微生物學(xué)研究與應(yīng)用技術(shù)及無損檢測控制程序

微生物學(xué)研究與應(yīng)用技術(shù)一、PCR技術(shù)1、PCR原理：PCR技術(shù)是以DNA雙鏈的復(fù)制和變性、復(fù)性為原理，在人工調(diào)控的溫度下，提供DNA復(fù)制所需的引物、模板、dNTPs、聚合酶等條件，從而使得DNA可周而復(fù)始的進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增。2、PCR循環(huán)（步驟）：變性（denaturation）—退火（annealing）—延伸（extension）；變性：高溫下，模板DNA發(fā)生熱變性，雙鏈解開成兩條單鏈；退火：反應(yīng)體系降溫，使引物與模板DNA兩端的堿基配對；延伸：DNA聚合酶使引物3’端向前延伸合成新鏈；新合成的單鏈又可作為下一輪循環(huán)的模板進(jìn)行復(fù)制，并不斷重復(fù)上述的3個步驟，使得DNA片段呈指數(shù)增長，在1h內(nèi)可重復(fù)25~30次，DNA的擴(kuò)增量可達(dá)106~107倍。3、PCR常用的耐熱聚合酶：（1）TaqDNA聚合酶，耐高溫但缺乏校正功能，使用最為廣泛；（2）PfuDNA聚合酶、VentDNA聚合酶，既耐高溫又具有校正功能的聚合酶；（3）TthDNA聚合酶，具有逆轉(zhuǎn)錄活性的聚合酶，可使RT-PCR在同一體系中進(jìn)行，即使僅有極少量的RNA也可被擴(kuò)增，可用于研究細(xì)胞RNA和RNA病毒。4、PCR的應(yīng)用：（1）可用于基因的擴(kuò)增和制備DNA探針，如已知目的基因兩端的序列，利用PCR便可將其擴(kuò)增出來，也可用于定位誘變和DNA測序；（2）可用于臨床醫(yī)學(xué)上檢測傳染病、診斷遺傳病和分析癌基因；（3）在法醫(yī)上可用于進(jìn)行親子鑒定、個體鑒定等。5、PCR定位誘變技術(shù)（最常用）：任何基因只需要知道兩端及需要的變異部位的序列即可進(jìn)行PCR定位誘變。PCR誘變有兩種方法：（1）基因末端誘變：5‘端或3‘端引物含有變異堿基，便可使PCR產(chǎn)物的末端引入變異。（2）基因中部誘變：在需要誘變的位置合成一對含有變異堿基的互補(bǔ)引物，然后分別于5’端引物和3’端引物進(jìn)行PCR，這樣便可得到兩個含變異堿基的PCR產(chǎn)物，由于二者中間有一段序列彼此互補(bǔ)重疊，在重疊部位經(jīng)重組PCR就能得到變異的PCR產(chǎn)物。圖P273二、革蘭氏染色法基本原理方法：通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞膜內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物（CVI）。革蘭氏陽性菌由于其細(xì)胞壁較厚，肽聚糖網(wǎng)層次多和交聯(lián)緊密，故遇乙醇處理時不會溶出縫隙，因此能把結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物牢牢地留在壁內(nèi)，是其保持紫色。反之，革蘭氏陰性菌因為細(xì)胞壁薄，外膜層的脂類含量高、肽聚糖層薄和交聯(lián)度差，所以在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能截留結(jié)晶紫-碘復(fù)合物的溶出，因此，通過乙醇脫色后細(xì)胞退為無色。這時再經(jīng)過沙黃等紅色染料進(jìn)行復(fù)染，只有革蘭氏陰性菌會被染成紅色。常用基因工程載體克隆載體：是指負(fù)責(zé)將外源基因運(yùn)送到宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制與擴(kuò)增的運(yùn)輸工具。作為克隆載體的要求：（1）載體應(yīng)為一個獨立的復(fù)制子，含有復(fù)制起始點且可在細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制；（2）含有多克隆位點，即含有若干限制酶單一切點，以便插入外源基因；（3）含有選擇標(biāo)記，便于對陽性克隆的篩選和鑒定；（4）具有一定的安全性，在胞內(nèi)不發(fā)生重組和轉(zhuǎn)移，在胞外也不能自由擴(kuò)散。基因工程常用的5大載體：質(zhì)粒載體、?噬菌體載體與黏粒載體、M13噬菌體載體與噬菌粒載體、真核生物克隆載體、人工染色體。主要克隆載體及其主要用途：細(xì)菌質(zhì)粒載體—外源基因的克隆與表達(dá)，<15kb；噬菌體載體—構(gòu)建基因文庫及cDNA文庫，<23kb；黏粒載體（柯斯質(zhì)粒載體）—構(gòu)建基因文庫，<49kb；M13噬菌體載體—單鏈DNA制備和測序、定位誘變、噬菌體展示，300~400bp；噬菌粒載體—外源基因的克隆與表達(dá)，<10kb；酵母質(zhì)粒載體—真核基因的克隆與表達(dá)，<15kb；Ti質(zhì)粒載體—植物基因工程載體，<20kb；酵母人工染色體（YAC）—大基因簇相關(guān)功能基因研究、實現(xiàn)人類基因組計劃和人類疾病相關(guān)基因研究、構(gòu)建真核生物大片段基因文庫，100~2000kb；細(xì)菌人工染色體（BAC）—同上，120~300kb；載體對表達(dá)宿主的基本要求：（1）能夠高效吸收外源DNA；（2）不具有限制修飾系統(tǒng)，不降解導(dǎo)入的未經(jīng)修飾的外源DNA；（3）不具有DNA重組系統(tǒng)，常用重組缺陷型（recA-）菌株；（4）根據(jù)載體類型選擇相應(yīng)宿主：如用?噬菌體或黏粒作為載體，須選擇?噬菌體敏感的宿主（E.coli-K12）；選用M13時，則應(yīng)選擇含有F因子的雄性大腸桿菌為宿主；（5）根據(jù)載體的標(biāo)記選擇合適的宿主，例如載體攜帶氨芐青霉素抗性基因作為選擇標(biāo)記，則應(yīng)選擇氨芐青霉素敏感菌株為宿主；（6）具有安全性，宿主細(xì)胞應(yīng)該對人、畜、農(nóng)作物無害。6、各種常見載體的特點特性：（1）質(zhì)粒載體：含有復(fù)制起點；含有多種限制酶的單一識別位點；含有抗生素抗性基因的選擇標(biāo)記；高拷貝，每個細(xì)胞含有10~200個拷貝的松弛型質(zhì)粒；具有較小的相對分子質(zhì)量，易于DNA的分離和操作；可通過轉(zhuǎn)化或電穿孔法極易導(dǎo)入宿主細(xì)胞。（2）?噬菌體載體：由兩種類型，插入型（只含有一個單一限制位點，用于插入外源基因）和取代型（具有成對的限制酶切位點，外源基因可取代限制位點之間的DNA）；優(yōu)點有：可克隆大約23kb的外源基因，克隆能力大于質(zhì)粒；感染宿主效率高達(dá)100%；不足之處在于，插入的外源基因的長度有限（需控制在野生型?DNA片段的78~105%），因為噬菌體頭部可容納的DNA量有限。（3）黏粒載體：由?噬菌體的COS位點和質(zhì)粒DNA共同構(gòu)建的；特點：克隆能力遠(yuǎn)超過質(zhì)粒和噬菌體（本身5~7kb，克隆35~48kb）；在宿主細(xì)胞內(nèi)以質(zhì)粒形式進(jìn)行復(fù)制；由于可以搭載更大的DNA片段，所以可用于構(gòu)建基因文庫。（4）M13噬菌體載體：M13是大腸桿菌的絲狀噬菌體，其基因組中除了基因間隔區(qū)（GI）外，其他均為復(fù)制和裝配所需要的基因；所以其特點是：后期篩選陽性克隆便利（1、在IG中插入一段可以編碼β-半乳糖苷酶的α肽基因，使其可與LacZ基因突變?nèi)毕菪偷拇竽c桿菌互補(bǔ)生成具有活性的β-半乳糖苷酶。然后將M13和大腸桿菌涂布在含有IPTG和呈色物質(zhì)X-gal的平板上，就會形成藍(lán)色噬菌斑；2、如果在α肽編碼區(qū)內(nèi)插入限制酶切位點，當(dāng)外源基因插入時，便會破壞α肽的互補(bǔ)作用，從而重組噬菌體就會形成白色噬菌斑。）；由于M13一般只能克隆300~400bp的片段，所以常用于制備測序用的單鏈DNA、單鏈DNA探針和定位誘變模板，也可用于噬菌體展示（phagedisplay：將編碼多肽的外源DNA片段與噬菌體表面蛋白的編碼基因融合后，以融合蛋白的形式呈現(xiàn)在噬菌體的表面，被展示的多肽或蛋白可保持相對的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，展示在噬菌體的表面）。（5）噬菌粒載體：由M13的基因間隔區(qū)（含復(fù)制起始位點）和質(zhì)粒DNA共同構(gòu)建的載體。其優(yōu)點是：1、載體本身分子小（約3kb），易于遺傳操作；2、可克隆10kb的外源基因片段，克隆能力高于M13；3、可用于制備單鏈或雙鏈DNA。（真核生物克隆載體）（6）酵母質(zhì)粒載體：多為為穿梭載體，可在酵母細(xì)胞中復(fù)制也可在細(xì)菌中復(fù)制；主要有3種類型：1、附加體質(zhì)粒（可在酵母中復(fù)制，高拷貝）2、復(fù)制質(zhì)粒（可在酵母中復(fù)制，中等拷貝）3、整合質(zhì)粒（能整合到酵母染色體，不能自主復(fù)制，但可在細(xì)菌中自主復(fù)制）。（7）Ti質(zhì)粒載體：為植物基因工程中的理想載體。（8）病毒載體：1、哺乳動物病毒載體（高效識別宿主并將基因整合到宿主細(xì)胞中；高拷貝，強(qiáng)啟動子）；2、昆蟲動物病毒（優(yōu)點：可克隆片段長可達(dá)100kb；高表達(dá)；安全性高）；3、植物病毒載體（植物基因工程載體）。（人工染色體）—大批量攜帶DNA的載體（9）酵母人工染色體（YAC）：一類目前能夠攜帶最大量外源基因的載體；結(jié)構(gòu)上有三個必備元件：著絲粒、端粒、自主復(fù)制序列（一般染色體所必需的）；本身只有10kb，但能攜帶100~2000kb外源DNA片段。因此既保證所插入的外源基因片段結(jié)構(gòu)完整，有可大大減小基因庫所要求的克隆數(shù)。（10）細(xì)菌人工染色體（BAC）：可攜帶120~300kb外源片段；特點：通常僅保留F因子的緊密型控制的復(fù)制子，同時還含有多克隆位點和遺傳標(biāo)記；電穿孔法即可將其倒入宿主細(xì)菌中；不易發(fā)生重組，遺傳性穩(wěn)定，重組DNA也易于分離。純培養(yǎng)獲取技術(shù)whatisculture（培養(yǎng)物）：指在微生物學(xué)中在人為規(guī)定的條件下培養(yǎng)、繁殖獲得的微生物群體；而只有一種微生物的培養(yǎng)物，稱為純培養(yǎng)物（pureculture）。主要可分為四類：（1）固體培養(yǎng)基獲取法：以固化的培養(yǎng)基為微生物生長的承載體，然后通過：涂布平板法（將已熔化的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)制成無菌平板，待凝固后，將一定量的某一稀釋度的樣品的懸液滴加在平板表面，再用無菌涂布棒使菌液均勻地分散在平板表面，經(jīng)培養(yǎng)后即可挑取到單個菌落。）；平板劃線法（用無菌接種環(huán)以無菌操作蘸取少量的分離材料（一般為涂布后培養(yǎng)所得），在無菌平板表面進(jìn)行平行劃線等連續(xù)劃線形式，使接種環(huán)上微生物細(xì)胞數(shù)隨著劃線次數(shù)增加而減少，并逐步分散，如果劃線適宜的話經(jīng)培養(yǎng)后，可直接在平板上得到單一菌落。）；稀釋到平板法（先將待分離的材料逐級進(jìn)行10倍稀釋，然后分別取不同稀釋液少許與已熔化（約50℃）的瓊脂培養(yǎng)基混勻，后倒入無菌培養(yǎng)皿，凝固后即可得含菌瓊脂平板，培養(yǎng)后可得到菌落。缺點：易使熱敏感細(xì)菌死亡，也會阻礙一些嚴(yán)格好氧菌的生長）；稀釋搖管法（用于分離嚴(yán)格厭氧菌株的稀釋倒平板法；先將一系列盛有無菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱，是瓊脂熔化后保持50℃左右，將待分離的材料用這些試管梯度稀釋后，迅速搖勻，冷凝后，在瓊脂表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，隔絕空氣。）（2）液體培養(yǎng)基獲取法：通常采用的液體培養(yǎng)基分離純化法是稀釋法—接種物在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行順序稀釋（較多平行稀釋試管），已得到高度稀釋效果，是一支試管分配不到一個微生物，如稀釋后的試管中沒有微生物生長，那么有微生物生長的試管得到的培養(yǎng)物可能就是純培養(yǎng)物，其中得到純培養(yǎng)物的稀釋度的大多試管（95%）應(yīng)是物微生物生長。缺點：只能分離出混雜微生物群體中的優(yōu)勢種群。（3）單細(xì)胞（孢子）分離法：材料經(jīng)過一定稀釋后在顯微鏡下用毛細(xì)管、顯微針（環(huán)、鉤）挑取單個細(xì)胞或孢子。（4）選擇培養(yǎng)法：主要是根據(jù)目標(biāo)微生物的生長代謝特點等，制備或可抑制其他微生物的生長或極有利于該微生物生長的環(huán)境，從而經(jīng)一段時間培養(yǎng)后使該微生物數(shù)量上升，最后再采取涂布、劃線的方法再進(jìn)一步分離純化。其方法有兩種：選擇平板培養(yǎng)基和富集培養(yǎng)（利用不同微生物間生命活動特點的不同，制定特定環(huán)境條件，使僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長，使人們更容易在自然界中分離到該微生物）。五、基因的轉(zhuǎn)移1、外源基因的導(dǎo)入方法（基因工程轉(zhuǎn)基因方法）：（1）原核細(xì)胞的導(dǎo)入：通?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染等方式將外源基因?qū)朐思?xì)胞。轉(zhuǎn)化：如果外源基因以重組質(zhì)粒形式存在，可通過轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入；轉(zhuǎn)化基本程序：將一定濃度冰冷的CaCl2溶液處理對數(shù)期的大腸桿菌，然后加入外源DNA并在42℃下熱休克處理90s，使感受態(tài)細(xì)胞吸收外源DNA。轉(zhuǎn)染：外源基因以被構(gòu)建成重組噬菌體DNA或重組噬菌粒，則以轉(zhuǎn)染方式進(jìn)入宿主細(xì)胞；（PS：無論轉(zhuǎn)染還是轉(zhuǎn)化，都要先使宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)變成感受態(tài)細(xì)胞，以便吸收外源基因）感染：將重組?噬菌體載體或重組黏粒載體，噬菌體各結(jié)構(gòu)蛋白混合，包裝成?噬菌體，然后去感染大腸桿菌。（效率高于轉(zhuǎn)染）（2）真核細(xì)胞的導(dǎo)入：導(dǎo)入方法因宿主細(xì)胞不同而不同（酵母、哺乳動物、植物）酵母細(xì)胞：通常利用蝸牛酶去除酵母細(xì)胞壁，使其形成原生質(zhì)體；再用氯化鈣和聚乙二醇處理，使重組DNA以轉(zhuǎn)化方式進(jìn)入原生質(zhì)體中；最后將轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體置于再生培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)是原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁形成完整的酵母細(xì)胞。哺乳動物細(xì)胞：較常用也最有效的方法—電穿孔法：將宿主細(xì)胞與重組DNA混合并置于電擊槽中，在高壓脈沖作用下（哺乳動物：250~4000V/cm），使細(xì)胞膜瞬時擊穿形成微孔，進(jìn)而重組DNA從微孔進(jìn)入宿主細(xì)胞。（PS：哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞相對有效）方法二：利用病毒載體導(dǎo)入—如把基因插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，然后將其感染靶細(xì)胞，這樣就可以將RNA基因組的DNA拷貝整合到宿主細(xì)胞染色體中。植物細(xì)胞：除電穿孔法外，還有兩種方法：1、根瘤土壤桿菌轉(zhuǎn)化法：將含有重組Ti質(zhì)粒的土壤桿菌與剛再生了細(xì)胞壁的植物原生質(zhì)體共同培養(yǎng)或與植物葉片共同培養(yǎng)（缺點：僅適用雙子葉植物）；2、基因槍法（微彈轟擊法）：利用高壓氣體，將表面吸附有外源DNA的金屬微粒子高速射入植物細(xì)胞。（缺點：造價較貴）2、細(xì)菌的遺傳轉(zhuǎn)化：遺傳轉(zhuǎn)化（genetictransformation）是指同源或異源的游離DNA分子（質(zhì)粒、染色體DNA）被自然或人工感受態(tài)細(xì)胞攝取，并得到表達(dá)的水平方向的基因轉(zhuǎn)移過程。自然轉(zhuǎn)化：是細(xì)菌等微生物為適應(yīng)自然環(huán)境，自發(fā)啟動感受態(tài)化有關(guān)基因的表達(dá)，從而是自身處于感受態(tài)以吸收其他細(xì)菌釋放的外源基因，從而增強(qiáng)自身的生存能力的一些列過程。（PS：自然感受態(tài)出現(xiàn)過程：細(xì)菌生長到一定階段時會分泌一種小分子的蛋白質(zhì)-感受態(tài)因子，這種感受態(tài)因子會與細(xì)胞表面對應(yīng)的受體結(jié)合并作用，后誘導(dǎo)一些感受態(tài)特異蛋白的表達(dá)；其中一種為自溶素，它的表達(dá)使細(xì)胞表面的DNA結(jié)合蛋白及核酸酶裸露出來，使其具有與DNA結(jié)合的活性。）研究表明，幾乎所有的細(xì)菌都可以向環(huán)境中主動分泌（或細(xì)胞裂解釋放）DNA，這些DNA分子可以與固型物（土粒、砂粒等）結(jié)合從而避免DNase的降解，以保持長時間的活性。另一方面，自然感受態(tài)作為許多細(xì)菌細(xì)胞應(yīng)付不利生活條件的一種調(diào)節(jié)機(jī)制，在自然環(huán)境中存在具有普遍性，有實驗表明，有些環(huán)境中感受態(tài)細(xì)胞在其群落中所占的比例可達(dá)16%。人工轉(zhuǎn)化：是指在實驗室中用多種不同的技術(shù)完成轉(zhuǎn)化過程，包括CaCl2處理、電穿孔等?？蔀橐恍┍旧聿痪哂凶匀晦D(zhuǎn)化能力的細(xì)菌（如大腸桿菌）提供了一條獲取外源基因的途徑，也是基因工程的基礎(chǔ)技術(shù)之一。（mypoint：具有自然轉(zhuǎn)化能力意味著有更加頻繁的基因交流，從而不斷改變對環(huán)境的適應(yīng)能力，也就是說具有該能力的細(xì)菌多半是生存環(huán)境相對多變而不穩(wěn)定。）有關(guān)Ca+誘導(dǎo)法：線性的細(xì)菌DNA較難轉(zhuǎn)化，可能是線性DNA在進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)之前就被周質(zhì)空間內(nèi)的DNA酶降解，而缺乏這種DNA酶的大腸桿菌可高效轉(zhuǎn)化這種DNA。電穿孔法是一種真核、原核都適用的轉(zhuǎn)化方法。3、轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）：是由病毒介導(dǎo)的細(xì)胞之間進(jìn)行遺傳交換的一種方式。具體是指一個細(xì)胞的DNA或RNA通過病毒的感染轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞中。轉(zhuǎn)導(dǎo)可分為兩種：普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)；其中：（1）普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)，噬菌體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)體染色體的任何部分到受體細(xì)胞中；（2）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)，噬菌體只攜帶特定的片段到受體細(xì)胞中，與普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)別在于1、被轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因共價地結(jié)合到噬菌體DNA上，2、攜帶特殊的染色體片段并將固定的個別基因?qū)胧荏w中。溫和噬菌體?是局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的典型代表。七、藥物致癌性檢測試驗Ames試驗：由加利福尼亞大學(xué)的Ames教授首先發(fā)明，該試驗是利用鼠沙門氏菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株的回復(fù)突變（指突變體失去的野生型性狀，可以通過第二次突變得到回復(fù)的現(xiàn)象）性能來決定的。試驗大致為：his-菌株在不含組氨酸的培養(yǎng)基尚不能生長，如果回復(fù)突變率因某種化學(xué)誘變劑（或待測樣品）的作用而增加，則該藥物可判斷為具有致癌性（回復(fù)菌株數(shù)量越多則表示該物質(zhì)誘變能力越強(qiáng)），為了使體外試驗更接近于人體代謝，Ames等采用了在體外加入哺乳動物微粒體酶系統(tǒng)，使待測物活化，從而使準(zhǔn)確率可達(dá)80%~90%。試驗過程：1、在不含組氨酸的平板上接入組氨酸缺陷型沙門氏菌；2、在平板中心挖一個小孔，然后將待測物質(zhì)放入小孔中（物質(zhì)會向四周擴(kuò)散，形成一個濃度梯度）；3、培養(yǎng)一段時間后，如果該物質(zhì)有可致突變性，則該平板上會有菌落生長；如果沒有菌落生長，則證明該物質(zhì)不具致突變性。八、鞭毛檢驗試驗方法一：在半固體（含0.3%~0.4%瓊脂）直立柱中用穿刺法接種某一細(xì)菌，經(jīng)培養(yǎng)后，若刺穿線周圍有呈渾濁的擴(kuò)散區(qū)，則說明該細(xì)菌具有運(yùn)動能力，并可推斷其長有鞭毛；方法二：根據(jù)某細(xì)菌在平板培養(yǎng)基上的菌落外形來判斷，一般情況下，如果該細(xì)菌長出的菌落形狀大、薄且不規(guī)則，邊緣極不圓整，說明該細(xì)菌運(yùn)動能力強(qiáng)；反之，若菌落外形圓整，邊緣光滑、厚度較大，則說明該細(xì)菌為無鞭毛的細(xì)菌。九、無菌操作技術(shù)無菌技術(shù)（aseptictechnique）：在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時防止其被其他微生物污染，且自身也不污染操作環(huán)境的技術(shù)。其中無菌技術(shù)可大致分成三個部分：（1）微生物培養(yǎng)常用器具無菌化（滅菌）：主要是將試管、玻璃燒瓶、培養(yǎng)皿等常用培養(yǎng)器具以及微生物培養(yǎng)基（可單獨處理后加到無菌器具也可加到器具后一同處理）在使用前先行滅菌處理。常用的滅菌方式是高壓蒸汽滅菌，一些玻璃、金屬器具也可以用高溫干熱滅菌；此外，為了防止空氣中的雜菌污染，應(yīng)在試管、燒瓶等加上可容空氣流動但不能通過其他微生物的塞子（如硅膠塞、棉花塞等）；（2）無菌環(huán)境的建立：酒精燈火焰附近、無菌操作臺（使用前先開啟通風(fēng)系統(tǒng)，并同時開啟紫外線燈滅菌）、無菌室（主要通過無菌空氣維持無菌狀態(tài)，操作員進(jìn)入前預(yù)處理）；（3）無菌操作：在動手進(jìn)入無菌環(huán)境操作前，先用酒精消毒雙手；然后如果是用接菌環(huán)轉(zhuǎn)移微生物，則接菌前先將接菌環(huán)在酒精燈外炎灼燒，待冷卻后后再操作；如果是轉(zhuǎn)移液體培養(yǎng)物，則可利用無菌移液槍進(jìn)行。（PS：培養(yǎng)基滅菌：一般培養(yǎng)基采用0.1013MPa，121.3℃,15~30min；含糖類的培養(yǎng)基常在0.56Kg/cm2,112.6℃,15~30min;對于含糖類要求較高的培養(yǎng)基，可先將糖進(jìn)行濾菌或間接除菌，再與其他已滅菌成分混合）（PS2：大多數(shù)實驗室中稱一個樣品無菌，就是指在樣品中找到活菌體的可能性不大于百萬分之一）十、消毒與滅菌-微生物生長繁殖的控制消毒（disinfection），較大程度上減少物體表面或材料內(nèi)部病原微生物的數(shù)量，使其無法引起疾病。滅菌（sterilization）殺死或除去材料中或物品上所有的微生物。微生物生長控制三規(guī)律：（1）微生物死亡呈對數(shù)速度，即在一定時間間隔內(nèi)微生物以一定比例死亡；（2）微生物數(shù)量越少，滅菌所需的時間越短（盡可能做好滅菌前的預(yù)處理）；（3）不同微生物對不同抗微生物劑敏感度不同。根據(jù)消毒滅菌原理不同可分為兩大類：（1）化學(xué)物質(zhì)控制法：1、抗微生物劑（antimicrobialagent），一類能夠殺死或抑制微生物的化學(xué)物質(zhì)，可以使天然產(chǎn)物也可是人工合成產(chǎn)物。一方面，根據(jù)抗微生物的特性可分為3類：1、抑菌劑：能抑制，但不能殺死細(xì)菌；2、殺菌劑：能殺死微生物，但不能使細(xì)胞溶解；3、溶菌劑：通過誘導(dǎo)細(xì)胞裂解來殺死微生物；另一方面，根據(jù)作用效果和作用范圍可分為2類：1、消毒劑：通常用于非生物材料上微生物的殺滅（如儀器設(shè)備、墻壁地板、家具，水池等；空氣常用甲醛、石碳酸、高錳酸鉀等進(jìn)行熏蒸）；2、防腐劑：具有殺死或抑制微生物生長的能力，但一般對于動物或人體組織無毒害作用（如0.1—1%硝酸銀用于防止新生兒眼部因淋病奈琴氏菌感染的致盲）。 2、抗代謝物（antimetabolite），一類能夠干擾微生物正常代謝從而使微生物生長受抑制的生長因子機(jī)構(gòu)類似物（如磺胺類藥物，是葉酸組成部分對氨基苯甲酸（PAB）的結(jié)構(gòu)類似物，磺胺類藥物被微生物吸收后取代對氨基苯甲酸，干擾葉酸形成，抑制轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)，從而導(dǎo)致微生物代謝絮亂。） 3、抗生素（antibiotic），由某些生物合成的或半合成的一類次級代謝物或衍生物，具有抑制或殺死微生物的能力（主要通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成、破壞細(xì)胞膜、作用于呼吸鏈以及干擾氧化磷酸化或抑制蛋白、核酸的合成來抑制或殺死微生物。）（2）物理因素控制法： 1、高溫滅菌法：包括高壓蒸汽滅菌、煮沸滅菌、間歇滅菌法滅菌、干熱滅菌、灼燒等。（PS：衡量滅菌效果的指標(biāo)：1、十倍減少時間（decimalreductiontime），即在一定的溫度條件下殺死某一樣品中90%微生物或孢子及芽孢所需的時間；2、熱致死時間（thermaldeathtime），即在一定溫度下殺死液體中所有微生物所需的時間。）高壓蒸汽滅菌，一般實驗室最常用的滅菌方法，常用采用0.1013MPa，121.3℃,滅菌15~30min；煮沸滅菌，將待消毒的材料置于水中煮沸15min或以上，如果在水中加入1%碳酸鈉或2%~5%石碳酸則殺菌效果更好；間歇滅菌法：即通過流通蒸汽或蒸煮反復(fù)滅菌，基本操作：第一次蒸煮后殺死微生物的營養(yǎng)體，冷卻過夜后，殘留的芽孢會萌發(fā)；第二次蒸煮，便可將芽孢萌發(fā)后產(chǎn)生的營養(yǎng)體全部殺滅?！@樣反復(fù)2~3次，可以完全殺死樣品中含有的芽孢，也可以保持某些營養(yǎng)物質(zhì)不被破壞；干熱滅菌：主要針對一些玻璃、金屬器皿等耐熱物品，但所需時間要比濕熱滅菌長（如：170℃需要1h，160℃需要2h，121℃需要16h）（PS2：巴斯德消毒法：1、瞬時法，71.6℃—至少15s（現(xiàn)在常用超高溫瞬時法：140℃—5s）2、維持法：62.9℃，維持30min，可殺滅大部分微生物。） 2、輻射滅菌法（radiationsterilization）：利用電輻射產(chǎn)生的電磁波來殺死微生物。如微波，通過熱效應(yīng)殺滅細(xì)菌；UV、X-ray、γ-ray等通過干擾或直接破壞大生物分子來達(dá)到殺滅微生物的效果。 3、過濾法除菌：該方法主要針對空氣和不耐熱液體培養(yǎng)基等設(shè)計的方法，有三種類型：1、（最原始的）在一個容器的兩層濾板間填充棉花、玻璃纖維。石棉等；2、膜濾器，由醋酸纖維素或硝酸纖維素制成的帶微孔（0.22~0.45μm）的膜；3、核孔濾器，由核輻射處理的薄聚碳酸膠片（厚度10μm）再經(jīng)過化學(xué)蝕刻而成（主要用于科學(xué)研究）。 4、高滲作用：微生物生長對環(huán)境的滲透壓也有一定要求，當(dāng)外界滲透壓高于或低于微生物胞內(nèi)滲透壓時，都會阻礙微生物的正常代謝甚至死亡，所以利用改變外界環(huán)境的滲透壓也可達(dá)到控制微生物的效果（如食品腌制）。 5、干燥作用：水是微生物細(xì)胞的重要組成部分（占活細(xì)胞90%以上），降低物質(zhì)的含水量直至干燥就可有效抑制微生物生長，防止腐敗霉變等。 6、超聲波作用：超聲波可產(chǎn)生的空穴效應(yīng)，可將進(jìn)入空穴區(qū)的微生物細(xì)胞裂解破碎。十一、營養(yǎng)缺陷型菌株分離營養(yǎng)缺陷型（auxotroph），是一種缺乏合成其生存所必需的營養(yǎng)物質(zhì)的突變型，只有從環(huán)境或培養(yǎng)基中獲得這些營養(yǎng)物質(zhì)或前體物才能生長。影印平板分離法（replicaplating）：（1）將待分離突變株的原始菌株以合適的稀釋度涂布到野生型和突變型菌株都能生長的主平板a（完全培養(yǎng)基）上，經(jīng)過培養(yǎng)后形成單菌落；（2）通過一個消毒的“印章”（直徑略小于培養(yǎng)皿底，表面包有絲絨布）將a平板的菌落分別原位轉(zhuǎn)移（或印跡）到平板c（與a平板相同營養(yǎng)成分）和平板d（選擇培養(yǎng)基，突變型無法生長）；（3）經(jīng)過培養(yǎng)后對照觀察平板c和d上形成的單菌落，如果在c上生長而d上不生長，則為所需的分離的突變型；（4）在c平板上挑取d平板上不能生長的相應(yīng)位置的單菌落，并進(jìn)一步在完全培養(yǎng)基上劃線純化。十二、病原體驗證試驗1、科赫定理4原則：（要證明某種微生物是引起某種疾病的致病因子所必須滿足的4條原則）（1）在每一個病例中必須找到特異的病原體；（2）病原體必須能從患病宿主中分離得到，且能純培養(yǎng)；（3）將純培養(yǎng)的病原體接種到健康的易感宿主，能夠引起同樣的病癥；（4）從接種后患病的實驗宿主中必須能分離到與原始病原體相同的病原體。（PS:科赫定理可以驗證多數(shù)但不是所有的病原，因為有些病原體如梅毒密螺旋體很難培養(yǎng)，直到現(xiàn)在也未能人工培養(yǎng)；又有些除了人以外無其他宿主的微生物，除非有志愿者，否則無法接種易感宿主。）2、驗證方法之科赫定理驗證法：（a）從感染動物體內(nèi)分離疑似病原體微生物，然后進(jìn)行純培養(yǎng)；（b）將分離并純培養(yǎng)后的微生物注射到易感健康的實驗宿主體內(nèi)；（c）如果動物患?。赡芩劳觯?，分離其體內(nèi)的疑似病原微生物，并純培養(yǎng)；（d）比對兩次分離得到的純培養(yǎng)物，如果相同則證明所提取的微生物為該疾病的病原體。十三、菌株鑒定常規(guī)鑒定大致的步驟（以細(xì)菌為例）：（1）首先要掌握菌株的一些基本特征，如細(xì)胞的形態(tài)、革蘭氏染色結(jié)果、以及其他突出的形態(tài)學(xué)特征；（2）了解其營養(yǎng)類型、需氧性等突出生理生化特征；（3）在前邊的基礎(chǔ)上查閱分類（鑒定）手冊或有關(guān)資料，確定該菌株屬于哪一大類，然后利用資料中有關(guān)該類群的分類檢索表或特征比較表格等資料中所提供的鑒別特征進(jìn)行進(jìn)一步的特征測定；（4）在根據(jù)測定結(jié)果查對檢索表或有關(guān)特征描述，逐步縮小菌株的歸屬范圍，初步確定菌株所歸屬的科、屬；（5）如果要鑒定到種，則需要進(jìn)一步查閱相關(guān)屬的分種檢索表或相關(guān)分種的鑒別特征資料。進(jìn)一步地鑒定，最后初步確定其歸屬的種。鑒定方案2：（1）對鑒定樣品進(jìn)行檢查，看是否需要進(jìn)一步純化；（2）測定該菌株的一些最基本的形態(tài)和生理生化特征，然后根據(jù)微生物分類鑒定手冊等有關(guān)資料，確定該菌株屬于哪一大類；（3）根據(jù)待測菌株所屬的類群，進(jìn)行16rRNA或18SrRNA基因序列測定，從而可以得知該菌株與相關(guān)數(shù)據(jù)庫中已知微生物的相似性，進(jìn)而初步確定其分類地位；（4）進(jìn)一步檢測該菌株的表型特征、生理生化特征以及相關(guān)化學(xué)組分，必要時進(jìn)行管家基因序列等分析；（5）綜合前邊的檢測結(jié)果，確定菌株的分類地位。十四、微生物的保藏技術(shù)1、傳代培養(yǎng)保藏（短期）采用傳代培養(yǎng)保藏微生物應(yīng)注意針對不同菌種選擇適宜的培養(yǎng)基，并在規(guī)定時間內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)移；在瓊脂斜面上保藏微生物因菌種的不同，保藏的時間也會不同，一般來說通過降低被保藏微生物的代謝水平或防止培養(yǎng)基干燥可以延長傳代保藏保存的時間。（如：在菌株生長良好時，改用橡皮塞密封或在培養(yǎng)基上覆蓋上一層石蠟，并且降低保藏溫度；）（PS：懸液保藏法：將一些菌苔直接刮入蒸餾水或緩沖液中，密封置于4℃保藏。）常用方法：瓊脂斜面、半固體瓊脂柱及液體培養(yǎng)基。缺點：長期傳代操作繁瑣、容易放生污染，菌株容易放生突變而產(chǎn)生衰退。2、冷凍保藏微生物處于冷凍狀態(tài)時，其代謝作用也會停止，可達(dá)到保藏的目的。注意事項1：進(jìn)行冷凍時，應(yīng)適當(dāng)采用速凍的方法，可避免產(chǎn)生大冰晶從而損傷細(xì)胞；同時，升溫時也應(yīng)采用快速升溫的方式，可避免因升溫而使冰晶增長產(chǎn)生對細(xì)胞的傷害；注意事項2：冷凍時的介質(zhì)也會對細(xì)胞產(chǎn)生損傷，因此，像冷凍前加入甘油或二甲亞楓可降低細(xì)胞強(qiáng)烈的脫水作用來保護(hù)細(xì)胞，所以一般冷凍保藏時都需要加入保護(hù)劑來提高保藏物的存活率。注意事項3：一般推薦（加了甘油保護(hù)劑）在-70℃低溫冰箱保存，如條件不足，在-20~-30℃普通冰箱保存是應(yīng)注意避免因冰箱溫度變化引起的培養(yǎng)物的反復(fù)凍融而造成的細(xì)胞損傷。3、干燥保藏法（最普遍、有效） 常見的干燥保藏技術(shù)：沙土管保存和冷凍真空保藏。沙土管保存，主要適用于產(chǎn)孢子的微生物，如芽孢桿菌、放線菌等；一般過程：（1）將菌種接種到斜面，培養(yǎng)至長出大量孢子；（2）洗下孢子制成孢子懸液；（3）然后加入無菌的沙土管中，減壓干燥直至將水分抽干；（4）最后用石蠟、膠塞等封閉管口，置于冰箱。冷凍真空保藏，是將加有保護(hù)劑的細(xì)胞樣品預(yù)先冷凍，使其凍結(jié)后，在真空狀態(tài)下通過冰的升華作用去除水分；干燥后的樣品可以在真空或惰性氣體的密閉環(huán)境中低溫保存，從而使微生物處于干燥、缺氧、低溫的狀態(tài)下進(jìn)入休眠，進(jìn)而可長時間地進(jìn)行保藏。十五、培養(yǎng)基（culturemedium）1、配制原則：①選擇適合的營養(yǎng)物質(zhì)：一般而言，培養(yǎng)基都應(yīng)含有碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子、水和能源。但由于微生物營養(yǎng)類型復(fù)雜，對營養(yǎng)物質(zhì)要求也不一樣，因此配制培養(yǎng)基時，應(yīng)首先針對所培養(yǎng)的微生物的營養(yǎng)類型來配制針對性強(qiáng)的培養(yǎng)基。一般常用的3種培養(yǎng)基：（1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，常用于培養(yǎng)細(xì)菌；（2）高氏一號培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)放線菌；（3）查氏培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)霉菌；（PS：酵母菌常用麥芽汁培養(yǎng)基）；②適宜的營養(yǎng)濃度及配比：培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)濃度合適時微生物才能良好生長，濃度過低不能滿足微生物正常代謝生長，過高則會抑制生長。另外培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物質(zhì)的之間濃度配比也會影響微生物的生長代謝，其中尤其是碳氮比。③PH控制：一般而言，細(xì)菌和放線菌適于PH7~7.5范圍內(nèi)生長；酵母菌和霉菌適合在PH4.5~6范圍內(nèi)生長；然而由于微生物在生長繁殖過程中的新陳代謝會使的培養(yǎng)基的PH產(chǎn)生變化，所以通常會在培養(yǎng)基中加入磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀混合而成的緩沖劑，以控制PH。④控制氧化還原電位：不同微生物生長對氧化還原電位的要求不一樣，一般好氧菌Φ值在0.1V以上能正常生長（0.3~0.4V為宜），厭氧菌只能在低于0.1V條件下生長，兼性厭氧菌在Φ值為0.1V可進(jìn)行有氧呼吸，0.1V以下進(jìn)行發(fā)酵；控制方法：在PH值穩(wěn)定情況下，提高氧分或加入氧化劑可增加Φ值；在培養(yǎng)基中加入抗壞血酸、半胱氨酸等還原性物質(zhì)可降低Φ值。⑤原料選擇：盡可能利用廉價且易于獲得的原料作為培養(yǎng)基成分，特別是在發(fā)酵工業(yè)中。⑥滅菌處理：要獲得純培養(yǎng)物，就必須避免雜菌污染，因此需要對使用器材、工作場所和配制好的培養(yǎng)基進(jìn)行消毒滅菌。培養(yǎng)基常用高溫高壓滅菌處理，工作場所常定期使用福爾馬林進(jìn)行熏蒸。2、幾種培養(yǎng)基：（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含有一般微生物生長繁殖所需要的基本營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基；可滿足大部分微生物的最基本生長需求（如：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）；（2）加富培養(yǎng)基，也稱營養(yǎng)培養(yǎng)基即在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊的營養(yǎng)物質(zhì)制成的類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基（特殊營養(yǎng)物質(zhì)：如血液、血清、酵母浸粉、動物組織液等），常用于培養(yǎng)營養(yǎng)要求嚴(yán)苛的異養(yǎng)微生物（如百日咳德氏菌）；（PS：加富培養(yǎng)基與選擇培養(yǎng)基區(qū)別：加富培養(yǎng)基是用來增加所要分離的微生物的數(shù)量，使其形成生長優(yōu)勢從而得到分離；而選擇培養(yǎng)基一般是抑制不需要的微生物的生長，從而使所需要的微生物增殖。）（3）鑒別培養(yǎng)基，用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基。原理：通過加入某種特殊的化學(xué)物質(zhì)，從而使目標(biāo)微生物在培養(yǎng)基生長后能產(chǎn)生某種代謝物，而這種代謝物可以與培養(yǎng)基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特殊的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征性變化，進(jìn)而就可將該微生物與其他微生物區(qū)分開來。（PS：主要用于快速分類鑒定以及分離和篩選菌種）（4）選擇培養(yǎng)基，用來將特定的微生物從混雜的微生物群體中分離出來的培養(yǎng)基；其原理是在培養(yǎng)基中加入特定的化學(xué)物質(zhì)或特殊營養(yǎng)物質(zhì)，抑制不需要的微生物生長，來增加所需微生物的生長繁殖。（5）其他幾種培養(yǎng)基：a.分析培養(yǎng)基，常用來分析某些化學(xué)物質(zhì)的濃度也可用于分析微生物的營養(yǎng)需求；b.還原性培養(yǎng)基，專門用來培養(yǎng)厭氧型微生物；c.組織培養(yǎng)物培養(yǎng)基，含有動植物細(xì)胞，用來培養(yǎng)病毒、衣原體、立克次氏體等專性活細(xì)胞寄生的微生物。3、培養(yǎng)技術(shù)的突破與發(fā)展：進(jìn)展一、在培養(yǎng)基中加入一些非傳統(tǒng)的生長底物促進(jìn)新型微生物的生長，并發(fā)現(xiàn)一些新生理型的微生物。（如從海底沉積物中分離出一種以有毒亞磷酸作為電子供體，硫酸作為受體的新型化學(xué)能無機(jī)自養(yǎng)微生物—Desulfotignum）；進(jìn)展二、采用營養(yǎng)成分缺乏的培養(yǎng)基—營養(yǎng)濃度是正常的1%（如以補(bǔ)充磷酸鹽、銨鹽和有機(jī)碳源的海水為培養(yǎng)基，研究發(fā)現(xiàn)了北美西海岸的浮游細(xì)菌（SAR11）的生態(tài)分布和確定其進(jìn)化的分類地位）；進(jìn)展三、采用新穎的培養(yǎng)方法，模擬天然環(huán)境，以流動式供應(yīng)營養(yǎng)液，使不同微生物細(xì)胞間可以進(jìn)行細(xì)胞交流，實現(xiàn)細(xì)胞互喂（cross-feeding），促進(jìn)菌落形成。方法有：細(xì)胞微囊法和擴(kuò)散小室法。十六、顯微鏡與顯微技術(shù)根據(jù)顯微鏡的成像原理可將當(dāng)前所使用的顯微鏡分為3類：光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡和探針掃面顯微鏡。（1）光學(xué)顯微鏡。1、明視野顯微鏡，原理：光纖投射照明，物象處于亮背景中。2、暗視野顯微鏡，通過特殊的聚光器實現(xiàn)斜射照明，亮物象形成于暗背景中。（應(yīng)用：不易被染色或染色易破壞樣本結(jié)構(gòu)的觀察-如梅毒密螺旋體；觀察活細(xì)胞運(yùn)動）3、相差顯微鏡，通過特殊的聚光器和物鏡將通過樣品不同部位產(chǎn)生的光波相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹睿靼挡町悾?，以提高樣品不同部位間的反差。（應(yīng)用于活細(xì)胞及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的觀察）4、熒光顯微鏡，經(jīng)過熒光染料染色或熒光抗體處理的樣品在紫外線等短波長光照射下激發(fā)出長波光的可見光，在暗背景中形成明亮的彩色物象。5、激光共聚焦顯微鏡，以激光作為光源，每次照明樣品的一個點，連續(xù)掃描后經(jīng)計算機(jī)處理獲得樣品二維或三維圖像，對工作環(huán)境和技術(shù)操作要求較高。（應(yīng)用：對完整細(xì)胞的細(xì)微立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察和分析）（2）電子顯微鏡。1、透射電鏡，用電子束作為“光源”聚焦成像，分辨率較光學(xué)顯微鏡大大提高，但設(shè)備龐大、造價高昂，樣品觀察需要真空環(huán)境。（用于觀察病毒等顆粒微小的樣品的形態(tài)特征或通過超薄切片觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)）2、掃描電鏡，電子束在樣品表面進(jìn)行掃描，收集樣品表面被激發(fā)形成的二次電子形成的物象。（一般用于觀察樣品表面的立體結(jié)構(gòu)）（3）探針掃描顯微鏡。（此類顯微鏡相比電子顯微鏡，能提供更高分辨率，且可在生理狀態(tài)下對生物大分子或細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，對觀察環(huán)境要求相對較低，且儀器體積小，價格也相對便宜）1、隧道掃描顯微鏡，用細(xì)小的探針在樣品表面進(jìn)行掃描，通過記錄針尖和樣品間隧道效應(yīng)電流的變化形成物象。2、原子力顯微鏡，利用細(xì)小探針對樣品表面進(jìn)行恒定高度掃描，同時通過一個激光裝置來監(jiān)測探針隨樣品表面的升降變化來獲得樣品表面形貌信息。十八、同步培養(yǎng)技術(shù)(synchronousculture)同步培養(yǎng)，是一種使微生物群體中不同步的細(xì)胞轉(zhuǎn)變成能同時進(jìn)行生長或分裂的群體細(xì)胞的培養(yǎng)方法；同步生長，以同步培養(yǎng)方法使群體細(xì)胞能處于同一生長階段，并同時進(jìn)行分裂的生長方式。同步培養(yǎng)主要可歸納為兩大類：機(jī)械法和環(huán)境條件控制技術(shù)。 1、機(jī)械法：常用的有三種：（1）離心法（質(zhì)量），將不同步的細(xì)胞懸浮在不被這種細(xì)菌利用的糖或葡聚糖的不同梯度溶液中，通過密度梯度離心將不同細(xì)胞分布呈不同細(xì)胞帶，每一細(xì)胞帶大致都是出于同一生長階段，分別將其取出進(jìn)行培養(yǎng)便可獲得同步細(xì)胞；（2）過濾分離法（大小）：將不同步的細(xì)胞培養(yǎng)物通過孔徑大小不同的微孔過濾器，從而將大小不同的細(xì)胞分開，然后分別將濾液中的細(xì)胞取出進(jìn)行培養(yǎng)，就可獲得同步細(xì)胞；（3）硝酸纖維素濾膜法（粘附性），其原理是根據(jù)細(xì)菌能緊緊地結(jié)合到硝酸纖維素濾膜上的特點，將細(xì)菌懸液通過墊有硝酸纖維素濾膜的過濾器，然后將濾膜顛倒過來，在讓培養(yǎng)基流過濾器，以洗去未結(jié)合的細(xì)菌，這時新分裂的細(xì)菌被洗下來，分步收集并通過培養(yǎng)即可獲得同步細(xì)胞。 2、環(huán)境條件控制法：這類技術(shù)是根據(jù)細(xì)菌生長與分裂對環(huán)境因子要求不同的原理設(shè)計的一類同步細(xì)胞的方法。主要有：（1）溫度控制法：通過適宜與不適宜的溫度來回交替處理后，通過培養(yǎng)便可獲得同步細(xì)胞；（2）培養(yǎng)基成分控制法：培養(yǎng)基中的碳、氮源或生長因子不足時，可導(dǎo)致細(xì)菌緩慢生長直至停止。因此，方法一（饑餓法）：將不同步的細(xì)菌在營養(yǎng)不足條件下培養(yǎng)一段時間，然后再轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；方法二（抑制法）：將不同步細(xì)胞轉(zhuǎn)接到含有一定濃度的，能抑制蛋白質(zhì)等生物大分子合成的化學(xué)物質(zhì)（如抗生素等）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間，再轉(zhuǎn)接到完全培養(yǎng)基里培養(yǎng)。十九、微生物生長測定技術(shù)微生物生長測定，可以用來客觀評價培養(yǎng)條件、營養(yǎng)物質(zhì)等對微生物生長的影響，或評價不同的抗菌物質(zhì)對微生物產(chǎn)的作用效果，或客觀反映微生物的生長規(guī)律。測定方法有：計數(shù)法、重量法和生理指標(biāo)法等。 1、計數(shù)法，此類方法通常用來測定樣品中所含細(xì)菌、孢子、酵母菌等單細(xì)胞微生物的數(shù)量。其中又可分為：（1）直接計數(shù)法，利用特定的血球計數(shù)板或細(xì)菌計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中的微生物數(shù)量；缺點：不能區(qū)分活、死細(xì)胞；計算公式：每毫升原液細(xì)菌數(shù)=每小格平均細(xì)菌數(shù)*400*1000*稀釋倍數(shù)。（2）間接計數(shù)法，又稱活菌計數(shù)法，原理：每個活細(xì)菌在適宜的培養(yǎng)條件下可以通過生長形成單一的菌落；常用方法：將待測樣品經(jīng)一系列10倍稀釋，然后選擇3個稀釋度的菌液，分別取0.2ml放入無菌培養(yǎng)皿中，在倒入適量的已熔化并降溫至45℃左右的培養(yǎng)基，混勻、冷卻凝固后放入是以環(huán)境中培養(yǎng)，長出菌落后計數(shù)；公式：每毫升原液活菌數(shù)=同一稀釋度3個以上重復(fù)培養(yǎng)皿菌落平均數(shù)*稀釋倍數(shù)*5；缺點：易于因人為失誤而造成污染或結(jié)果不穩(wěn)定和測定絲狀體微生物。（3）比濁法，原理：在一定范圍內(nèi)，細(xì)菌的懸液中細(xì)胞濃度和渾濁度呈正比，即細(xì)菌數(shù)量越多，光密度越大。方法：借助于分光光度計，在一定波長下測定菌懸液的光密度（opticaldensity-OD）表示菌量。 2、重量法，是根據(jù)每個細(xì)胞都有一定的重量而設(shè)計的，用于單細(xì)胞、多細(xì)胞以及絲狀體微生物生長的測定。方法（鮮干重）：將一定體積的樣品通過離心或過濾將菌體分離出來，經(jīng)過洗滌，再離心后直接稱重，求出濕重（如果是絲狀微生物，過濾后用濾紙吸干是水分再稱重）；然后將樣品裝入已知重量的培養(yǎng)皿等容器中，在105℃下烘干至恒重，后在干燥器中冷卻，稱量干重。（PS：如果測定長在培養(yǎng)基上的絲狀真菌、放線菌，可將培養(yǎng)基緩慢加熱到50℃熔化瓊脂，再過濾得到菌絲體，然后用生理鹽水洗滌）；（PS2：凱氏定氮法—總含氮量與蛋白質(zhì)總量間的關(guān)系換算公式：蛋白質(zhì)總量=含氮量*6.25；細(xì)胞總量=蛋白質(zhì)總量/65%約等于總蛋白質(zhì)量*1.54） 3、生理指標(biāo)法，生理指標(biāo)包括微生物的呼吸強(qiáng)度、耗氧量、酶活性、生物熱等，樣品中生物數(shù)量越多或生長越旺盛，這些指標(biāo)越明顯，因此借助特定儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量熱計等來測定。（主要用來分析微生物的生理活動）二十、病毒研究的基本方法主要有：病毒的分離與純化、病毒定量測定、病毒的鑒定三大類。1、病毒的分離與純化：（1）分離病毒的分離是將疑有病毒而待分離的標(biāo)本經(jīng)過處理后，接種于敏感宿主、雞胚或細(xì)胞中培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間孵育后，通過檢查病毒特異性感染表現(xiàn)或用其他方法來肯定病毒存在的研究方法。主要過程：（a）標(biāo)本采集與處理：原則，應(yīng)確保用于分離的樣本應(yīng)含有足夠量的活病毒；所以采集策略：根據(jù)所需采集標(biāo)本的種類，確定采集時間和標(biāo)本處理方法；此外，一方面為了避免細(xì)菌污染，標(biāo)本一般都應(yīng)該加入抗生素除菌（或用過濾、離心），另一方面，為了使病毒充分釋放且保持活性，在研磨或超聲波處理后應(yīng)該立即接種（若需保存或運(yùn)送，數(shù)小時內(nèi)可置于50%中性甘油內(nèi)4℃保存，較長時間則需-20℃或干冰保存）；（b）標(biāo)本接種與感染表現(xiàn)：接種策略，標(biāo)本接種于何種實驗宿主（雞胚、細(xì)菌、動物細(xì)胞等），以及選擇何種接種途徑主要取決于病毒宿主的范圍和組織嗜性，同時應(yīng)該考慮操作簡單、易于培養(yǎng)、所產(chǎn)生的感染結(jié)果容易判斷等要求。（例如：噬菌體—細(xì)菌培養(yǎng)物，液體培養(yǎng)基-渾濁變清澈，瓊脂平板-噬菌斑；嗜神經(jīng)病毒—腦內(nèi)接種；嗜呼吸道病毒—鼻腔接種、雞胚尿囊等）（PS：由于組織培養(yǎng)生長的細(xì)胞對病毒敏感性較體內(nèi)成熟細(xì)胞高，同時體外也沒有免疫系統(tǒng)干擾，操作相對簡便，所以目前多數(shù)動物病毒都利用離體細(xì)胞來培養(yǎng)）。感染表現(xiàn)：顯微鏡觀察現(xiàn)象—大多數(shù)動物病毒感染敏感細(xì)胞培養(yǎng)物都能引起細(xì)胞產(chǎn)生病變效應(yīng)（cytopathiceffect，CPE），如細(xì)胞聚集成團(tuán)、腫大、圓縮或形成合胞體、出現(xiàn)包涵體，乃至細(xì)胞裂解等現(xiàn)象；所以接種于細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)本主要以細(xì)胞病變作為病毒感染指標(biāo)。肉眼觀察現(xiàn)象—標(biāo)本進(jìn)過適當(dāng)稀釋在進(jìn)行接種并輔以染色處理，病毒便可在單層細(xì)胞上形成肉眼可見的局部病損區(qū)域，即蝕斑（Plaque）。 （2）病毒純化制備純凈的病毒材料而盡可能除去其他雜質(zhì)的過程。1、兩大純化標(biāo)準(zhǔn)：（a）純化的病毒制備物必須保持病毒原有的感染性；（b）純化病毒制備物的毒力大小、形態(tài)、密度、化學(xué)組成及抗原特性應(yīng)當(dāng)具有均一性表現(xiàn)，并可利用超速離心、電泳、電鏡或免疫學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢查。2、常用純化方法：第一，利用蛋白質(zhì)提純的方法來純化病毒（病毒的主要成分是蛋白質(zhì)）故可以使用鹽析、等電點沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、凝膠層析及離子交換層析等；第二，超速離心純化，因為病毒顆粒有一定的大小、形狀和密度，，一般可以在10000~100000g的離心場中沉淀1~2小時。（廣泛用于病毒純化）2、病毒感染性測定（assayofinfectivity）病毒的感染性測定，是指對有感染性病毒顆粒數(shù)量的測定；感染性測定所測得的都不是感染性病毒顆粒的絕對數(shù)量，而是能引起宿主或細(xì)胞一定特異性反應(yīng)的病毒最小劑量，即感染單位（IU）；病毒的效價（滴度）：每毫升病毒懸液所含的感染單位數(shù)目（IU/ml）。測定方法：（a）蝕斑測定法（最先是為測定噬菌體感染性所建立的）：原理：病毒感染細(xì)胞后，由于固體介質(zhì)的限制，釋放的病毒只能由最初感染的細(xì)胞向周邊擴(kuò)展。經(jīng)過幾個增殖周期，便形成一個局限性病變細(xì)胞區(qū)，此即病毒蝕斑。從理論上講，一個蝕斑是由最初感染細(xì)胞的一個病毒顆粒形成的，因而該項技術(shù)常用于病毒顆粒計數(shù)和分離病毒克隆。噬菌體檢測：一般采用瓊脂疊層法，即以一定量的經(jīng)過系列稀釋的噬菌體懸液分別于高濃度的敏感細(xì)菌懸液以及半固體營養(yǎng)瓊脂均勻混合后，涂布在已鋪有較高濃度的營養(yǎng)瓊脂平板上，經(jīng)過孵育后在延伸成片的菌苔上可出現(xiàn)分散的單個噬菌斑。因為噬菌斑的數(shù)目與加入樣品的有感染性的噬菌體顆粒數(shù)量呈正比，統(tǒng)計噬菌斑數(shù)目后可計算出噬菌體懸液的效價，并以菌落形成單位（PFU）/mL表示；動物病毒檢測：其噬菌斑的測定方法與噬菌體的噬菌斑計數(shù)方法類似，不同在于動物病毒是以生長在固定支持物上的單層細(xì)胞代替了菌苔，由于動物病毒在單層細(xì)胞上所產(chǎn)生的蝕斑表現(xiàn)不同，所以有空斑測定、合胞體計數(shù)、轉(zhuǎn)化灶測定和吸附蝕斑測定等不同方式，但最終的病毒效價都以蝕斑形成單位PFU表示。植物病毒：壞死斑測定（枯斑測定），用金剛砂之類的能破壞植物表皮與細(xì)胞壁的粉末狀物質(zhì)與一定量的植物病毒混合摩擦植物葉片進(jìn)行接種，以產(chǎn)生的壞死斑的數(shù)目來測定病毒效價。（PS：病毒懸液的滴度以每毫升蝕斑形成單位（PFU/ml）來表示。例如，3個細(xì)胞瓶的平均蝕斑是58，接種量為0.2ml，病毒的稀釋度為2.5×103，則病毒原液的滴度為：58÷0.2×2.5×103＝7.25×105（PFU/ml））（PS2：技術(shù)應(yīng)用：蝕斑技術(shù)可以應(yīng)用于分離病毒的克?。o性繁殖純系）、病毒或血清的滴定，也可用蝕斑形態(tài)和大小研究病毒的生物學(xué)特性。）（b）終點法（針對不能形成蝕斑或或壞死斑的動植物病毒）操作方法：1、取等體積的進(jìn)過10倍或2倍稀釋的病毒系列稀釋液分別接種同樣的實驗單元；2、經(jīng)過一致時間孵育后，試驗單元群體中的半數(shù)（50%）個體出現(xiàn)某一感染反應(yīng)所對應(yīng)的病毒劑量確定為病毒樣品的效價（半數(shù)效應(yīng)劑量），以對應(yīng)的病毒稀釋度的倒數(shù)的對數(shù)值表示。半數(shù)效應(yīng)劑量類型：（1）半數(shù)致死劑量—LD50；（2）半數(shù)感染劑量—ID50；（3）半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量—TCID50。3、病毒的鑒定（1）根據(jù)病毒感染宿主范圍及感染表現(xiàn)鑒定，大多數(shù)病毒都有相當(dāng)專一的宿主范圍，因而病毒的宿主譜可作為病毒初步鑒定的指標(biāo)；（2）病毒的理化性質(zhì)鑒定，利用電鏡技術(shù)、超速離心技術(shù)等可檢查毒粒大小、形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征，測定病毒及其組分的沉降系數(shù)、浮力密度和相對分子質(zhì)量，鑒定病毒的核酸類型；以及紫外線、化學(xué)藥劑和脂溶劑等理化因子對病毒感染性作用，確定病毒的對不同理化因子的敏感性。（3）血細(xì)胞凝集性質(zhì)鑒定，許多病毒能吸附于一定種類的哺乳動物劇或禽類的血細(xì)胞表面產(chǎn)生凝集現(xiàn)象，而且不同的病毒所凝集的血細(xì)胞的種類以及發(fā)生凝集所要求的溫度、PH條件可能不同，這些性質(zhì)給病毒鑒定提供了重要的依據(jù)。（4）免疫學(xué)鑒定，建立在抗原-抗體特異性反應(yīng)基礎(chǔ)上的免疫學(xué)方法是一類常見且重要的病毒鑒定方法，主要技術(shù)有：免疫沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)、血凝抑制實驗、中和實驗、免疫熒光、免疫電32鏡以及單克隆抗體等。PS：利用病毒的性質(zhì)來檢測抗原-抗體反應(yīng)的方法：血凝抑制實驗和中和實驗。血凝抑制實驗，是根據(jù)特異性的病毒抗體和病毒表面有凝血活性的蛋白質(zhì)結(jié)合，可抑制病毒血細(xì)胞凝集反應(yīng)發(fā)生的原理而設(shè)計的；中和實驗，是建立在病毒中和作用的基礎(chǔ)上，即某些特異性病毒抗體與病毒顆粒作用，能夠使病毒失去感染能力從而阻止了病毒的繁殖的原理設(shè)計的。（5）分子生物學(xué)方法，可運(yùn)用聚丙烯酰氨凝膠電泳、蛋白質(zhì)肽圖與N端氨基酸分析、核酸的酶切圖譜和寡核苷酸圖譜分析、分子雜交、序列測定及PCR等方法鑒定病毒核酸、蛋白質(zhì)等組分的性質(zhì)，在分子水平上闡明病毒性質(zhì)，可對進(jìn)行準(zhǔn)確分類鑒定提供直接可靠的證據(jù)。（例如尚不能在細(xì)胞培養(yǎng)中增殖的人乳頭瘤病毒（HPV）的檢測主要是用各種類型的核酸雜交方法，其分型亦是根據(jù)基因組的序列同源性，分型界限是50%同源性，超50%同源性則為亞型）二十一、DNA作為遺傳物質(zhì)的實驗證明DNA作為遺傳物質(zhì)的第一個實驗：Avery和他的合作者分別用降解DNA、RNA或蛋白質(zhì)的酶作用于有毒的S型肺炎雙球菌細(xì)胞提取物，選擇性地破壞這些細(xì)胞成分，然后在于R型細(xì)胞混合；觀察結(jié)果顯示，只有DNA被酶降解的提取物無轉(zhuǎn)化作用，從而說明了DNA是格里菲斯實驗中的轉(zhuǎn)化因子。證明DNA是遺傳物質(zhì)的第二個實驗：1953年，Alfred和Martha用32P標(biāo)記T2噬菌體的DNA和用35S標(biāo)記噬菌體的蛋白質(zhì)外殼，然后用這兩種不同標(biāo)記的病毒分別侵染大腸桿菌，后離心分析發(fā)現(xiàn)，用含有35S蛋白質(zhì)的T2噬菌體感染大腸桿菌時，大多數(shù)放射性同位素都留在宿主細(xì)胞外邊，而用32P標(biāo)記的T2噬菌體侵染宿主時，則發(fā)現(xiàn)32PDNA被注入了宿主細(xì)胞，并產(chǎn)生了噬菌體后代。二十四、誘變育種技術(shù)誘變育種是指通過各種誘變劑處理微生物細(xì)胞，提高基因突變頻率后在通過一定的篩選方法獲得所需的菌株。常用的誘變育種方法：物理誘變—紫外線誘變法：1、誘變處理前，先開紫外線燈預(yù)熱20min，使光波穩(wěn)定；2、將3~5ml細(xì)胞懸液置于6cm培養(yǎng)皿中，置于誘變箱內(nèi)的電磁攪拌器上照射3~5min進(jìn)行表面殺菌；3、打開培養(yǎng)皿蓋，開啟電磁攪拌器，照射處理一定時間（根據(jù)實際情況）；4、處理后，在紅光燈下，吸取一定量的菌液，經(jīng)過稀釋后，去0.2ml涂平板（或經(jīng)暗培養(yǎng)一段時間后涂板）?；瘜W(xué)誘變—5-溴尿嘧啶（5-BU）誘變法：1、稱取5-BU，加入無菌生理鹽水微熱溶解，使?jié)舛葹?mg/ml；2、將細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期并重懸浮于緩沖液或生理鹽水中過夜，使其耗盡自身營養(yǎng)物質(zhì)；3、將5-UB加入培養(yǎng)基中，濃度10~20ug/ml，混勻后倒平板，涂菌液，使其在生長過程中誘變，然后挑取菌落測定。（PS：1、為了提高誘變效率，常用物理、化學(xué)兩種誘變劑交替使用；2、一般選用菌株的對數(shù)期效果最好）二十五、誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合技術(shù)原生質(zhì)體融合技術(shù)是將遺傳性狀不同的兩種菌融合為一個新細(xì)胞的技術(shù)。主要步驟包括：原生質(zhì)體準(zhǔn)備、原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體再生和融合子選擇。原生質(zhì)體準(zhǔn)備：酶處理，完全消化或部分消化細(xì)胞壁，釋放原生質(zhì)體；原生質(zhì)體融合和再生：可通過化學(xué)因子誘導(dǎo)或電場誘導(dǎo)進(jìn)行融合，其中化學(xué)誘導(dǎo)常用PEG作為誘導(dǎo)劑，加入PEG后再加入鈣離子、鎂離子等陽性離子；電融合技術(shù)，是將原生質(zhì)體置于電場中極化偶極子，并沿電力線方向排列成串，然后施加直流脈沖擊穿原生質(zhì)體膜，促進(jìn)其融合。誘導(dǎo)融合結(jié)束后，將原生質(zhì)體置于再生培養(yǎng)基上（高滲培養(yǎng)基），使其細(xì)胞壁得以再生。融合子篩選：主要依靠在選擇培養(yǎng)基上的遺傳標(biāo)記，有兩個遺傳標(biāo)記互補(bǔ)，就可以確定融合子。其中一樣缺陷標(biāo)記是常規(guī)而準(zhǔn)確的選擇方法，另外，還有滅火原生質(zhì)法—將融合的親株原生質(zhì)體滅活后融合可獲得具有活性的融合子（可用于沒有遺傳標(biāo)記的情況）；以及熒光染色法—在雙親原生質(zhì)體制備過過程中，向酶解液中加入熒光色素使其形成帶有熒光色素的原生質(zhì)體。二十六、DNAshuffling技術(shù)DNAshuffling是一種人工分子進(jìn)化技術(shù)，可模擬生物的分子進(jìn)化歷程，并可在短的實驗循環(huán)中定向篩選出特定基因編碼的酶蛋白活性提高幾百至上萬倍的功能性突變基因。原理：將來源不同但功能相同的一組同源基因，用DNA核酸酶I進(jìn)行消化產(chǎn)生隨機(jī)小片段，由這些隨機(jī)小片段組成一個文庫，使之互為引物和模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，當(dāng)一個基因拷貝片段作為另一個基因拷貝片段的引物時，會引起模板轉(zhuǎn)換，重組因而產(chǎn)生，導(dǎo)入細(xì)胞后，再選擇正突變體作為新一輪的體外重組。優(yōu)點：篩選效率高，2~3次循環(huán)即可獲得突變體。缺點：主要適合于某一基因產(chǎn)物量的提高，而無法處理多種性狀的改變。二十八、原位研究方法（微生物生態(tài)）原位研究方法，即在自然或模擬自然條件下觀察微生物的結(jié)構(gòu)與功能的研究方法。主要有：原位觀察、微生境模擬技術(shù)原位觀察：激光共聚焦顯微鏡來實現(xiàn)微生物群落的原位觀察；微生境模擬技術(shù)：微生境是直接對微生物產(chǎn)生效應(yīng)的環(huán)境，通過控制生境中環(huán)境因素可模擬微生境和發(fā)生于微生境中理化因子的梯度變化，從而可對微生物的活動進(jìn)一步了解。此外，原位培養(yǎng)是另一種微生境技術(shù)，一般使用瓶子、實驗通等組成圍隔，將要研究的樣品放入原來的位置進(jìn)行培養(yǎng)。重組病毒載體基因工程基因工程的核心內(nèi)容：基因重組、克隆和表達(dá)?；静僮鬟^程：（1）基因的獲取外源基因可從基因文庫或cDNA文庫中分離，或通過化學(xué)合成基因，也可以通過PCR體外擴(kuò)增基因，甚至可以借助定位誘變獲取改造后基因。（2）外源基因與載體體外重組利用DNA重組技術(shù)，將外源基因插入到質(zhì)粒、病毒或染色體DNA片段構(gòu)成的載體中，形成具有自主復(fù)制起點的“重組DNA分子”（3）重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染等方式將重組DNA導(dǎo)入微生物或動植物細(xì)胞中，使其復(fù)制，由此可獲得基因克隆。（4）目的克隆的篩選與鑒定通過載體攜帶的遺傳標(biāo)記等方法篩選出帶有外源基因的陽性克隆，并且在獲得目的克隆基因后還需要進(jìn)行鑒定和測序。（5）控制外源基因的表達(dá)通過控制適當(dāng)條件，使導(dǎo)入的基因在細(xì)胞內(nèi)得到表達(dá)，產(chǎn)生出人們所需要的產(chǎn)物，或使生物體獲得新的性狀。Module2：微生物的生理生化病毒與細(xì)菌的生長規(guī)律：一、病毒復(fù)制（生長）規(guī)律：研究方法-一步生長曲線（one-stepgrowthcurve），基本方法是以適量的病毒接種于高濃度的敏感細(xì)胞中，待病毒充分吸附后，高倍稀釋病毒-細(xì)胞培養(yǎng)物（或以抗病毒血清中和多余未吸附的病毒）以建立同步感染，然后繼續(xù)培養(yǎng)，定時取樣測定培養(yǎng)物中的病毒效價，并以感染時間為橫坐標(biāo)，病毒的效價為縱坐標(biāo)，從而繪制出病毒特征性的繁殖曲線。由圖可知病毒在整個繁殖周期可分為：吸附期—潛伏期（包含隱蔽期）—裂解期—穩(wěn)定期。從病毒的一步生長曲線中可以獲得兩個病毒繁殖的兩個特征性數(shù)據(jù)：潛伏期（latentperiod）—即病毒吸附于細(xì)胞到受感染細(xì)胞釋放子代病毒顆粒所需的最短時間；裂解量（burstsize）—每個細(xì)胞產(chǎn)生的子代病毒顆粒的平均數(shù)目（裂解量=潛伏期受感染細(xì)胞數(shù)/穩(wěn)定期受感染細(xì)胞所釋放的全部子代病毒顆粒數(shù)）。PS：隱蔽期（eclipseperiod），病毒在受體細(xì)胞內(nèi)消失到出現(xiàn)新的感染性病毒的時間。復(fù)制周期：病毒的復(fù)制過程可分為5個階段：吸附-侵入-脫殼-表達(dá)與復(fù)制-裝配與釋放。病毒的侵入機(jī)制：1、完整的病毒通過膜移位方式侵入；2、利用細(xì)胞內(nèi)吞作用侵入，此方法又稱病毒入胞（viropexis）；3、毒粒包膜與細(xì)胞膜發(fā)生融合；4、以抗體依賴性的增強(qiáng)作用，即病毒與亞中和濃度的抗體結(jié)合，形成病毒-抗體免疫復(fù)合物通過細(xì)胞膜表面的免疫球蛋白受體侵入胞內(nèi)。病毒復(fù)制的時序性：即病毒基因組的轉(zhuǎn)錄是分期進(jìn)行的，其中發(fā)生于病毒核酸復(fù)制前的轉(zhuǎn)錄為早期轉(zhuǎn)錄，早期轉(zhuǎn)錄主要是轉(zhuǎn)錄參與病毒核酸復(fù)制、調(diào)節(jié)病毒基因表達(dá)以及改變宿主生物生物分子合成系統(tǒng)的蛋白質(zhì)；而核酸開始復(fù)制或復(fù)制后的轉(zhuǎn)錄稱為晚轉(zhuǎn)錄期，主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生構(gòu)成子代病毒顆粒的結(jié)構(gòu)蛋白。PS：現(xiàn)在已知的病毒受體并非為病毒感特異性單獨表達(dá)的受體，而多數(shù)都為細(xì)胞的特定受體，也可能是細(xì)胞特定受體外的細(xì)胞蛋白。二、細(xì)菌生長規(guī)律：研究方法：在分批培養(yǎng)（batchculture）中以時間為橫坐標(biāo)，細(xì)菌數(shù)量為縱坐標(biāo)，根據(jù)不同時期細(xì)菌數(shù)量的變化所繪制的可反映整個培養(yǎng)期間細(xì)菌數(shù)量變化規(guī)律的曲線，即為生長曲線。由生長曲線可知細(xì)菌群體在整個生長過程中可分為：遲緩期（lagphase）—對數(shù)生長期（logphase）—穩(wěn)定生長期（stationaryphase）—衰亡期（deathphase）。1、遲緩期：是由于細(xì)菌在接觸到一個新環(huán)境時，暫時缺乏足夠的能量和代謝因子，而造成生長繁殖遲緩的現(xiàn)象。但遲緩期對于菌落的生長也是必需的，因為細(xì)胞在分裂復(fù)制前也需要時間對各組分進(jìn)行復(fù)制和裝配。所以在工業(yè)運(yùn)用上可采用一下4中方法來縮短遲緩期：（1）通過遺傳學(xué)方式改變菌種的遺傳特性是遲緩期縮短；（2）采用處于對數(shù)生長期的細(xì)胞最為“種子”；（3）盡量保持接種前后的培養(yǎng)基成分一致；（4）適當(dāng)擴(kuò)大接種量。2、對數(shù)生長期：是細(xì)菌數(shù)量急劇而相對穩(wěn)定增加的時期，這時期的細(xì)菌代謝活性和酶活性高而穩(wěn)定，細(xì)胞大小一致且生活力強(qiáng)，可作為工業(yè)接種的“種子”和實驗研究的理想材料。3、穩(wěn)定生長期：這個時期由于細(xì)菌所處的生長環(huán)境逐步不適宜細(xì)菌生長，所以在這時期細(xì)菌生長速率可降低至0。生長曲線可獲得主要參數(shù)：遲緩時間，比生長速率，總生長量。遲緩時間（T）：微生物生長過程中在實際條件下達(dá)到對數(shù)生長期所需的時間與理想條件（無遲緩期）下達(dá)到對數(shù)生長期時間的差。—客觀反映細(xì)菌生長條件的合適度。總生長量：代表在某一時間內(nèi)，通過培養(yǎng)所獲得的微生物總量與原來接種微生物量之差值?？陀^反映了培養(yǎng)基與生長條件是否適合于細(xì)菌的生長。三、細(xì)菌生長曲線和病毒生長曲線的異同（生長規(guī)律）共同點：1、二者在生長過程中都會經(jīng)過一段個體數(shù)量增長基本為0的時期和個體數(shù)量劇增的增長期，以及個體數(shù)量增長率再次回歸到0的穩(wěn)定期；2、由二者的生長曲線都可以獲得研究對象的：①從接種到個體數(shù)量開始增加所經(jīng)歷的時間參數(shù)；②個體數(shù)量增長的數(shù)量和增長的參數(shù)。不同在于兩者曲線所描繪的相似的生長時期有著本質(zhì)上的區(qū)別：1、細(xì)菌所經(jīng)歷的遲緩期是由于其尚未適應(yīng)新生長環(huán)境而無法進(jìn)行分裂增殖，而病毒則是由于已侵入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制增殖的緣故以至于產(chǎn)生出接種早期數(shù)量未增加的現(xiàn)象；2、細(xì)菌所經(jīng)歷的個體急劇增長的對數(shù)增長期是由于細(xì)菌本生的正在進(jìn)行的分裂增殖所致，而病毒經(jīng)歷的個體數(shù)量急劇增加的時期是由于其裂解宿主細(xì)胞釋放已增殖完畢的子代個體的緣故；3、細(xì)菌之所以進(jìn)入穩(wěn)定期是由于外界營養(yǎng)物質(zhì)消耗過多而無法再維持其數(shù)量繼續(xù)增長，而病毒則是沒有可以寄生的宿主而停止增長；4、細(xì)菌生長過程中有個體數(shù)量減少的衰退期，而病毒沒有。細(xì)菌內(nèi)毒素與外毒素內(nèi)毒素（endotoxins）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖復(fù)合物，一般只有在細(xì)菌死亡或裂解時才會大量釋放出來，此外，內(nèi)毒素隨細(xì)菌屬的不同而產(chǎn)生組分的差異，但它們都是相對穩(wěn)定的分子，無特定組織親和性，所以內(nèi)毒素常會引起非特異性效應(yīng)，如發(fā)熱和血壓驟降。外毒素（exotoxins）是由一些革蘭氏陽性菌和少量革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的分泌性可溶物質(zhì)質(zhì)，大部分為多肽，加熱、紫外線照射等處理后即可使之失活。另外有一些外毒素是酶，如溶血素，一種可溶解紅細(xì)胞的酶；殺白細(xì)胞素、抑白細(xì)胞素，殺死或抑制白細(xì)胞的酶。相比內(nèi)毒素，外毒素更多的具有組織特異性，如肉毒素和破傷風(fēng)毒素等神經(jīng)毒素，是作用于神經(jīng)組織引起神經(jīng)信號傳遞異常的外毒素。微生物的營養(yǎng)類型由于微生物的種類繁多，其營養(yǎng)型也較為復(fù)雜，所以在不同層面和側(cè)重點上對有多種營養(yǎng)型劃分：如以利用碳源的來源，可分為自養(yǎng)型和異養(yǎng)型；以能源來源，可劃分為光能營養(yǎng)型和化能營養(yǎng)型；以電子供體的不同，可劃分為有機(jī)營養(yǎng)型和無機(jī)營養(yǎng)型。所以根據(jù)碳源、能源和電子供體的性質(zhì)不同，我們可以將絕大部分微生物劃分為四種營養(yǎng)類型：光能無機(jī)自養(yǎng)型、光能有機(jī)異養(yǎng)型、化能無機(jī)自養(yǎng)型、化能有機(jī)異養(yǎng)型。1、光能無機(jī)自養(yǎng)型：是以無機(jī)化合物作為電子供體、二氧化碳為主要碳源、光能為能源的一類微生物；（如：藍(lán)細(xì)菌、藻類）2、光能有機(jī)異養(yǎng)型：是以有機(jī)物作為電子供體和主要碳源，以光能作為能源的一類微生物；（如：紅螺細(xì)菌）3、化能無機(jī)自養(yǎng)型：是以無機(jī)化合物作為電子供體，二氧化碳作為主要碳源，無機(jī)物氧化產(chǎn)生的化學(xué)能為能源的一類微生物；（如：硫細(xì)菌、硝化桿菌屬、甲烷桿菌屬等）4、化能有機(jī)異養(yǎng)型：是以有機(jī)物為電子供體和主要碳源，有機(jī)物的氧化的化學(xué)能為能源的一類微生物；（如：芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬）在該類型的微生物中又可根據(jù)所利用的有機(jī)物的性質(zhì)的不同分為腐生型（metarophy）和寄生型（paratrophy）兩類。微生物產(chǎn)能代謝中產(chǎn)生ATP的途徑發(fā)酵中ATP產(chǎn)生途徑：EMP途徑，經(jīng)過EMP途徑后一分子的葡萄糖可產(chǎn)生2分子丙酮酸和2分子ATP；ED途徑，經(jīng)過ED途徑后1分子葡萄糖最后生成2分子丙酮酸、1分子ATP、1分子NADPH和NADH；磷酸解酮酶的HK途徑（明串珠菌異型乳酸發(fā)酵），2分子葡萄糖最后生成3分子乙酸，2分子乳酸、5分子ATP；呼吸作用：有氧呼吸：每一次TCA循環(huán)可產(chǎn)生15分子ATP。（需氧微生物完全氧化一分子葡萄糖可產(chǎn)生38分子ATP）無氧呼吸自養(yǎng)微生物產(chǎn)能途徑：氨氧化，即硝化細(xì)菌將氨氧化成硝酸產(chǎn)生ATP的過程；硫氧化，即硫桿菌氧化多種還原態(tài)的硫化合物產(chǎn)生ATP的過程；鐵氧化，即氧化亞鐵硫桿菌將亞鐵氧化成高價鐵產(chǎn)生ATP的過程；氫氧化，氫細(xì)菌通過催化氫氣離子化，通過電子傳遞系統(tǒng)傳遞電子的過程中驅(qū)動質(zhì)子跨膜運(yùn)輸從而推動ATP合成。其他：底物水平磷酸化，是指物質(zhì)在氧化過程中產(chǎn)生的NADH和FADH2直接將電子傳遞給中間代謝產(chǎn)物從而生成含有高能鍵的化合物，從而直接偶聯(lián)ATP產(chǎn)生的途徑。氧化磷酸化，指的是物質(zhì)在生物氧化過程中形成的NADH和FADH2通過電子傳遞系統(tǒng)將電子傳遞給氧分子會其他氧化物，從而偶聯(lián)ATP產(chǎn)生的途徑。光合磷酸化，是指光合微生物光合色素系統(tǒng)和電子傳遞系統(tǒng)通過吸收光量子產(chǎn)生ATP的途徑。微生物的物質(zhì)運(yùn)輸微生物物質(zhì)運(yùn)輸方式主要有擴(kuò)散、促進(jìn)擴(kuò)散、主動運(yùn)輸和膜泡運(yùn)輸四種，其中主動運(yùn)輸又包含有初級主動運(yùn)輸、次級主動運(yùn)輸、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、Na+，K+-ATP酶系統(tǒng)、基團(tuán)轉(zhuǎn)位和鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)等。1、擴(kuò)散：原生質(zhì)膜是一種半透膜，小分子物質(zhì)可以通過膜兩側(cè)的濃度差實現(xiàn)物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸，但擴(kuò)散并不是微生物細(xì)胞跨膜運(yùn)輸?shù)闹饕绞健?、促進(jìn)擴(kuò)散（facilitateddiffusion）：也是一種被動的物質(zhì)跨膜運(yùn)輸方式，同擴(kuò)散一樣也是通過膜內(nèi)外的物質(zhì)濃度差來作為運(yùn)輸推動力，但與擴(kuò)散不同的是，促進(jìn)擴(kuò)散是通過載體分子來時實現(xiàn)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的，而且每種載體分子都有相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)，具有相對較高的專一性。3、主動運(yùn)輸（activetransport）：是微生物中廣泛存在的一種物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方式，其主要特點是運(yùn)輸過程中需要消耗能量和能夠進(jìn)行逆濃度梯度跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。（1）初級主動運(yùn)輸：指的是由電子傳遞系統(tǒng)、ATP酶等介導(dǎo)的質(zhì)子運(yùn)輸，從運(yùn)輸角度講初級主動運(yùn)輸是一種質(zhì)子的主動運(yùn)輸，通過該運(yùn)輸方式會導(dǎo)致微生物細(xì)胞原生質(zhì)膜內(nèi)外建立起質(zhì)子濃度差，從而使膜處于充能狀態(tài)即能化膜。（2）次級主動運(yùn)輸：該運(yùn)輸方式指的是通過初級運(yùn)輸建立的能化膜在質(zhì)子濃度差消失過程中偶聯(lián)的其他3種運(yùn)輸方式：①同向運(yùn)輸：轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)與質(zhì)子在同一載體中以相同方向運(yùn)輸；②逆向運(yùn)輸：運(yùn)輸物質(zhì)與質(zhì)子在同一載體中按不同方向轉(zhuǎn)運(yùn)；③單向運(yùn)輸：指質(zhì)子濃度消失過程中可促進(jìn)某一特定物質(zhì)通過載體以單一方向進(jìn)出載體，從而造成胞內(nèi)的陽離子累積或陰離子降低。（3）ATP結(jié)合性盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)（ABC）（4）Na+，K+-ATP酶系統(tǒng)：是由Na+，K+-ATP酶通過水解ATP而介導(dǎo)的鈉離子向外運(yùn)輸和鉀離子向內(nèi)運(yùn)送的離子轉(zhuǎn)運(yùn)方式。（5）基團(tuán)轉(zhuǎn)運(yùn)（grouptranslocation）：又稱磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS），是厭氧菌或堿性厭氧菌中通過使糖發(fā)生磷酸化來進(jìn)行糖分子運(yùn)輸?shù)倪\(yùn)輸方式。（6）鐵載體運(yùn)輸：是一種微生物吸收鐵離子的方式，主要通過對外分泌能夠與鐵離子結(jié)合的鐵載體，再鐵離子與載體形成復(fù)合物后再通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)運(yùn)輸至胞內(nèi)。微生物的耐藥性機(jī)制一、微生物產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制：（1）改變細(xì)胞質(zhì)膜通透性，如抗四環(huán)素的委內(nèi)瑞拉鏈霉菌改變了質(zhì)膜的通透性從而阻止了四環(huán)素的進(jìn)入；（2）改變藥物作用靶點，如抗磺胺類藥物的菌株，通過改變了二氫葉酸合成酶的性質(zhì)，從而合成一種對磺胺類藥物不敏感的二氫葉酸合成酶；又如抗鏈霉素的細(xì)菌，通過合成一種與鏈霉素不親和的蛋白來組建30S亞基，來達(dá)到抗鏈霉素的作用；（3）合成修飾抗生素的酶，抗性菌株可通過合成如轉(zhuǎn)乙酰酶、轉(zhuǎn)磷酸酶等來修飾抗生素從而使抗生素失去抗菌活性；（4）產(chǎn)生遺傳變異，發(fā)生變異的菌株導(dǎo)致合成新的多聚體，以取代或部分取代原來的多聚體（如抗青霉素菌株細(xì)胞壁中肽聚糖含量降低，但合成了另外的細(xì)胞壁多聚體從而避開青霉素的作用。）二、降低藥物耐藥性的方法：1、在治療劑量下，持續(xù)使用一種合理的抗生素（抗菌藥物），直到引起疾病的微生物完全消滅；2、使用兩種能發(fā)揮協(xié)同作用的抗生素或抗菌藥物；3、只在絕對需要的時候才使用抗生素等速效抗菌藥物。噬菌體溶源轉(zhuǎn)變?nèi)茉葱赞D(zhuǎn)變（lysogenicconversion）是原噬菌體引起的溶源性細(xì)菌出免疫性以外的其他的表型改變，包括溶源性細(xì)菌細(xì)胞表面性質(zhì)的改變和致病性的改變。原噬菌體誘發(fā)的致病性轉(zhuǎn)變可能是細(xì)菌致病機(jī)制的一個重要方向。（有些細(xì)菌感染引起的毒性來源于其包含的前噬菌體，如白喉桿狀細(xì)菌及肉毒梭菌所攜帶的前噬菌體中具有編碼產(chǎn)生毒素的基因，如果不包含前噬菌體，這些細(xì)菌是不會致病的）ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)ATP結(jié)合性盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)（ATP-bindingcassettetransportersystem，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)），是一種細(xì)菌利用ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)糖類、氨基酸和微生物B12等溶質(zhì)的物質(zhì)運(yùn)輸途徑。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)特點：由兩個疏水性跨膜蛋白域與位于質(zhì)膜內(nèi)表面的兩個核苷酸結(jié)合域組成，兩個疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域在質(zhì)膜上形成一個孔，兩個核苷酸結(jié)合域可以結(jié)合ATP。轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制：ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以與結(jié)合溶質(zhì)的結(jié)合蛋白結(jié)合，當(dāng)溶質(zhì)結(jié)合蛋白攜帶被轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)在質(zhì)膜外表面與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域結(jié)合時，ATP便會與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合蛋白的核苷酸結(jié)合域結(jié)合，進(jìn)而發(fā)生水解產(chǎn)生能量供予跨膜結(jié)構(gòu)域改變構(gòu)象，從而使被轉(zhuǎn)運(yùn)的溶質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。革蘭氏陽性、陰性菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比對革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁的特點是厚度大，化學(xué)組分簡單，一般只含有90%的肽聚糖和不到10%的磷壁酸組成；而革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁則相對較薄，化學(xué)組分復(fù)雜，結(jié)構(gòu)層次多，主要由脂多糖、孔蛋白、磷脂、脂蛋白和肽聚糖共同構(gòu)成。肽聚糖的化學(xué)組成肽聚糖（peptidoglycan）又稱黏肽、胞壁質(zhì)，是真細(xì)菌細(xì)胞壁特有成分。革蘭氏陽性菌：肽聚糖分子主要由肽和聚糖兩部分組成，其中肽有四尾肽和橋肽；聚糖有N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺。兩種聚糖通過β-1,4糖苷鍵構(gòu)成肽聚糖分子的雙糖單位；四尾肽連接在N-乙酰胞壁酸上，是由4種氨基酸分子按L型和D型交替方式連接；肽橋，起著連接前后兩個四尾肽的作用，當(dāng)前所致的肽聚糖已超過100種，其中彼此間的主要區(qū)別在于肽橋的組分上。（金黃色葡萄球菌的肽橋為甘氨酸五肽）革蘭氏陰性菌：結(jié)構(gòu)單體基本與陽性菌相同，但差別在于四尾肽的第三個氨基酸被m-DAP（內(nèi)消旋二氨基庚二酸）所替代；和沒有特殊肽橋連接，僅靠四尾肽的第四個氨基酸和m-DAP相連接。十一、微生物的致病性及感染和疾病區(qū)別細(xì)菌致病性：毒力是指病原菌的致病力的強(qiáng)弱（或病原體造成的疾病的嚴(yán)重程度）。而侵襲力和毒素則構(gòu)成了致病菌毒力的物質(zhì)基礎(chǔ)。其中，侵襲力（invasiveness）是病原菌突破宿主免疫防線并在宿主體內(nèi)定繁殖生長和擴(kuò)散的能力；物質(zhì)基礎(chǔ)有1、病原菌通過具有粘附能力的結(jié)構(gòu)，如革蘭氏陰性菌的菌毛黏附與宿主的呼吸道、消化道等黏膜上皮細(xì)胞的相應(yīng)受體，在局部進(jìn)行繁殖，積聚毒力或繼續(xù)侵入內(nèi)部。2、通過莢膜或微莢膜來抵抗宿主的免疫清除，從而使病原菌在宿主體內(nèi)存活；3、產(chǎn)生侵襲性的酶促進(jìn)感染過程，如致病性葡萄球菌的血漿凝固酶具有的抗吞噬作用等。毒素（toxin），根據(jù)其來源、性質(zhì)和作用不同可分為外毒素和內(nèi)毒素。①外毒素通產(chǎn)為致病菌分泌的可溶性蛋白，毒性極強(qiáng)，具有很強(qiáng)的免疫原性，能作用于全身組織的特定部位，按作用部位的不同可分為神經(jīng)毒素、細(xì)胞毒素和腸毒素三大類。外毒素中毒時，可以通過及時注射根據(jù)其免疫原性制備的抗毒素來降低外毒素造成的傷害作用。②內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁內(nèi)的脂多糖，只有在菌體死亡或裂解的情況下釋放，該類毒素沒有組織特異性，廣泛作用于多種細(xì)胞核體液系統(tǒng)，可引起發(fā)熱和血壓驟降的癥狀，相對外毒素而言其毒性較弱。感染和疾病的區(qū)別： 感染，是指寄生性生物在宿主體表或體內(nèi)生長繁殖而引起的病理過程。如果感染破壞了宿主的生理功能，則會引起疾病。疾病是機(jī)體正常生理功能發(fā)生絮亂時的生理狀態(tài)。感染和疾病都是寄生物與宿主相互作用引起的，但與疾病不同的是感染對宿主本身的影響較小。比如，一位醫(yī)生在給患者換藥時沒有嚴(yán)格采取防護(hù)措施，以至于金黃色葡萄球菌從其手上的小傷侵入其手部，不久傷口周圍就開始發(fā)紅，但這一現(xiàn)象只持續(xù)了一天左右，這種情況極為感染；然而，如果傷口持續(xù)紅腫，幾天后發(fā)展成癤腫，這時候的情況則可稱為疾病。病毒的致病性： 病毒是專性細(xì)胞寄生物，只能在細(xì)胞中生長增殖，且其感染是在基因水平的感染。病毒的致病性主要是因為病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖，從而影響宿主細(xì)胞的正常代謝，其后果可分為3類：（1）殺細(xì)胞感染（cytocidalinfection）：指病毒在宿主細(xì)胞中復(fù)制成熟后，由于子代病毒的大量釋放使宿主細(xì)胞裂解死亡，當(dāng)細(xì)胞死亡到達(dá)一定數(shù)量時就會造成組織明顯損傷，或因裂解產(chǎn)生的毒性物質(zhì)累積到一定程度，機(jī)體就會出現(xiàn)顯性感染癥狀。（2）穩(wěn)定狀態(tài)感染：是指相抵毒力較低的病毒感染宿主后，在相當(dāng)長的一短時間內(nèi)與細(xì)胞共存并繼續(xù)增殖，而這類病毒并不使細(xì)胞溶解死亡，而死常在增殖過程中引起宿主