【發(fā)酵工程】余龍江版-第2章-發(fā)酵工業(yè)菌種

第二章發(fā)酵工業(yè)菌種本章內(nèi)容

第一節(jié)、常用的工業(yè)微生物第二節(jié)、發(fā)酵工業(yè)菌種的別離篩選第三節(jié)、發(fā)酵工業(yè)菌種的鑒定和保藏第四節(jié)、發(fā)酵工業(yè)菌種的育種第一節(jié)

最常用的工業(yè)微生物一、細菌醋桿菌屬的醋化醋桿菌、弱氧化醋桿菌乳酸桿菌枯草桿菌丙酮丁醇梭菌大腸桿菌谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)各種酶制劑、有機酸、氨基酸、肌苷酸等二、放線菌鏈霉菌屬小單孢菌屬地中海諾卡氏菌米蘇里游動放線菌生產(chǎn)多種抗生素〔60%以上〕三、酵母菌釀酒酵母假絲酵母屬產(chǎn)朊假絲酵母解脂假絲酵母熱帶假絲酵母畢赤酵母屬、漢遜酵母屬用于釀酒、制造面包、生產(chǎn)脂肪酸、生產(chǎn)可食用、藥用和飼料用酵母菌體蛋白等。四、霉菌曲霉屬米曲霉黑曲霉青霉屬青霉菌：點青霉、產(chǎn)黃青霉桔青霉根霉屬德氏根霉米根霉、小麥曲根霉紅曲霉屬紫紅曲霉生產(chǎn)酶制劑、抗生素、有機酸及甾體激素等五、未培養(yǎng)微生物定義：指迄今所采用的微生物純培養(yǎng)別離及培養(yǎng)方法還未獲得純培養(yǎng)的微生物，其在自然環(huán)境微生物群落中占有非常高的比例，約為99％。研究方法模擬自然培養(yǎng)法:模擬微生物生長的自然環(huán)境對未培養(yǎng)微生物進行可培養(yǎng)研究。原位培養(yǎng)、培養(yǎng)條件優(yōu)化、單細胞微操作宏基因組分析法：直接依據(jù)基因或基因組、蛋白質序列及其調(diào)控表達機制構建高效表達的工程菌等途徑進行開發(fā)利用。即通過未培養(yǎng)微生物的宏基因組分析來利用未培養(yǎng)微生物的基因資源。第二節(jié)

發(fā)酵工業(yè)菌種別離和篩選一、菌種的來源根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購置；從大自然中別離篩選新的微生物菌種。從自然界篩選制定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。采樣：有針對性地采集樣品。預處理：提高菌種別離的效率富集培養(yǎng)：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。別離：利用別離技術得到純種。菌種的篩選：通過常規(guī)生產(chǎn)性能測定，進一步篩選產(chǎn)物合成能力較高的菌株。發(fā)酵性能測定：進行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。菌種保藏二、新種別離與篩選的步驟1.采樣〔1〕采樣原那么廣泛性充分了解目標微生物的性質〔種類、生理特征等〕如根據(jù)微生物的營養(yǎng)類型：纖維素酶產(chǎn)生菌——森林土壤蛋白酶和脂肪酶產(chǎn)生菌——肉類加工廠和飯店潲水溝中的污水、污泥利用碳氫化合物為碳源的菌株——油田附近極端菌的篩選要根據(jù)其特殊的生理特征：高溫酶產(chǎn)生菌——南方、溫泉、火山爆發(fā)處及北方的肥堆耐壓菌——油井或海洋深處〔有機質豐富、通氣保水性能好〕(2)采樣對象土壤、水、空氣及枯枝落葉等，以土壤為主。從土壤中采樣要考慮土壤的以下特點：有機質含量和通風狀況耕地、菜園山坡上的森林沙土、無植被土壤、新開墾的生土、貧瘠的土地取樣的土層深度：5-25cm——細菌、放線菌〔有機質豐富、陰暗潮濕〕——霉菌、酵母菌——微生物少1.采樣1.采樣土壤的酸堿度偏堿——細菌、放線菌偏酸——霉菌、酵母菌土壤的植被狀況葡萄成熟時——根部酵母菌增多地理條件南方土壤比北方土壤微生物含量多季節(jié)條件秋季菜土樣最理想2.樣品的預處理〔1〕物理方法熱處理：根據(jù)目的菌較非目的菌的耐熱性高從而增加目的菌的比例。膜過濾法：濃縮水中的微生物細胞。離心法：同上?！?〕化學法通過培養(yǎng)基中添加某些化學成分來增加微生物的數(shù)量。如：用添加CaCO3穩(wěn)定培養(yǎng)基的PH來別離嗜堿性的放線菌?！?〕誘餌法將某些固體物質如石蠟、花粉、蛇皮、毛發(fā)等加到別離的土壤或水中做成誘餌富集目的菌，待菌落長出后再進行別離。3.富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)利用不同微生物生長繁殖對環(huán)境和營養(yǎng)的不同要求，如溫度、PH、滲透壓、溶氧濃度、碳源和氮源類型及濃度等，使目的微生物在最適宜條件下迅速繁殖，數(shù)量增加，成為人工環(huán)境下的優(yōu)勢種。3.富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)的策略〔1〕控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分用促進某特定微生物生長繁殖的選擇性培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件?？捎靡种破渌⑸锷L繁殖的選擇性培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件。例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對下階段的純種別離就會順利得多。3.富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)的策略〔2〕控制培養(yǎng)條件溶氧濃度——好氧/厭氧高溫——嗜熱微生物/非嗜熱微生物PH——嗜酸性/嗜堿性4.菌種別離平板劃線別離法稀釋別離法毛細管別離法小滴別離法稀釋別離法

稀釋倒平板法

平板涂布法注意：必須要做多個濃度的稀釋別離平板。劃線別離法——平板劃線法別離方法的選擇根據(jù)目的菌有無選擇性特征來選擇別離方法菌種的營養(yǎng)特征獨特生長特征獨特無選擇性特征根據(jù)產(chǎn)物的特征進行隨機別離選擇性別離的關鍵：生長培養(yǎng)條件的選擇與控制，從而實現(xiàn)定向富集篩選。選擇性別離自然界中細菌的別離

(一)采樣和采集方法為了從一特定生態(tài)系統(tǒng)中別離出具有代表性的細菌菌群，特別是別離那些在唯一微環(huán)境區(qū)域中出現(xiàn)的菌群時，必須十分重視樣本的采集。樣本采集時所需的工具通常有無菌刮鏟、土樣采集器、鑷子、解剖刀、手套、無菌小塑料袋和塑料瓶等。采樣的本卷須知1、采樣時應盡可能保持相對無菌；2、所采集的樣本必須具有某種代表性；3、采好的樣必須完整地標上樣本的種類及采集日期、地點以及采集地點的地理、生態(tài)參數(shù)等；4、應充分考慮采樣的季節(jié)性和時間因素，因為真正的原地菌群的出現(xiàn)可能是短暫的；5、采好的樣應及時處理，暫不能處理的也應貯存于4℃下，但貯存時間不宜過長。這是因為一旦采樣結束，試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會發(fā)生變化，微生物群體之間就會出現(xiàn)消長。1．土樣采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下層向上層順序采集；水田等浸水土壤在不損土層結構的情況下插入圓筒采集。如果層次要求不嚴格，可取離地面5～15cm處的土。將采集到的土樣盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根際土樣時，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量無菌水中浸漬約20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用無菌水漂洗下根部殘留的土，這局部上卻為根際土樣。2．植物體采集方法在采集葉面時，一般是用滅菌的剪刀、打孔器、平安刀片等，由幾片新鮮葉片的同一部位切取一小塊，并注意不要損傷周圍邊緣。選擇葉面時應考慮葉位、葉齡、葉片正反面和在一片葉上的取樣部位。采集植物根及根系時，方法與根際土樣采集方法相似。將洗凈的根裝入采樣袋中，采集根系時，一般與根際土樣一起保存。

3．水樣采集方法用于細菌檢測的水樣應收集于100m1干凈、滅菌的廣口塑料瓶中。由于表層水中含有泥沙，故在采樣時應在較深的靜水層中采集水樣。方法是：握住采樣瓶底浸入水中30-50cm處，然后瓶口朝下翻開瓶蓋，讓水樣進入。如果有急流存在的話，應直接將瓶口反向于急流。采集瓶從水中取出時應迅速并帶有較大的弧度。水樣不應裝滿采樣瓶。所有水樣都應在24h之內(nèi)迅速進行檢測，或者4℃下貯存。(二)生態(tài)學參數(shù)及培養(yǎng)基的組成原那么1、參加培養(yǎng)基中的天然提取物種類和用量、環(huán)境生物物理學參數(shù)以及用于平板涂布別離樣本的溶劑都會影響實驗中所要別離的細菌的數(shù)量和種類。2、就別離培養(yǎng)基的組成而言，局部培養(yǎng)基中必須含有10-50%的天然提取物。參加培養(yǎng)基中的天然提取物，局部培養(yǎng)基中那么應含有多種碳、氮源，如幾丁質、纖維素或果膠。3、所有別離培養(yǎng)基中都應含有抗真菌劑(如放線菌酮和制霉素)，摻加濃度一般為50μg／m1，以抑制真菌的生長。4、瓊脂平板在使用前應置于37℃培養(yǎng)箱中孵育l、2天。5、培養(yǎng)基的生物物理學參數(shù)，如pH及鹽分也應調(diào)節(jié)到與試樣的生態(tài)系統(tǒng)參數(shù)值相近。土中細菌的富集培養(yǎng)與別離別離土樣中的大局部細菌的別離程序中無需進行富集。但對某些少數(shù)細菌那么要求特殊的富集或選擇技術才能很好地被別離培養(yǎng)。富集方法運用細菌的酶誘導性，在別離培養(yǎng)基中添加假設干抗生素、復雜底物及生長因子的前體物質來激活細菌某一特殊基因組，可以建立起假設干富集技術。富集可以促進抗性的產(chǎn)生并維持下來。土樣中細菌的富集：適度稀釋后，取0.1m1涂布已添加及未添加富集底物(如幾丁質、纖維素等)的土浸出汁平板。植物體上細菌的別離：無菌富集，加植物浸出液適度培養(yǎng)取樣，洗滌，取1ml經(jīng)適度稀釋后涂布平板。水中細菌的別離：水樣通過0.22μm無菌濾膜，取出濾膜用1ml無菌稀釋液將濾膜上的沉積洗下。用樣本稀釋液適度稀釋,涂布平板倒置培養(yǎng)或濾紙壓印別離法。水中細菌別離的簡易富集技術在無菌的、用棉團塞好的廣口三角燒瓶中連續(xù)培養(yǎng)，定期取樣涂布適宜別離瓊脂平板上；在不同水體的水樣中參加一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白質等，同樣可以促進水中微生物的增殖。培養(yǎng)過程中可參加低濃度的抗真菌劑以抑制真菌的生長。另一富集方法是在培養(yǎng)燒瓶中添加細菌“附著材料”，如無菌的植物組織或土壤浸出液。通過改變培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)周期可選擇性富集嗜冷性細菌、中溫菌和嗜高溫菌。次代培養(yǎng)及純化步驟1、涂布的平板經(jīng)培養(yǎng)后，如生長出菌落，那么按涂布不同稀釋度的稀釋液所得的單菌菌落和多菌菌落對瓊脂平板進行分類。2、用無菌牙簽將菌落轉接到篩選平板上及轉接至添加有少量天然浸出液的適宜保藏瓊脂斜面上。3、篩選平板經(jīng)培養(yǎng)后，按生長出菌落的形態(tài)學特征如色素、菌落形態(tài)等進行最初分組。4、將認為有希望的菌落用牙簽轉接到另一模擬別離瓊脂平板上進行篩選。細菌別離：以乳酸菌為例放線菌的別離(一)采樣菜園土或林地土自然風干，備用土壤中放線菌最豐富，品種齊全?？梢院Y選新的放線菌。從堆肥或過熱的材料中如干草或蔗渣中可別離到大量的嗜熱放線菌，從淡水和海洋環(huán)境中別離到嗜堿性的和嗜酸性的菌種。氣生孢子能耐枯燥，耐濕熱能力高于營養(yǎng)體，室溫保存20天，放線菌的數(shù)量和組成變化不大，細菌大局部死亡。

〔1〕取體積為300ml的高氏一號培養(yǎng)基，參加0.1%的重鉻酸鉀15mL，使之終濃度為50ppm，搖勻，倒平板，待用?！?〕取土樣5g，攤平于大號培養(yǎng)皿上，在恒溫枯燥箱中120℃干熱處理1h?！?〕土樣熱處理后，參加裝有45mL無菌水和少量玻璃珠的三角瓶中，參加0.5mL的笨酚，室溫下振蕩30分鐘，靜止5分鐘，取上清液用無菌水稀釋10倍。同時另取土樣5g，不加熱和笨酚處理，余步驟同上，作為對照?！?〕用移液管分別吸取原液和10倍稀釋液各0.1ml標志稀釋倍數(shù)的平板上，涂抹均勻，倒置，28℃培養(yǎng)。〔5〕培養(yǎng)10~14d，觀察比較不同處理方法的生長情況、菌落特征。挑取紅色，無氣生菌絲的小菌落以及其它菌落形態(tài)菌株接種斜面，進一步用于形態(tài)觀察和鑒定。放線菌別離操作步驟培養(yǎng)基添加重鉻酸鉀的方法減少細菌和真菌的數(shù)量用干熱和苯酚處理減少鏈霉菌數(shù)量真菌別離真菌別離1、利用低碳／氮比的培養(yǎng)基可使真菌生長菌落分散，利于計數(shù)，別離和鑒定。這里主要是利用營養(yǎng)成分的減少而使生長減慢，并由此限制真菌的遷涉生長。2、改變培養(yǎng)溫度將有利于不同嗜溫區(qū)真菌的別離。3、有時真菌子實體形成必須有光線，這在別離培養(yǎng)時應加以考慮。4、選擇性富集：是通過一定的方式使樣本中一種或一群微生物數(shù)量上的增加而利于別離的一種技術。富集可以是種水平的，如通過營養(yǎng)要求的改變來富集別離鐮刀菌；也可以是組成群水平的，如以纖維素為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基可選擇性富集所有能降解纖維素的纖維素裂解微生物。5、選擇性抑制培養(yǎng)基可使非目標微生物消除或減少到一定程度。在別離培養(yǎng)基中參加一定的抗生素即可有效地抑制細菌生長及菌落形成。真菌的別離方法土中真菌的別離：稀釋法，混入法，壓貼法，粘附法，浮選法，注射器采集法，土過篩法，庶糖密度梯度離心法。植物材料中真菌的別離：植入法，壓貼法，洗滌法，浸泡法。水中真菌的別離：水樣稀釋后涂布別離。餌誘技術常用于水中真菌的富集。子實體直接別離培養(yǎng)擔子菌：新采集的子實體組織植入平板內(nèi)或在放于液體培養(yǎng)基外表放一小塊無菌濾紙上培養(yǎng)。真菌的別離篩選：以啤酒酵母的別離為例

取發(fā)酵液少許以10倍稀釋成10-1-10-7稀釋別離法取0.1ml參加固體培養(yǎng)基鋪平皿〔×2〕

在麥芽汁固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)48-72h形態(tài)篩選根據(jù)正常株特點進行挑選，接種斜面?zhèn)溆?/p>

純化，采用平板別離法進一步純化，至少反復三次

①生成子囊孢子速度測定 ②發(fā)酵力測定性能測定③熱死溫度測定 ④凝集力測定 ⑤雙乙酰含量測定隨機別離原理與技術從產(chǎn)物入手，通過設計高產(chǎn)培養(yǎng)基和建立快速靈敏專一的篩選方法，從隨機別離的菌落中篩選出所需的目的菌。技術關鍵：產(chǎn)物合成條件的選擇與控制及相應篩選方法確實定。隨機別離技術舉例藥理活性化合物產(chǎn)生菌的篩選

藥理活性化合物是指能抑制人類代謝中某一個關鍵酶的微生物產(chǎn)物即酶抑制劑，從而到達治療的目的。篩選模型：目標酶生長因子產(chǎn)生菌的篩選篩選模型：營養(yǎng)缺陷型試驗菌篩選方法：利用被別離的微生物產(chǎn)物能否促進營養(yǎng)缺陷型試驗菌生長氨

基

酸

產(chǎn)

生

菌

的

篩

選

樣品

預處理

初篩〔除真菌〕

在別離平板上生長獲得多個單菌落復印平板〔copy法〕 平板培養(yǎng)，其中有產(chǎn)生氨基酸的菌落分泌氨基酸u.v線殺死長好的菌落

產(chǎn)氨基酸菌落周圍有生長圈

目的菌落進行液體培養(yǎng)，對產(chǎn)物進行定量測定篩選產(chǎn)物含量高的菌株對應到copy前相應位置，找到目的菌落復印平板法：首先在完全培養(yǎng)基瓊脂平板上制備密度適當?shù)木洌缓蟀哑桨迳系木滢D移到絲絨上，絲絨繃在一個圓柱的光滑頂面上〔圓柱的直徑應比培養(yǎng)皿稍小〕，再把它當作印章，復印在不含營養(yǎng)物的合成培養(yǎng)基瓊脂平板上。生長圈法通常用于別離篩選氨基酸、核苷酸和維生素等的產(chǎn)生菌。工具菌是一些相對應的營養(yǎng)缺陷型菌株。將待檢菌涂布于含高濃度的工具菌并缺少所需營養(yǎng)物質的平板上進行培養(yǎng)，假設某菌株能合成平板所需的營養(yǎng)物，在該菌株的菌落周圍便會形成一個混濁的生長圈。多糖產(chǎn)生菌的篩選取樣特點：碳水化合物工業(yè)的廢棄物篩選方案：從菌落外觀判斷，選擇外觀呈粘液狀的菌落，然后根據(jù)液體培養(yǎng)測定多糖含量來篩選高產(chǎn)菌。毒性試驗自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應當十分留神，尤其與食品工業(yè)有關的菌種，更應慎重。據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗。第三節(jié)

發(fā)酵工業(yè)菌種的育種一、工業(yè)菌種的育種方針工業(yè)菌種的育種：是運用遺傳學原理和技術對某個用于特定生物技術目的的菌株進行的多方位的改造。通過改造，可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強化，或去除不良性質或增加新的性狀。在生物進化過程中，微生物細胞形成了愈來愈完善的代謝調(diào)節(jié)機制，在代謝繁殖過程中，能量的利用以及對細胞生長繁殖過程中所需的各種物質的形成是非常合理和經(jīng)濟的，細胞經(jīng)常處于平衡生長狀態(tài)，不會有代謝產(chǎn)物的積累。 一、菌種的代謝生理與分子生物學14現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)要研究的主要內(nèi)容就是通過改變培養(yǎng)條件和遺傳特性，使微生物的代謝途徑改變或代謝調(diào)節(jié)失控而獲得某一發(fā)酵產(chǎn)物的過量產(chǎn)生。其方法大體可分為兩類：–改變產(chǎn)生菌的基因型而改變代謝途徑；–改變控制代謝速率，即影響基因型的表達15代謝調(diào)節(jié)(regulationofmetablism〕是指微生物的代謝速度和方向按照微生物的需要而改變的一種作用。酶量的調(diào)節(jié)酶活性的調(diào)節(jié)1616微生物代謝的控制是指運用人為的方法對微生物的代謝調(diào)節(jié)進行遺傳改造和條件的控制，以期按照人們的愿望，生產(chǎn)有用的微生物制品。542.4.1.1初級代謝和次級代謝的調(diào)節(jié)產(chǎn)能代謝的調(diào)節(jié)：能荷調(diào)節(jié)(EnergyChargeRegulation)核蛋白體合成的調(diào)節(jié)〔RegulationofRibosomeSynthesis〕氨基酸、核苷酸合成代謝的調(diào)節(jié)〔Regulationofaminoacidsandnucleotidemetabolism〕2.4.1.1初級代謝調(diào)節(jié)和次級代謝調(diào)節(jié)58初級代謝對次級代謝的調(diào)節(jié)?許屢次級代謝產(chǎn)物的根本結構是由少數(shù)幾種初級代謝產(chǎn)物構成的，所以次級代謝產(chǎn)物是以初級代謝產(chǎn)物為母體衍生出來的，次級代謝途徑并不是獨立的，而是與初級代謝途徑有密切關系的。因此次級代謝必然會受到初級代謝的調(diào)節(jié)。?例如青霉素的合成會受到賴氨酸的強烈抑制，而賴氨酸合成的前體α-氨基己二酸可以緩解賴氨酸的抑制作用，并能刺激青霉素的合成。這是因為α-氨基己二酸是合成青霉素和賴氨酸的共同前體。如果賴氨酸過量，它就會抑制這個反響途徑中的第一個酶，減少α-氨基己二酸的產(chǎn)量，從而進一步影響青霉素的合成。59碳源代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)?碳分解代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)指能迅速被利用的碳源(葡萄 糖)或其分解代謝產(chǎn)物，對其他代謝中的酶(包括分 解酶和合成酶)的調(diào)節(jié)。分為分解產(chǎn)物阻遏和抑制 兩種。?葡萄糖是菌體生長良好的碳源和能源，但對 青霉素、頭孢菌素、卡那霉素、新霉素、絲 裂霉素等都有明顯降低產(chǎn)量的作用。6060氮代謝物的調(diào)節(jié)作用?在次級代謝中，氮分解代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)，即被 迅速利用的氮源(氨)抑制作用于含底物的酶 (蛋白酶、硝酸鹽復原酶、酰胺酶、脲酶、 組氨酸酶)的合成。在次級代謝中，其阻遏 作用也確實存在。在抗生素生產(chǎn)中使用黃豆 餅粉就是由于它緩慢分解成有阻遏作用的氨 基酸和氨，防止或減弱氮分解代謝產(chǎn)物阻遏 作用的結果。6161磷酸鹽的調(diào)節(jié)?磷酸鹽不僅是菌體生長的主要限制性營養(yǎng)成分，還是調(diào)節(jié)抗生素生物合成的重要參數(shù)。其機制按效應劑說有直接作用，即磷酸鹽自身影響抗生素合成，和間接作用，即磷酸鹽調(diào)節(jié)胞內(nèi)其他效應劑(如ATP、腺苷酸能量負荷和cAMP)，進而影響抗生素合成。?已發(fā)現(xiàn)過量磷酸鹽對四環(huán)素、氨基糖苷類和多烯大環(huán)內(nèi)酯等32種抗生素的合成產(chǎn)生阻抑作用。3030(二)酶合成的調(diào)節(jié)?酶合成的誘導?酶合成的阻遏31311，酶合成的誘導酶合成的調(diào)節(jié)32322，酶合成誘導的機制酶合成的調(diào)節(jié)33333，酶合成的阻遏酶合成的調(diào)節(jié)34344，酶合成阻遏的機制酶合成的調(diào)節(jié)35352.4.1.3酶活性的調(diào)節(jié)概念酶活性調(diào)節(jié)是指一定數(shù)量的酶，通過其分子構象或分子結構的改變來調(diào)節(jié)其催化反響的速率。影響因素底物和產(chǎn)物的性質和濃度環(huán)境因子(如壓力、pH、離子強度和輔助因子等)其他的酶的存在調(diào)節(jié)方式激活已有酶的活性抑制已有酶的活性〔一〕激活激活：在激活劑的作用下，使原來無活性的酶變成有活性，或使原來活性低的酶提高了活性的現(xiàn)象。代謝調(diào)節(jié)的激活作用：主要是指代謝物對酶的激活。前〔體〕饋激活，指代謝途徑中后面的酶促反響，可被該途徑中較前面的一個中間產(chǎn)物所促進。代謝中間產(chǎn)物的反響激活，指代謝中間產(chǎn)物對該代謝途徑的前面的酶起激活作用酶活性的調(diào)節(jié)A→B→?????→G3737CDE

+ EA→B→C→D→F+反響激活和前〔體〕饋激活示意圖 +例1：糖代謝途徑中丙酮酸積累激活丙酮酸羧化酶例2：乙酰CoA的積累激活PEP羧化酶3838酶的反饋激活葡萄糖丙酮酸 乙酰CoA活化

磷酸烯醇式丙酮酸 羧化酶 草酰乙酸α-酮戊二酸 擰檬酸1，6-二磷酸果糖〔二〕抑制抑制：由于某些物質的存在，降低酶活性的現(xiàn)象。反響抑制〔feedbackinhibition〕：反響抑制是指代謝的末端產(chǎn)物對酶(往往是代謝途徑中的第一個酶)活性的抑制。 無分支代謝途徑的調(diào)節(jié) 有分支代謝途徑的調(diào)節(jié)1，無分支代謝途徑的調(diào)節(jié)4040通常是在線形的代謝途徑中末端產(chǎn)物對催化第一步反響的酶活性有抑制作用。酶活性的調(diào)節(jié)4141α-酮丁酸異亮氨酸

用。TD蘇氨酸酶活性的調(diào)節(jié) ?例如，在大腸桿菌中，由蘇氨酸(Thr)合成異 亮氨酸(IIeu)時，異亮氨酸對催化反響途徑中 的第一步反響的蘇氨酸脫氨酶(TD)有抑制作42422，有分支代謝途徑的調(diào)節(jié)在有兩種或兩種以上的末端產(chǎn)物的分支合成代謝途徑中，調(diào)節(jié)方式較復雜，其共同特點是每個分支途徑的末端產(chǎn)物控制分支點后的第一個酶，同時每個末端產(chǎn)物又對整個途徑的第一個酶有局部的抑制作用，分支代謝的反饋調(diào)節(jié)方式有多種:順序反響抑制〔sequentialfeedbackinhibition〕同工酶的反響抑制〔isoenzymefeedbackinhibition〕協(xié)同反響抑制〔concertedfeedbackinhibition〕累積反響抑制〔cumulativefeedbackinhibition〕超相加反響抑制〔cooperativefeedbackinhibition〕酶活性的調(diào)節(jié)〔1〕順序反響抑制sequentialfeedbackinhibition

分支代謝途徑中的兩個末端產(chǎn)物，不 能直接抑制途徑中的第一個酶，只有 當兩個末端產(chǎn)物都過量時，才能對途 徑中的第一個酶有抑制作用。

43

434444?

例如，枯草桿菌在芳香族氨基酸合成中，色氨酸(Try)抑制鄰氨基苯甲酸合成酶(AS)，苯丙氨酸(Phe)抑制預苯酸脫水酶(PT)，酪氨酸(Tyr)抑制預I：7-磷酸-2-酮-3-脫氧庚糖酸合成酶；II：鄰氨基苯甲酸合成酶 苯酸脫氫酶(PD)，預苯酸和分支酸又局部地抑制7-磷酸-2-酮-3-脫氧庚糖 酸合成酶(DS)。 PD AS PTPEP：磷酸烯醇丙酮酸；E4P：4-磷酸赤蘚糖；DAHP：7-磷酸-2-酮-3-脫氧庚糖酸；CA：分支酸；Per：預苯酸；AA：鄰氨基苯甲酸；HPPA：對羥基苯丙酮酸；PPA：苯丙酮酸；Tyr：酪氨酸；Try：色氨酸；Phe：苯丙氨酸；19192.4.1.4細胞透性的調(diào)節(jié)細胞質膜的透性直接影響物質的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌，從而影響到細胞內(nèi)代謝的變化。細胞質膜的透性的調(diào)節(jié)是微生物代謝調(diào)節(jié)的重要方式，由它控制著營養(yǎng)物質的吸收和產(chǎn)物分泌。?如在青霉素發(fā)酵中，產(chǎn)生菌細胞膜輸入硫化物能力的大小影響青霉素發(fā)酵單位的上下。如果輸入硫化物能力增加，硫源供給允足，合成青霉素的量就增多。20?例如，大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌吸收乳糖是由滲 透酶和環(huán)狀AMP(cAMP)協(xié)同控制來完成的。cAMP 的濃度是由腺苷酸環(huán)化酶(AC)的活性控制的，也就 是說，乳糖的吸收受滲透酶和AMP環(huán)化酶的控制， 調(diào)節(jié)蛋白通過磷酸化的形式和腺苷酸環(huán)化酶〔AC 〕或滲透酶結合，分別使腺苷酸環(huán)化酶活化或使?jié)B 透酶失活。當有葡萄糖時，乳糖的滲透酶以無活性 狀態(tài)存在，而腺苷酸環(huán)化酶也以非活性狀態(tài)存在。代謝調(diào)節(jié)方式21

21BrnEBrnFBrnQ代謝調(diào)節(jié)方式

L-異亮氨酸的膜滲透情況二、工業(yè)菌種育種的常規(guī)方法誘變基因轉移基因重組育種過程包括以下3個步驟：(1)在不影響菌種活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的選出。(3)改進菌種的評價(包括實驗規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模)?！惨弧痴T變育種以微生物的自然變異作為根底的生產(chǎn)選種的機率并不很高，一個基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)楦椎挠N，是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。誘變物理、化學或生物誘變方法

1、誘變劑和誘變處理物理誘變劑：射線如紫外線、X—射線、γ—射線，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線，對于一般實驗室、中小型工廠都適用，也很平安。其他的幾種射線都是電離性質的，有一定的穿透力，一般都由專業(yè)人員在專門的設備中使用，否那么有一定危險性?；瘜W誘變劑：化學因子如堿基類似物、5—氟尿嘧啶、烷化劑等。化學誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。使用化學誘變劑的優(yōu)缺點：1、大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。2、化學誘變劑是很經(jīng)濟的，因為只需要少量的適宜的誘變劑，設備是實驗室的一般玻璃器皿，一個蒸氣罩。而用電離輻射工作時，設備費用大，并要注意平安性。3、大局部誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹慎，要防止化學誘變劑與皮膚接觸，，且切勿吸入其蒸氣，有人對某些誘變劑極其敏感，甚至未直接接觸就會過敏，這就更要留神2、誘變劑的選擇1．堿基類似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使用，回復突變率高，效果不大。2．亞硝酸和烷化劑應用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。3．吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。4．紫外線仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復的缺突變。但它可能影響鄰近基因的性能。3、誘變育種步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)別離和篩選(1)出發(fā)菌株的選擇1．自然界新別離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，容易到達好的效果。2．在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。3．每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。4．出發(fā)菌株開始時可以同時選2～3株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。5．要盡量選擇單倍體細胞、單核或核少的多細胞體來作出發(fā)誘變細胞，這是由于變異性狀大局部是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。6．根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因為同一誘變劑的重復處理會使細胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營養(yǎng)細胞，就要選對數(shù)期的細胞；有的作用于休止期，就可選用孢子。

(2)處理菌懸液的制備這一步驟的關鍵是制備單細胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進行適宜培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。(3)誘變處理根據(jù)前面有關誘變劑及誘變處理的介紹，結合誘變對象的實際，設計誘變處理方案。

(4)中間培養(yǎng)由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個表現(xiàn)延遲的過程，即細胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程(生理延遲)，需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。這個過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。方法：讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，以讓細胞的遺傳物質復制，讓細胞繁殖幾代，以得到純的變異細胞。這樣，隱性的變異就會顯現(xiàn)出來，假設不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上別離就會出現(xiàn)變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。(5)別離和篩選篩選分初篩和復篩。初篩以迅速篩出大量的到達初步要求的別離菌落為目的，以量為主。復篩那么是精選，以質為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異.例如：初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復篩者，而將90%的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細比較參加復篩和再復篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復篩階段，還應不斷結合自然別離，純化菌株。4、常見誘變育種的舉例〔1〕紫外線的誘變育種

紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長為2537A．燈與處理物的距離為15～30cm，照射時間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在70～80%為宜。被照射的菌懸液細胞數(shù)，細菌為106個／ml左右，霉菌孢子和酵母細胞為106～107個／ml。由于紫外線穿透力不強，要求照射液不要太深，約0.5～1.0cm厚，同時要用電磁攪拌器或手工進行攪拌，使照射均勻。由于紫外線照射后有光復活效應，所以照射時和照射后的處理應在紅燈下進行。操作步驟1.將細菌培養(yǎng)液以3000r／min離心5min，傾去上清液，將菌體打散參加無菌生理鹽水再離心洗滌。2．將菌懸液放入一巳滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動，以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過濾，單細胞濾液裝入試管內(nèi)，一般處于渾濁態(tài)的細胞液含細胞數(shù)可達108個／ml左右，作為待處理菌懸液。

4．取未照射的制備菌液和照射菌液各o.5ml進行稀釋別離，計數(shù)活菌細胞數(shù)。5．取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中(300ml三角瓶內(nèi)裝30ml培養(yǎng)液)，120r／min振蕩培養(yǎng)4～6h。6．取中間培養(yǎng)液稀釋別離、培養(yǎng)。7．挑取菌落進行篩選。3．取2～4m1制備的菌液加到直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處。在正式照射前，應先開紫外線10min，讓紫外燈預熱，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射10～50s。操作均應在紅燈下進行，或用黑紙包住，防止白熾光。(2)亞硝基胍誘變曲霉菌

N—甲基—N'-硝基-N-亞硝基胍(NGN，MNNG或TG)對真核或原核微生物都有強烈的誘變作用。其精確的作用機制尚不很清楚，據(jù)認為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細胞內(nèi)的DNA復制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。MNNG的誘變作用隨pH的升高而增強。操作步驟1．單孢子懸液制備取斜面，參加6ml0.1mol／LpH6.0的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過帶濾紙漏斗過濾，由此制得單孢子懸液，假設孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達l06個／ml，此為待處理孢子懸液。2．MNNG溶液的制備用分析天平稱取2mg，參加2ml0.1mol／LpH6.0磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解。操作步驟〔續(xù)〕3．誘變處理吸取MNNG溶液lml，參加到1m1孢子懸液中，30℃振蕩30min，立即稀釋1000倍停止作用，然后以10-2，10-4兩個稀釋度別離培養(yǎng)，30℃3天后計數(shù)。4．死亡率計算將未處理的孢子液1ml參加1ml磷酸緩沖液中，同上逐級稀釋別離，30℃下培養(yǎng)3天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計算出死亡率。5．挑取菌落進行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選．(3)營養(yǎng)缺陷型的選育營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其根本培養(yǎng)基中參加相應的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株。與營養(yǎng)缺陷型對應的是野生型。能滿足野生型菌株正常生長的培養(yǎng)基稱根本培養(yǎng)基(MM)；在根本培養(yǎng)基中參加相應的營養(yǎng)成分的稱補充培養(yǎng)基(SM)；能滿足各種營養(yǎng)缺陷型生長的稱完全培養(yǎng)基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。營養(yǎng)缺陷型的用途

營養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學研究上用途很大。目前生產(chǎn)氨基酸、核苷酸的菌種都是各種類型的缺陷型。要研究代謝途徑，育種技術都必須有營養(yǎng)缺陷型的菌株為材料。篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟誘變淘汰野生型檢出缺陷型確定生長譜誘變方法物理誘變化學誘變淘汰野生型抗生素法：野生型能在MM中生長，而缺陷型不能，于是將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于休眠狀態(tài)。由于細菌或酵母對一些抗生素敏感，于是就相應參加一定量的抗生素，結果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌絲過濾法：對于霉菌，因孢子生長后會長出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過。

檢出缺陷型原理：在固體根本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長情況完全不同，缺陷型在CM上生長良好，而在MM上那么不生長，野生型都能生長。

具體方法：影印法、點種法、夾層法1．將一較平皿直徑小1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。2．將完全培養(yǎng)基上長出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標記方位。3．將根本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標記的同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復印于上。

影印法4．將CM和MM在恒溫箱中培養(yǎng)。5．二平皿相同方位進行比較，即可發(fā)現(xiàn)在MM平皿上長出的菌落少于GM平板上的。MM上未長而相應于CM上長出的那幾個菌落就可能是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應有一定間隔。

點種法也就是任意法。用接種針或牙簽將CM上長出的菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在相應位置點種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長情況。此法結果明確，但工作量大。

夾層法先在培養(yǎng)皿上倒一層根本瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌的MM，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，將出現(xiàn)的菌落標記，然后倒上一層CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時第二批長出的菌落就可能是缺陷型。此法缺點是，結果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。營養(yǎng)缺陷型生長譜確實定驗證確定是缺陷型后，就需確定其缺陷的因子，即生長譜測定。生長譜測定的方法將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，制備成細胞懸液，與MM培養(yǎng)基(融化并涼至50℃)混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的5～6個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營養(yǎng)物的濾紙圓片。培養(yǎng)后會在某組合區(qū)長出，就可測得所需營養(yǎng)?！獋€平皿測一個菌。以不同組合的營養(yǎng)混合物與融化涼至50℃的MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個缺陷型菌株于各相應位置，培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長出可推知其營養(yǎng)因子。在5～6個平皿上可測20株菌以上。(二)基因育種基因重組育種：是運用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細菌質粒或其他載體，將目的基因轉移至新的宿主細胞并使其在新的宿主細胞系統(tǒng)內(nèi)進行復制和表達，或者通過細胞間的相互作用，使一個細胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質的交換而轉移給另—個細胞的方法。一個完整的基因克隆過程包括以下步驟１、獲得待克隆的DNA片段〔基因〕；２、目的基因與載體在體外連接；３、重組DNA分子導入宿主細胞；４、篩選、鑒定陽性重