生物指示劑的選擇省公開(kāi)課一等獎(jiǎng)全國(guó)示范課微課金獎(jiǎng)?wù)n件

序言確保產(chǎn)品無(wú)菌是注射劑產(chǎn)品質(zhì)量確保關(guān)鍵問(wèn)題。在業(yè)界，慣用“無(wú)菌確保水平”（SterilityAssuranceLevel,SAL）概念來(lái)評(píng)價(jià)滅菌（無(wú)菌）工藝效果，SAL定義為產(chǎn)品經(jīng)滅菌/除菌后微生物殘余概率。為了確保注射劑無(wú)菌安全性，國(guó)際上一致要求，采取濕熱滅菌法SAL不得大于10-6，即滅菌后微生物存活概率不得大于百萬(wàn)分之一。微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)（滅菌效力驗(yàn)證）是無(wú)菌藥品生產(chǎn)工藝驗(yàn)證主要步驟，目標(biāo)是證實(shí)滅菌后微生物殘余概率小于10-6。第1頁(yè)法規(guī)要求CHP附錄ⅩⅦ滅菌法中包括生物指示劑相關(guān)要求制備生物指示劑用微生物基本要求：(1)菌種耐受性應(yīng)大于需滅菌產(chǎn)品中全部可能污染菌耐受性。(2)菌種應(yīng)無(wú)致病性。(3)菌株應(yīng)穩(wěn)定。存活期長(zhǎng)，易于保留。(4)易于培養(yǎng)。若使用休眠孢子，生物指示劑中休眠孢子含量要在90％以上。第2頁(yè)法規(guī)要求依據(jù)新版GMP征求意見(jiàn)稿內(nèi)對(duì)生物指示劑說(shuō)明“應(yīng)按供給商要求保留和使用生物指示劑，并經(jīng)過(guò)陽(yáng)性對(duì)照和D值測(cè)試來(lái)確認(rèn)其質(zhì)量”。第3頁(yè)法規(guī)要求《化學(xué)藥品注射劑和多組分生化藥注射劑基本技術(shù)要求》中提到“微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)所用生物指示劑耐熱性及數(shù)量應(yīng)對(duì)滅菌工藝組成必要挑戰(zhàn)，生物指示劑耐熱性應(yīng)大于產(chǎn)品中常見(jiàn)污染菌耐熱性。采取過(guò)分殺滅法（F0≥12）滅菌工藝，可不進(jìn)行微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)?！钡?頁(yè)法規(guī)要求CHP附錄ⅩⅦ滅菌法中包括生物指示劑相關(guān)要求生物指示劑應(yīng)用：在生物指示劑驗(yàn)證試驗(yàn)中，需確定孢子在實(shí)際滅菌條件下D值，并測(cè)定孢子純度和數(shù)量。驗(yàn)證時(shí)，生物指示劑微生物用量應(yīng)比日常檢出微生物污染量大，耐受性強(qiáng)，以確保滅菌程序有更大安全性。第5頁(yè)推薦使用生物指示劑03版驗(yàn)證指南中列出濕熱滅菌工藝中慣用生物指示劑菌種名稱(chēng)常規(guī)D121℃值/min嗜熱脂肪芽孢桿菌1.5～3.0枯草芽孢桿菌0.3～0.7凝結(jié)芽孢桿菌0.4～0.8梭狀芽孢桿菌0.4～0.8CHP版中列出濕熱滅菌工藝中慣用生物指示劑嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子(如NCTC10007、NCIMB8157、ATCC7953)。D值為1.5～3.0min，每片(或每瓶)活孢子數(shù)5×105～5×106

個(gè)，在121℃、19min下應(yīng)被完全殺滅。另外，還可使用生孢梭菌孢子（如NCTC8594、NCIMB8053、ATCC7955)，D值為0.4～0.8min。第6頁(yè)生物指示劑菌種選擇08年年度回顧，車(chē)間潔凈區(qū)最耐熱菌株D100℃值為14.2，09年年度回顧，車(chē)間潔凈區(qū)最耐熱菌株D100℃值為16.7。連續(xù)兩年，車(chē)間潔凈區(qū)最耐熱菌株D100℃值最高為16.7，換算成D121℃約為0.12。所以，我們應(yīng)該選擇D121℃值比0.12大菌株。因?yàn)榫闐值受介質(zhì)影響，所以，我們需要測(cè)定在各介質(zhì)中實(shí)際D值，確保生物指示劑適合我們企業(yè)使用。第7頁(yè)生物指示劑菌液濃度計(jì)算（陰性分?jǐn)?shù)法）假設(shè)F0=8，用D121℃=0.7枯草芽孢桿菌計(jì)算：SLRbi=F0/Dbi=11.43（SLR為孢子對(duì)數(shù)下降值）SLRbi=lgN0-lgN（N0和N分別為滅菌前后孢子數(shù)）依據(jù)陰性分?jǐn)?shù)法，N=2.303×lg(n/q)，其中n為挑戰(zhàn)性試驗(yàn)樣品總數(shù)，q為試驗(yàn)結(jié)果呈陰性瓶數(shù)。如試驗(yàn)結(jié)果20瓶挑戰(zhàn)瓶均呈陰性，在計(jì)算時(shí)可假設(shè)只有19只瓶呈陰性（因?yàn)閝=n，lg(n/q)=0，代入公式SLRbi=lgN0-lgN時(shí)，數(shù)學(xué)式無(wú)意義），則可得出：N=2.303×lg(n/q)=0.0513lgN=-1.29lgN0=SLRbi+lgN=11.43-1.29=10.14N0=1010.14=1.4×1010(cfu/瓶)第8頁(yè)生物指示劑菌液濃度計(jì)算（殘余曲線(xiàn)法）假設(shè)F0=8，用D121℃=0.7枯草芽孢桿菌計(jì)算：F0/Dbi=lgN0+1=11.43lgN0=10.43N0=1010.43=2.7×1010(cfu/瓶)第9頁(yè)生物指示劑菌液濃度計(jì)算經(jīng)過(guò)以上2種方法計(jì)算得出，用孢子濃度為1010(cfu/瓶)D121℃=0.7枯草芽孢桿菌樣品來(lái)驗(yàn)證，滅菌后樣品為無(wú)菌，說(shuō)明滅菌條件到達(dá)F0值大于等于8。第10頁(yè)無(wú)菌確保水平計(jì)算SLRS=SLRbi×Dbi/DS=66.68（SLRbi為生物指示劑孢子對(duì)數(shù)下降值，SLRS為滅菌前產(chǎn)品中污染微生物對(duì)數(shù)下降值）SLRS=lgN0-lgN車(chē)間中控微生物標(biāo)準(zhǔn)為＜10cfu/瓶，所以假設(shè)N0為10。lgN=lgN0-SLRS=1-66.68=-65.68N=10-65.68，無(wú)菌確保度為10-65.68，遠(yuǎn)大于要求10-6第11頁(yè)生物指示劑菌液濃度計(jì)算若選取D值更高嗜熱脂肪芽孢桿菌計(jì)算：(D121℃=1.6)陰性分?jǐn)?shù)法：lgN0=SLRbi+lgN=F0/Dbi-1.29=8/1.6-1.29=3.17N0=103.17=1.5×103(cfu/瓶)殘余曲線(xiàn)法：F0/Dbi=lgN0+1=5lgN0=4N0=104(cfu/瓶)無(wú)菌確保水平計(jì)算：SLRS=SLRbi×Dbi/DS=66.66lgN=lgN0-SLRS=1-66.66=-65.66N=10-65.68，無(wú)菌確保度為10