分患者咽拭子檢測為陰性，而其下呼吸道分泌物、肺部灌洗液或者血液中核酸檢測為陽性，SARA-CoV-2本身作為RNA病毒，其核酸本身較易降解，若在采集過程中，保存、運輸中出現(xiàn)問題，均可使RNA降解從而造成假陰性的結(jié)果，所以，咽拭子需要在保存液中保存，可使病毒在常溫下保存較長時間，內(nèi)含有高濃度的胍鹽可以有效滅活病毒，能夠有效組織新冠核酸快速檢測操作員的二次感染?；驕y序技術(shù)可以幫助人們了解病毒的遺傳信息，判斷出新型冠狀病毒的種屬，并且根據(jù)遺傳信息設(shè)計出檢驗病毒靶點的試劑盒，雖然基因測序技術(shù)靈敏度好準確度高，但需要先進的儀器設(shè)備并且依賴操作人員的專業(yè)程度，而且檢驗時間過長，故不適用于大規(guī)模檢驗。特異性抗體檢驗最重要的是獲得病毒感染后T細胞產(chǎn)生特異性應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體，由于抗體的產(chǎn)生和消失是一個動態(tài)過程，選擇合適的采樣時機非常重要，但是由于對SARA-Cov-2免疫問題缺乏深入的研究，對SARS-CoV-2的抗體試劑研發(fā)也帶來了極大的困難，并且血液中的有些成分如類風(fēng)濕因子、非特異IgM、溶血所致的高濃度血紅蛋白等可能存在假陽性的結(jié)果。化學(xué)發(fā)光法靈敏度高準確度好，但由于需要對被檢測人員進行抽血，離心，還有需要全自動化學(xué)發(fā)光儀，在面對規(guī)模的聚集性疫情和疫情多區(qū)域爆發(fā)流行進行檢測時無法快速檢測出結(jié)果，需要的試劑也較為昂貴，所以不太適用于大規(guī)模檢測，免疫膠體金法靈敏度高準確度好，結(jié)果判定明顯，并且不需要特殊的設(shè)備和儀器，操作方法易短時間掌握，較為適合與基層檢驗及大批量檢測等，但只能進行單個檢測，劣于實時熒光定量RT-PCR方法。綜上所述，實時熒光定量PCR檢測法的靈敏度和特異性較高，人員可以在短時間內(nèi)學(xué)習(xí)并應(yīng)用，費用低，并且需要學(xué)習(xí)時間短，故可以在大規(guī)模的聚集性疫情和疫情多區(qū)域爆發(fā)流行進行檢測，并且我們需要研究更加先進的檢測方法，提高準確率和縮減檢驗時間，需要在不同的情況下選擇最為合適的檢測方法，可以幫助我們更好的預(yù)防和應(yīng)對新型冠狀病毒肺炎的發(fā)生。參考文獻[1]邱峰,王慧君,張子康,等新型冠狀病毒SARS-CoV-2的實驗室檢測技術(shù)[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2020,40(02):164-167.[2]安娜,俸家富.醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)在新型冠狀病毒肺炎診療中的應(yīng)用[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2020,17(07):865-868+872.[3]戎庭軍,李雄偉,胡文壇,等不同類型