酶免疫技術(shù)資料

酶免疫技術(shù)EnzymeImmunoassay免疫標(biāo)記技術(shù)是用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)(或生物)發(fā)光劑等作為追蹤物，標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)熒光顯微鏡，射線測(cè)量?jī)x，酶標(biāo)檢測(cè)儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測(cè)定儀等精密儀器，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接鏡檢觀察或進(jìn)行自動(dòng)化測(cè)定敏感性、特異性、精確性及應(yīng)用范圍

免疫熒光技術(shù)放射免疫技術(shù)免疫酶技術(shù)免疫電鏡技術(shù)免疫膠體金技術(shù)發(fā)光免疫測(cè)定

免疫標(biāo)記技術(shù)抗原抗體反應(yīng)＋酶催化反應(yīng)肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡、分光光度計(jì)特異、敏感可以在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對(duì)其進(jìn)行定量。酶免疫技術(shù)

EnzymeImmunoassay（EIA）一、概述

酶免疫標(biāo)記用于抗原檢測(cè)（一）基本原理酶標(biāo)記抗體或抗原：抗體或抗原的免疫學(xué)反應(yīng)特異性＋酶活性酶是一種有機(jī)催化劑：使底物基質(zhì)水解而呈色使供氫體由無色還原型變?yōu)橛猩趸汀嗫捎贸噬磻?yīng)顯示酶的存在。很少量的酶即可導(dǎo)致大量的催化過程，所以極為敏感。（二）常用的酶及其底物酶活性高；具有抗原抗體共價(jià)結(jié)合的基團(tuán)；標(biāo)記后不影響酶活性及抗原、抗體反應(yīng)性；產(chǎn)物易判定或測(cè)定；酶活性不受樣品中其他成分的影響（用于均相測(cè)定的酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合后酶活性出現(xiàn)抑制或激活）；無害；穩(wěn)定，價(jià)廉、易得。常用酶

底物

顯色

辣根過氧化物酶鄰苯二胺、H2O2

橙黃色四甲基聯(lián)苯胺、H2O2

藍(lán)色

堿性磷酸酶對(duì)硝基本磷酸脂黃色（三）標(biāo)記方法酶結(jié)合物技術(shù)簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高；不影響酶和抗體（抗原）的生物活性；所得酶標(biāo)記物穩(wěn)定；較少形成酶與酶、抗體與抗體、抗原與抗原的聚合物。戊二醛交聯(lián)法：抗原-戊二醛-酶

改良過碘酸鈉標(biāo)記法：過碘酸鈉氧化酶的羥基為醛基，再與抗體蛋白的氨基結(jié)合。HRP-CH2-NH-IgG

（四）酶標(biāo)記物的純化及鑒定1、純化游離酶：增加非特異染色游離抗原（抗體）：競(jìng)爭(zhēng)降低特異性染色葡聚糖凝膠層析法50%飽和硫酸銨沉淀提純法2、鑒定免疫活性鑒定：免疫電泳/雙擴(kuò)/ELISA酶標(biāo)記率測(cè)定：分光光度法（五）固相酶免疫測(cè)定儀（酶標(biāo)儀）比色測(cè)定波長(zhǎng)、吸光度范圍、光學(xué)系統(tǒng)、檢測(cè)速度、震板功能、溫度控制、定性和定量的軟件，自動(dòng)洗板、溫育、加樣450nm、492nm、620nm、630nm、650nm、405nm（六）類型酶免疫組織化學(xué)技術(shù)酶免疫測(cè)定均相酶免疫測(cè)定異相酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)定高敏感、高特異，幾乎所有可溶性抗原抗體系統(tǒng)均可用該法檢測(cè)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)：檢測(cè)組織或細(xì)胞中抗原或抗體酶免疫測(cè)定：用酶標(biāo)記抗原或抗體做標(biāo)記物，檢測(cè)液體樣品中可溶性抗原或抗體含量的微量分析技術(shù)。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需將結(jié)合和游離的酶標(biāo)記物分離，分為均相和異相均相：酶標(biāo)抗原+非標(biāo)記抗原+限量抗體，酶標(biāo)記物發(fā)生抗原抗體反應(yīng)后，酶活性減弱或增強(qiáng)。異相：反應(yīng)后，分離形成復(fù)合物的酶標(biāo)記物并檢測(cè)。根據(jù)是否采用固相材料以吸附抗原或抗體分為液相和固相。液相：待測(cè)抗原+酶標(biāo)抗原+抗體，一次性溫育待測(cè)抗原+抗體，溫育，加酶標(biāo)抗原，溫育固相：固相預(yù)先吸附抗原或抗體，在其表面反應(yīng)(酶)免疫組織化學(xué)（免疫細(xì)胞化學(xué)）：指帶顯色劑（酶）標(biāo)記的特異性抗體或抗原在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原或抗體進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的技術(shù)。免疫反應(yīng)特異性組織化學(xué)的可見性二、酶免疫組織化學(xué)技術(shù)

EnzymeImmunohistochemistryTechnique（EIHCT）

免疫組化技術(shù)近年來得到迅速發(fā)展。50年代還僅限于熒光免疫組化技術(shù)，50年代以后逐漸發(fā)展建立起高度敏感，且更為實(shí)用的酶免疫組化技術(shù)。

熒光免疫組化技術(shù)局限性：熒光抗體染色標(biāo)本不能長(zhǎng)期保存，對(duì)組織細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)分辨不清酶免疫組化技術(shù)：能克服上述不足，且敏感性更高，對(duì)石蠟切片標(biāo)本尤為適用，酶顯色產(chǎn)物具有較高的電子密度，可用電鏡觀察。步驟：抗原的提取與純化免疫動(dòng)物或細(xì)胞融合，制備特異性抗體及純化標(biāo)記抗體標(biāo)本處理抗原抗體反應(yīng)和呈色反應(yīng)顯微鏡觀察標(biāo)本取材新鮮、固定及時(shí)、形態(tài)保存良好、抗原性不被破壞活體組織切片或印片各種體液、穿刺液（細(xì)胞沉淀涂片）培養(yǎng)細(xì)胞1標(biāo)本的固定與保存：固定使細(xì)胞內(nèi)蛋白凝固，終止胞內(nèi)酶活化，防止細(xì)胞自溶，保存抗原性固定劑：乙醇、丙酮、戊二醛等切片：冰凍、石蠟2酶消化：打開固定過程中由于醛鍵形成而被封閉的抗原決定簇（胃蛋白酶等）3免疫染色標(biāo)記抗體與標(biāo)本中抗原反應(yīng)形成復(fù)合物，洗去未結(jié)合成分，直接鏡檢。對(duì)照試驗(yàn)（control）：Positive：已知抗原陽性的切片Negative：不含已知抗原的切片空白對(duì)照：排除組織自發(fā)熒光、內(nèi)源性酶、生物素等4結(jié)果觀察染色

特異性染色

非特異性染色顯色部位

特定細(xì)胞或間質(zhì)

細(xì)胞或間質(zhì)均勻染色或更強(qiáng)顯色定位

特定，有結(jié)構(gòu)性

無特定部位，無結(jié)構(gòu)性

顯色程度

同一部位呈不同

無分布規(guī)律，某一片

程度顯色

均勻著色

非特異性染色：非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽性染色。原因：非特異性蛋白吸附于高電荷的膠原或結(jié)締組織上。防止方法：采用與第二抗體相同來源的動(dòng)物血清吸附封閉底物組織上的帶電物質(zhì)；2%?；蛉税椎鞍追忾]。

免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

免疫組織化學(xué)染色（二）EIHCT類型1、酶標(biāo)記抗體免疫組化技術(shù)將酶通過交聯(lián)劑結(jié)合在抗體（抗抗體）分子上，形成酶標(biāo)記抗體（抗抗體），與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗原抗體復(fù)合物反應(yīng)后，再經(jīng)酶對(duì)底物顯色，對(duì)標(biāo)本中抗原進(jìn)行定性和定位。2、非標(biāo)記抗體酶免疫組化技術(shù)用酶免疫動(dòng)物制備抗酶抗體（Ab3），將酶與Ab3結(jié)合，然后用第二抗體（Ab2）作橋，Ab2既可與Ab3Fc段結(jié)合，又可與結(jié)合在組織抗原上的Ab1Fc段結(jié)合。酶顯色。1、酶標(biāo)記抗體免疫組化技術(shù)類型：（1）直接法：■-Ag+Ab*E→■-Ag-Ab*E

優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快速、特異缺點(diǎn)：一種酶標(biāo)抗體只能測(cè)一種抗原，敏感性較差

（2）間接法：■-Ag+Ab1+Ab2*E→■-Ag-Ab1-Ab2*E

優(yōu)點(diǎn)：一種酶標(biāo)抗體能測(cè)多種抗原，實(shí)用性敏感性較直接法好缺點(diǎn)：敏感性低于非標(biāo)記抗體酶法與三步法（3）三步法：■-Ag+Ab1+Ab2*E+Ab3*E→■-Ag-Ab1-Ab2*E-Ab3*E

優(yōu)點(diǎn)：敏感性高于上二缺點(diǎn)：操作繁瑣、費(fèi)時(shí)2、非標(biāo)記抗體酶免疫組化技術(shù)類型：（1）酶橋法：■-Ag+Ab1(兔源)+Ab2(羊抗兔)+抗-HRP(兔源)+HRP（2）PAP法：過氧化物酶（P）-抗過氧化物酶（AP），預(yù)先制成復(fù)合物減少操作步驟（3）雙橋PAP法：■-Ag-Ab1(兔源)-Ab2(羊抗兔)-PAP-Ab2(羊抗兔)-PAP增加酶分子，提高敏感性（4）APAAP法：用堿性磷酸酶代替過氧化物酶，建立的堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶法既可Ag，也可查Ab。避免了酶標(biāo)抗體的缺點(diǎn)。3、酶免疫電鏡技術(shù)（Immuneelectronmicroscopy，IEM）用酶標(biāo)抗體與組織或細(xì)胞抗原結(jié)合，顯色后在電鏡下觀察。免疫反應(yīng)特異性與電鏡高分辨力結(jié)合。亞細(xì)胞水平和超微結(jié)構(gòu)，高精確度、高靈敏度示蹤物：電子致密物質(zhì)。Singer(1959)首創(chuàng)此項(xiàng)技術(shù)，使用鐵蛋白標(biāo)記。30多年來，經(jīng)過許多學(xué)者的不斷改進(jìn)和發(fā)展，除鐵蛋白外，主要有過氧化物酶和膠體金。過氧化物酶分解DAB的產(chǎn)物為不溶性的棕色吩嗪衍生物，經(jīng)過Os04處理后變黑，具有高電子密度，十分適合于電鏡觀察。而且HRP的分子量(40kDd)比鐵蛋白(750kDa)將近小20倍，酶標(biāo)抗體較易透過經(jīng)適當(dāng)處理后的組織細(xì)胞膜，能用于定位細(xì)胞內(nèi)抗原。但酶反應(yīng)產(chǎn)物的分辨率不如顆粒性標(biāo)記物高(如鐵蛋白，膠體金)。檢測(cè)方法：由標(biāo)記抗體法，改進(jìn)為應(yīng)用雙功能抗體法、搭橋法及PAP法等。免疫電子顯微鏡技術(shù)三、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay

（ELISA）

1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmannn,荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。簡(jiǎn)便、快速、敏感、特異、實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單、應(yīng)用范圍廣、無同位素污染

酶聯(lián)免疫井（一）基本原理酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是一種固相免疫測(cè)定技術(shù)。先將抗體或抗原包被到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。將待檢樣本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)加入酶標(biāo)抗體與免疫復(fù)合物結(jié)合，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離的未結(jié)合成分最后加入酶反應(yīng)底物，根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色及其吸光度(A)值的大小進(jìn)行定性或定量分析的方法。

根據(jù)檢測(cè)目的和操作步驟不同：雙抗體夾心法間接法競(jìng)爭(zhēng)法捕獲法dot-ELISABAS-ELISA（二）類型

雙抗體夾心法

此法常用于測(cè)定抗原，適用于多價(jià)大分子抗原的檢測(cè)，而不能用于測(cè)定半抗原等小分子物質(zhì)。

雙抗體夾心法

間接法

此法是測(cè)定抗體最常用的方法。此法也可用于測(cè)抗原。

間接法竟?fàn)幏?/p>

此法可用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體。此法用于血清中某種抗體亞型成分測(cè)定。以IgM測(cè)定為例：捕獲法抗人IgMμ鏈抗體樣本（IgM1、2）抗人IgMμ鏈抗體IgM1特異抗原（Ag1）抗人IgMμ鏈抗體抗人IgMμ鏈抗體IgM2抗人IgMμ鏈抗體IgM1抗人IgMμ鏈抗體IgM2Ag1Ab1*E抗人IgMμ鏈抗體IgM1抗人IgMμ鏈抗體IgM2Ag1Ab1*E（三）技術(shù)要點(diǎn)1固相載體：與Ab或Ag有較高結(jié)合容量，結(jié)合穩(wěn)定；可結(jié)合AgAb及親和素或鏈酶素等大分子蛋白；生物大分子固化后應(yīng)保持活性，活性基團(tuán)朝向反應(yīng)溶液；固相化方法簡(jiǎn)便快速經(jīng)濟(jì)。塑料：非共價(jià)或物理吸附。小試管、小珠、板條微顆粒：化學(xué)耦聯(lián)，結(jié)合容量大，均勻分散在液體中，反應(yīng)快，可磁化，方便分離。膜載體：硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、尼龍膜，非共價(jià)結(jié)合，吸附力強(qiáng)2免疫吸附劑指與固相載體結(jié)合的Ag或Ab。將Ag或Ab固相化的過程稱包被（coating）。用1-5%牛血清白蛋白或5-20%小牛血清等結(jié)合包被后固相載體表面剩余的少量未吸附位點(diǎn)，為封閉（blocking）。共價(jià)、非共價(jià)PH、離子強(qiáng)度、溫度、時(shí)間、濃度一般用PH9.6的碳酸鹽緩沖液，4℃過夜或37℃2-6h3包被抗原和酶標(biāo)抗體最佳工作濃度包被抗原包被抗體酶標(biāo)抗體濃度載體：微孔膜標(biāo)記物：酶、各種有色微粒子（彩色膠乳、膠體金、膠體硒等）免疫滲濾試驗(yàn)：對(duì)穿流免疫層析試驗(yàn)：對(duì)橫流四、膜載體的酶免疫測(cè)定Membranced-BasedEnzymeImmunoassay（一）斑點(diǎn)-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（dot-ELISA）原理：似ELISA，但載體為硝酸纖維素（NC）膜。更靈敏、節(jié)約、簡(jiǎn)便，易保存以檢測(cè)抗體為例：AgAb1？Ab2-E底物（二）斑點(diǎn)-酶免疫滲濾試驗(yàn)

ImmunofiltrationAssay，IFA原理：以NC膜為載體，利用微孔濾膜的可濾過性，使抗原抗體反應(yīng)和洗滌在一特殊滲濾裝置上以液體滲濾過膜的方式迅速完成。以膠體金為標(biāo)記物的金免疫滲濾試驗(yàn)省卻了酶對(duì)底物的反應(yīng)，更加簡(jiǎn)便快速。以雙抗體夾心法HCG為例：標(biāo)本中HCG與NC膜上抗-HCG結(jié)合，再加膠體金標(biāo)記的抗-HCG抗體，形成雙抗體夾心復(fù)合物（紅色）原理：滴加在膜一端的樣品溶液受膜的毛細(xì)管作用向另一端移動(dòng)，移動(dòng)過程中待測(cè)物與固定于膜上某區(qū)域的抗原或抗體結(jié)合而被固相化，通過標(biāo)記物染色。（三）免疫層析試驗(yàn)

ImmunochromatographyAssay，ICA吸水材料吸水材料樣品墊結(jié)合物墊如：尿HCG測(cè)定（四）免疫印跡技術(shù)

ImmunoblottingTest，IBT又稱蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)

是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）+蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)+酶免疫技術(shù)將含有目標(biāo)蛋白(抗原)的樣品→SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)或非變性電泳(Native)等分離→轉(zhuǎn)移電泳原位轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜或其它膜的表面→將膜表面的蛋白質(zhì)再用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行特異性檢測(cè)。

免疫印跡技術(shù)五、生物素與親和素系統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

Biotin-AvidinSystemELISA（BAS-ELISA）生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-avidinsystem，BAS)，是70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué)，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。多級(jí)放大效應(yīng)-靈敏生物素與親和素之間高度親和力-特異穩(wěn)定適用性強(qiáng)（與熒光素、酶、同位素等免疫標(biāo)記技術(shù)有機(jī)地結(jié)合）生物素(biotin，B)

生物素在機(jī)體內(nèi)以輔酶形式參與各種羧化酶反應(yīng)，故又稱為輔酶R或維生素H。分子中有兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中I環(huán)為咪唑酮環(huán)，是與親和素結(jié)合的主要部位；II環(huán)為噻唑環(huán)，上有一戊酸側(cè)鏈，其末端羧基是結(jié)合抗體和其他生物大分子的唯一結(jié)構(gòu)。

親和素(avidin，A)

與生物素結(jié)合后穩(wěn)定，親合素由4個(gè)相同的亞基組成，能結(jié)合4個(gè)分子的生物素。親合素與生物素之間的親和力極強(qiáng)，二者能快速結(jié)合，且反應(yīng)不受外界干擾，具有高度特異性和穩(wěn)定性。BAS-ELISA：（1）BA-ELISA■-Ab+待測(cè)Ag+Biotin-Ab+Aidin*E+底物（2）BAB-ELISA■-Ab+待測(cè)Ag+Biotin-Ab+Aidin+Biotin*E+底物（3）ABC-ELISA■-Ab+待測(cè)Ag+Biotin-Ab+Aidin-Biotin*E+底物發(fā)光免疫標(biāo)記技術(shù)

LuminescenceImmunoassay，LIA發(fā)光免疫分析技術(shù)

新型超微量分析技術(shù)：發(fā)光分析+免疫反應(yīng)。自動(dòng)化、快速、簡(jiǎn)便發(fā)光分析的高靈敏性抗原抗體反應(yīng)的高度特異性一、發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射。光照發(fā)光：發(fā)光劑經(jīng)短波長(zhǎng)入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，回復(fù)到基態(tài)時(shí)發(fā)出波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光。(熒光)生物發(fā)光化學(xué)發(fā)光生物發(fā)光

生物發(fā)光是指發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象，如熒火蟲的發(fā)光。是發(fā)生在生物體內(nèi)的一種化學(xué)發(fā)光。

化學(xué)發(fā)光

伴隨化學(xué)反應(yīng)過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)，吸收了反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)。當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)產(chǎn)生輻射，多余的能量以光子的形式釋放出來，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。

發(fā)光劑：發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物。熒光素化學(xué)發(fā)光劑生物發(fā)光劑化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物：化學(xué)發(fā)光劑與抗體或抗原結(jié)合在一起的復(fù)合物。發(fā)光免疫分析的類型

根據(jù)發(fā)光免疫分析中發(fā)光反應(yīng)的不同體系和標(biāo)記物及標(biāo)記方法的不同，大體上可分為以下三種類型