反相高效液相色譜中流動相選擇與優(yōu)化的研究進展

反相高效液相色譜中流動相選擇與優(yōu)化的研究進展1.本文概述近年來，反相高效液相色譜（ReversePhaseHighPerformanceLiquidChromatography,RPHPLC）在藥物分析、環(huán)境監(jiān)測、食品檢測、生物大分子研究等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，其中流動相的選擇與優(yōu)化成為了決定分析效率、分離度和靈敏度的關(guān)鍵步驟。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，關(guān)于流動相選擇與優(yōu)化的研究不斷深入，旨在實現(xiàn)更精確的樣品分離和更短的方法開發(fā)周期。本文綜述了反相高效液相色譜中流動相選擇與優(yōu)化的研究進展，著重探討了流動相成分（如有機溶劑、水及添加劑）、pH調(diào)控、離子強度調(diào)節(jié)以及溫度等因素對色譜行為的影響。從初始條件的快速設(shè)定策略，到基于目標化合物特性和色譜柱性質(zhì)的精細化調(diào)整方法，均有詳盡闡述。文章還總結(jié)了現(xiàn)代色譜技術(shù)中采用的新穎流動相系統(tǒng)和智能化優(yōu)化算法，這些創(chuàng)新手段對于解決復(fù)雜混合物的分離難題具有重要意義。通過系統(tǒng)梳理相關(guān)研究成果，本文旨在為色譜工作者提供一套科學(xué)、實用的流動相選擇與優(yōu)化指南，進而推動高效液相色譜技術(shù)在不同領(lǐng)域中的應(yīng)用水平提升。2.流動相組成及其影響因素在反相高效液相色譜（RPHPLC）中，流動相的選擇與優(yōu)化是實現(xiàn)有效分離和準確定量目標化合物的關(guān)鍵步驟。流動相通常由兩種或多種溶劑按照一定比例混合而成，其組成主要包括水和不同極性的有機溶劑，例如甲醇、乙腈、丙酮或異丙醇等。在反相條件下，固定相通常是疏水性的鍵合硅膠，而樣品中的極性或離子化組分則通過與流動相相互作用而在色譜柱上保留或洗脫。極性：流動相的極性直接影響樣品在色譜柱上的保留行為。極性較小的有機溶劑作為強溶劑，能夠減少樣品與固定相之間的相互作用力，從而縮短保留時間反之，增加水或其他極性添加劑的比例會增強樣品的保留。pH值：對于帶電或可離子化的化合物，在流動相中調(diào)整pH值至關(guān)重要，因為它會影響化合物的電荷狀態(tài)，進而改變其在反相介質(zhì)上的分配系數(shù)和選擇性。添加劑：為了改善某些特定組分的溶解度或選擇性，流動相中常添加離子對試劑、緩沖鹽或改性劑，這些添加劑有助于提高分離效果，特別是對于極性強、不易溶于常規(guī)流動相的樣品。粘度：流動相的粘度對系統(tǒng)的傳質(zhì)效率有直接影響。較低粘度的流動相應(yīng)能加快流速并提高分離效率，但過低的粘度可能會降低柱效。溶劑強度梯度：在梯度洗脫中，流動相的組成隨時間變化，通過逐漸改變強溶劑與弱溶劑的比例來實現(xiàn)不同保留性質(zhì)化合物的連續(xù)洗脫。溶劑與檢測器的兼容性：流動相須與所使用的檢測器兼容，例如紫外可見光檢測器要求流動相在檢測波長下無明顯吸收，熒光檢測器需要避免熒光猝滅效應(yīng)等。流動相的選擇與優(yōu)化是一個綜合考慮各種化學(xué)和物理因素的過程，需要根據(jù)待測樣品的具體性質(zhì)以及實驗?zāi)康倪M行細致調(diào)試與優(yōu)化。隨著技術(shù)的發(fā)展，科研人員不斷探索新的流動相體系和優(yōu)化策略，旨在提升反相高效液相色譜在復(fù)雜樣品分析中的性能表現(xiàn)。3.流動相選擇的基本原則與方法反相高效液相色譜（ReversePhaseHighPerformanceLiquidChromatography,RPHPLC）的成功分離與分析在很大程度上依賴于流動相的合理選擇與優(yōu)化。流動相在色譜過程中扮演著關(guān)鍵角色，它決定了樣品中各組分在固定相上的保留行為以及分離效率。以下是流動相選擇與優(yōu)化的一些基本原則和方法：在RPHPLC中，固定相通常是經(jīng)過疏水化學(xué)修飾的硅膠顆粒，如十八烷基鍵合硅膠，具有非極性特性。與此相反，流動相則包含至少一種極性成分，最常見的是水或者含水的緩沖溶液，配合有機溶劑如甲醇、乙腈等。流動相的極性大小對樣品中各組分的洗脫順序起決定性作用，極性越大的流動相洗脫能力越強，反之則越弱。在實踐中，流動相的選擇常常遵循“由強到弱”的步驟，并利用“三倍規(guī)則”進行初步優(yōu)化。這意味著如果有機溶劑（如乙腈或甲醇）在流動相中的比例每減少大約10，相應(yīng)的組分保留因子可能增加約3倍。這種方法允許快速初步設(shè)定流動相比例，然后再根據(jù)目標組分的出峰情況進行精細化調(diào)整。對于含水流動相，pH值的調(diào)控和加入適當?shù)木彌_鹽以控制離子強度也是重要的選擇依據(jù)，特別是在處理離子型化合物時，確保樣品在適宜的電荷狀態(tài)下被有效分離。選擇低粘度的流動相有利于降低系統(tǒng)壓力，提高流速，進而提升分析速度和分離效率。比如，乙腈和甲醇由于其較低的粘度和較高的溶解能力，常作為首選有機溶劑?，F(xiàn)代RPHPLC技術(shù)廣泛采用梯度洗脫策略，通過在分析過程中逐步改變流動相組成，從而實現(xiàn)復(fù)雜樣品中多種組分的有效分離。流動相梯度的設(shè)計可以是線性的、二次曲線或其他形式的臺階梯度，具體取決于樣品組分的特性和分離需求。流動相還需考慮與檢測器（如紫外吸收檢測器、熒光檢測器、質(zhì)譜檢測器等）的兼容性，確保在選定波長下沒有顯著的背景信號干擾，同時滿足檢測器對溶劑類型和截止波長的要求。反相高效液相色譜中流動相的選擇是一個綜合權(quán)衡的過程，涉及溶劑極性、pH值、離子強度、粘度、梯度設(shè)計以及檢測器匹配等多個因素。隨著科技的發(fā)展，針對不同樣品的復(fù)雜性及分析目的，科研人員不斷探索和實踐更精確高效的流動相優(yōu)化策略，推動了RPHPLC技術(shù)在分析化學(xué)領(lǐng)域的持續(xù)進步。4.流動相優(yōu)化技術(shù)的新進展隨著分析化學(xué)和材料科學(xué)的快速發(fā)展，反相高效液相色譜中的流動相優(yōu)化技術(shù)也在不斷突破傳統(tǒng)框架，取得了顯著的進步。在過去的數(shù)年間，研究者們致力于探索新型混合溶劑系統(tǒng)、智能調(diào)控技術(shù)和計算機輔助優(yōu)化方法，以提升復(fù)雜樣品尤其是生物大分子和藥物代謝產(chǎn)物等的分離效能和重現(xiàn)性。一方面，新型混合溶劑配方得到廣泛應(yīng)用，例如綠色溶劑和離子液體被整合到傳統(tǒng)的水有機溶劑體系中，以改善分離選擇性和減少環(huán)境影響。通過精確調(diào)控這些溶劑的比例以及pH值、鹽濃度等附加條件，可以實現(xiàn)對目標組分的精細化洗脫控制。另一方面，動態(tài)或自適應(yīng)流動相梯度技術(shù)成為熱點。這類技術(shù)能夠?qū)崟r監(jiān)測并自動調(diào)整洗脫梯度，尤其在處理復(fù)雜樣品時，可根據(jù)實時色譜信號反饋動態(tài)優(yōu)化分離過程，顯著提高分析效率和準確性。借助現(xiàn)代計算手段，如基于機器學(xué)習(xí)和人工智能算法的軟件平臺也開始在流動相優(yōu)化上展現(xiàn)潛力。通過對大量已知數(shù)據(jù)的學(xué)習(xí)和預(yù)測，這些工具能夠更快速準確地篩選出理想的流動相組合，縮短了實驗周期，降低了方法開發(fā)的成本。納米流體和超臨界流體等前沿領(lǐng)域的研究成果也為反相高效液相色譜流動相的優(yōu)化提供了新的思路。這些新興技術(shù)不僅拓寬了流動相的物理狀態(tài)邊界，還可能引發(fā)色譜理論與實踐的革新，有望在未來引領(lǐng)色譜學(xué)發(fā)展進入新的階段。流動相優(yōu)化技術(shù)的新進展在不斷提升反相高效液相色譜性能的同時，也正在逐步改變分析化學(xué)家們對于復(fù)雜樣品分離與測定的傳統(tǒng)策略，推動著色譜科學(xué)朝著更加智能化、精準化的方向邁進。5.典型實例分析在反相高效液相色譜（ReversePhaseHighPerformanceLiquidChromatography,RPHPLC）方法開發(fā)與優(yōu)化過程中，流動相的選擇至關(guān)重要，能夠直接影響到目標化合物的保留行為、分離度以及檢測靈敏度。以下是一些具有代表性的研究案例：賈濤等人在對左炔諾孕酮純度檢測中遇到了挑戰(zhàn)，起初使用甲醇水（6535）作為流動相時，發(fā)現(xiàn)樣品中的雜質(zhì)無法有效分離。針對這一問題，研究團隊調(diào)整策略，改用乙腈替代甲醇，結(jié)果顯示乙腈水體系能顯著提高左炔諾孕酮與其他雜質(zhì)之間的分離度，同時使主峰出峰時間適宜，從而優(yōu)化了檢測方法的可靠性與準確性。在一項關(guān)于復(fù)雜天然產(chǎn)物分離的研究中，研究人員面對的是多種極性和非極性組分共存的情況。他們首先采用傳統(tǒng)的水甲醇體系，但發(fā)現(xiàn)某些極性組分洗脫過早，而另一些非極性組分則保留過于強烈。通過逐步引入離子對試劑并調(diào)整甲醇與水的比例，以及加入少量的醋酸以調(diào)節(jié)pH值，最終成功優(yōu)化了流動相配方，實現(xiàn)了所有組分的有效分離和定量測定。針對某新型藥物分子的穩(wěn)定性研究，研究小組在初期采用的是典型的反相流動相——含一定比例乙腈的水溶液。在長期穩(wěn)定試驗后，藥物降解產(chǎn)物顯示出與母體化合物相近的保留行為，導(dǎo)致難以區(qū)分。為此，他們在流動相中引入了添加劑如十二烷基硫酸鈉（SDS）以增加離子相互作用，優(yōu)化后的流動相成功分離了母體藥物與降解產(chǎn)物，極大地提高了方法的分辨能力。這些實例充分體現(xiàn)了反相高效液相色譜中流動相選擇與優(yōu)化的靈活性和針對性。針對不同的樣品特性，通過對流動相極性、離子強度、pH值以及添加劑的精細6.展望與挑戰(zhàn)隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進步，反相高效液相色譜（RPHPLC）在分析化學(xué)、藥物研發(fā)及質(zhì)量控制等領(lǐng)域展現(xiàn)出持續(xù)增長的重要性。在流動相的選擇與優(yōu)化方面，盡管已取得顯著成就，但仍存在諸多挑戰(zhàn)與待開發(fā)的空間。展望未來，RPHPLC流動相研究的主要趨勢將集中在以下幾個方面：綠色環(huán)保理念推動著新型環(huán)保型溶劑體系的研發(fā)，減少有機溶劑對環(huán)境的影響，同時保持甚至提升分離效能智能化與自動化技術(shù)的發(fā)展有望實現(xiàn)流動相組成的動態(tài)調(diào)控與實時優(yōu)化，從而提高方法的通用性和適應(yīng)性再者，針對復(fù)雜樣品尤其是大分子生物藥物的分析需求，探索新型極性修飾填料及配套流動相系統(tǒng)將是關(guān)鍵突破點。與此同時，面臨的主要挑戰(zhàn)包括：如何精準預(yù)測并設(shè)計出適用于特定目標物的最佳流動相組合，這要求深入理解溶質(zhì)固定相和溶質(zhì)流動相間相互作用的本質(zhì)發(fā)展高穩(wěn)定、高選擇性且耐久性好的新型固定相材料，以應(yīng)對多元、苛刻條件下的分離難題流動相梯度洗脫程序的精細化設(shè)計與精確執(zhí)行也是亟待攻克的技術(shù)壁壘。盡管反相高效液相色譜法在流動相選擇與優(yōu)化領(lǐng)域已積累了豐富的實踐經(jīng)驗，但未來仍需緊密結(jié)合新材料科學(xué)、信息技術(shù)及綠色化學(xué)等多學(xué)科前沿成果，以期實現(xiàn)更高效、更智能、更環(huán)保的分離分析手段，滿足日益復(fù)雜的分析需求和不斷提升的科學(xué)標準。參考資料：反相高效液相色譜是由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，它正好與由極性固定相和弱極性流動相所組成的液相色譜體系（正相色譜）相反。RP-HPLC的典型的固定相是十八烷基鍵合硅膠，典型的流動相是甲醇和乙腈。RP-HPLC是當今液相色譜的最主要的分離模式，幾乎可用于所有能溶于極性或弱極性溶劑中的有機物的分離。反相色譜法適于分離非極性、極性或離子型化合物，大部分的分析任務(wù)皆由反相色譜法完成。反相高效液相色譜是由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，它正好與由極性固定相和弱極性流動相所組成的液相色譜體系（正相色譜）相反。RP-HPLC的典型的固定相是十八烷基鍵合硅膠，典型的流動相是甲醇和乙腈。RP-HPLC是當今液相色譜的最主要的分離模式，幾乎可用于所有能溶于極性或弱極性溶劑中的有機物的分離。反相色譜法適于分離非極性、極性或離子型化合物，大部分的分析任務(wù)皆由反相色譜法完成。反相高效液相色譜是化學(xué)鍵合相色譜法的一種?；瘜W(xué)鍵合相色譜法是由液液色譜法發(fā)展起來的，是為了解決在分離過程中，機械吸附在載體上的固體液的流失問題而發(fā)展出來的一種新方法。鍵合相色譜法通過將不同的有機官能團通過化學(xué)反應(yīng)共價鍵合到硅膠載體表面的游離烴基上，而生成化學(xué)鍵合固定相，化學(xué)鍵合固定相對各種極性溶劑都有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。由它制備的色譜主柱效高、使用壽命長、重現(xiàn)性好，幾乎對各種類型的有機化合物都呈現(xiàn)良好的選擇性，并可用于梯度洗脫操作，消除了分配色譜法的缺點。根據(jù)鍵合固定相和流動相相對極性的強弱，可將鍵合色譜法分為正相鍵合色譜法和反相鍵合色譜法。反相鍵合色譜法即反相高效液相色譜。在正相鍵合色譜法中，鍵合固定相的極性大于流動相的極性，適用于分離油溶性或水溶性的極性和強極性化合物。在反相鍵合相色譜法中，鍵合固定相的極性小于流動相的極性適用于分離非極性、極性或離子型化合物，其應(yīng)用范圍也比正相鍵合相色譜法更廣泛。在反相鍵合相色譜法中使用的是非極性鍵合固定相。它是將全多孔（或薄殼）微粒硅膠載體，經(jīng)酸活化處理后與含烴基鏈(CCC18)或苯基的硅烷化試劑反應(yīng)，生成表面具有烷基或苯基的非極性固定相。如共價結(jié)合到載體上的直鏈碳氫化合物正辛基等。關(guān)于反相色譜的分離機理，吸附色譜的作用機制認為溶質(zhì)在固定相上的保留主要是疏水作用，在高效液相色譜中又被稱為疏溶劑作用。根據(jù)疏溶劑理論，當溶質(zhì)分子進入極性流動相后，即占據(jù)流動相中相應(yīng)的空間，而排擠一部分溶劑分子。當溶質(zhì)分子被流動相推動與固定相接觸時，溶質(zhì)分子的非極性部分或非極性因子會將非極性固定相上附著的溶劑膜排擠開，而直接與非極性固定相上的烷基官能團相結(jié)合（吸附）形成締合絡(luò)合物，構(gòu)成單分子吸附層。這種疏溶劑的吸附作用是可逆的，當流動相極性減少時，這種疏溶劑斥力下降，會發(fā)生解締，并將溶質(zhì)分子解放而被洗脫下來。烷基鍵合固定相對每種溶質(zhì)分子締合作用和解締作用能力之差，就決定了溶質(zhì)分子在色譜過程的保留值。以下簡述影響溶質(zhì)保留值的三個因素:在反相鍵合相色譜法中，溶質(zhì)的分離是以它們的疏水結(jié)構(gòu)差異為依據(jù)的，溶質(zhì)的極性越弱，疏水性也強，保留值越大。根據(jù)疏溶劑理論，溶質(zhì)的保留值與其分子中非極性部分的總表面積有關(guān)，其與烷基鍵合固定相結(jié)出的面積越大，保留值越大。烷基鍵合固定相的作用在于提供非極性作用表面，因此鍵合到硅膠表面的烷基數(shù)量就決定著溶質(zhì)容量因子的大小。烷基的疏水特性隨碳鏈的加長而增加，溶質(zhì)的保留值也隨著烷基碳鏈長度的增加而增大。隨著烷基碳鏈的增長,增加了鍵合相的非極性作用的表面積，其不僅影響溶質(zhì)的保留值，還影響色譜柱的選擇性，即隨烷基碳鏈的加長其對溶質(zhì)分離的選擇性也增大。流動相的表面張力愈大，介電常數(shù)愈大，其極性越強，此時溶質(zhì)與烷基鍵合相得締合能力越強，流動相的洗脫強度弱，導(dǎo)致溶質(zhì)的保留值越大。隨著技術(shù)的不斷改進，反相高效液相色譜法獲得日益廣泛的應(yīng)用,在高效液相色譜法中也占有重要的地位。自冬梅等人提出了一種利用反相高效液相色譜法分析米根霉乳酸發(fā)酵液中有機酸的方法。應(yīng)用反相認值kosil一11SC18RS色譜柱，以01mol/L磷酸(pH=5)作為流動相，發(fā)酵液經(jīng)稀硫酸預(yù)處理后直接進樣分離定量，在10min內(nèi)把其中的乳酸、蘋果酸、富馬酸等完全分離定量，各種酸回收率大于97%。其實驗結(jié)果證明，該方法能將米根霉乳酸發(fā)酵液中乳酸、蘋果酸和富馬酸完全分離并準確定量。本方法具有前處理簡單、干擾小、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點，對于及時測定乳酸發(fā)酵過程的變化具有重要意義，是測定乳酸發(fā)酵液中各有機酸的快速、有效的定量測定方法。高效液相色譜在藥物代謝動力學(xué)上的研究主要是為藥物代謝動力學(xué)軟件提供數(shù)據(jù)，并最終通過藥代動力學(xué)軟件處理得到藥物動力學(xué)結(jié)果。其中動力學(xué)參數(shù)主要集中在：吸收半衰期(tl/2。)、消除半衰期(t1126)、達峰時(tma)、最大血藥濃度(Cmax)、曲線下面積AUC、消除率CIB、表觀分布容積Vd等。通過這些動力學(xué)參數(shù)對藥物代謝動力學(xué)進行研究，并通過這種方法對藥物對機體的作用情況進行比較，有利的指導(dǎo)藥物的開發(fā)和研制，在這個方向的研究可能是高效液相色譜與藥代動力學(xué)軟件聯(lián)用分析的發(fā)展方向。黃酒作為一種具有悠久歷史的傳統(tǒng)飲品，其獨特的釀造工藝和豐富的口感深受人們的喜愛。黃酒中的有機酸含量對其口感、品質(zhì)和保存期等方面具有重要影響。準確測定黃酒中的有機酸含量對于黃酒的生產(chǎn)、質(zhì)量控制和科學(xué)研究具有重要意義。本文將介紹使用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定黃酒中有機酸含量的方法。黃酒樣品：選擇不同產(chǎn)地、不同年份的黃酒樣品，以評估RP-HPLC法在不同樣品中的應(yīng)用范圍。高效液相色譜儀（配備紫外檢測器）：用于分離和檢測黃酒中的有機酸。樣品處理：取一定量的黃酒樣品，用45μm濾膜過濾，然后與適當濃度的有機酸標準品混合。色譜條件：色譜柱為C18柱，流動相為01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=5）-甲醇（80:20），流速為0mL/min，檢測波長為210nm。通過RP-HPLC法，我們可以得到黃酒中各有機酸的色譜圖。通過對比標準品的色譜圖，可以確定黃酒中各有機酸的種類和含量。為了評估本方法的準確性和可靠性，我們進行了精密度和回收率實驗。通過多次重復(fù)實驗，計算各有機酸的相對標準偏差（RSD）和回收率。結(jié)果表明，本方法的精密度和回收率均較好，能夠滿足實際應(yīng)用的需求。本方法適用于測定黃酒中常見的有機酸，如草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸等。通過調(diào)整流動相的比例和pH值，還可以用于測定其他類型的有機酸。本方法還可以應(yīng)用于其他發(fā)酵食品和飲料中有機酸的測定。本文介紹了一種使用反相高效液相色譜法測定黃酒中有機酸含量的方法。該方法具有較高的精密度和回收率，能夠準確測定黃酒中常見的有機酸。通過本方法的應(yīng)用，可以更好地了解黃酒中有機酸的組成和含量，為黃酒的生產(chǎn)、質(zhì)量控制和科學(xué)研究提供有力支持。反相液相色譜柱效高、分離能力強、保留機理清楚，是液相色譜分離模式中使用最為廣泛的一種，對于生物大分子、蛋白質(zhì)及酶的分離分析，反相液相色譜正受到越來越多的關(guān)注．在分配色譜中，組分在色譜柱上的保留程度，取決于它們在固定相和流動相之間的分配系數(shù)，組分在固定相上的保留時間越長，固定相與流動相之間的極性差值越大。而流動相為極性，固定相為非極性的液相色譜就是反相液相色譜。反相色譜法是以表面非極性載體為固定相，以比固定相極性強的溶劑為流動相的一種液相色譜分離模式．反相色譜固定相大多是硅膠表面鍵合疏水基團，基于樣品中的不同組分和疏水基團之間疏水作用的不同而分離．在生物大分子分離中，多采用離子強度較低的酸性水溶液，添加一定量乙腈、異內(nèi)醇或甲醇等與水互溶的有機溶劑作流動相．普通的反相色譜固定相和孔徑大于300Å的硅膠鍵合烷基固定相應(yīng)用較為普遍，聚合物基質(zhì)的反相色譜固定相也有較多應(yīng)用．反相色譜中樣品的保留值主要由固定相比表面積、鍵合相種類和濃度決定，保留值通常隨鏈長增長或鍵合相的疏水性增強而增大，對于非極性化合物通常遵循以下規(guī)則：(弱)非鍵合硅膠＜＜氰基＜C1(TMS)＜C3＜C4＜苯基＜C8≈C18(強)．溶質(zhì)保留值與固定相表面積成正比，普通載體(80Å)的表面積約為250m2/g，而300Å孔徑載體的比表面積約為60m2/g。當其他條件相同時，溶質(zhì)在300Å孔徑(低表面積)色譜柱上的保留值大約為80Å孔徑色譜柱上保留值的1/4(60：250)，小孔隙柱如高保留的C18柱或石墨碳柱有利于強親水性樣品洗脫．樣品的保留值也可以通過改變流動相組成或溶劑強度來調(diào)整，溶劑強度取決于有機溶劑的性質(zhì)和其在流動相中的濃度．在反相色譜中，采用高溶劑強度、低極性的流動相時可獲得較低保留值．固定相的不同也可以導(dǎo)致選擇性發(fā)生變化，氰基、苯基、CC18等柱的選擇性有很大差異，一般應(yīng)優(yōu)先考慮CC18柱，然后是氰基柱，再次是苯基柱．反相條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)由于低PH、有機溶劑存在、溫度高于室溫和疏水鍵合相等綜合原因發(fā)生變性，這些化合物可能以兩種或兩種以上獨立或動態(tài)平衡的形式存在，它們通過色譜柱的保留速度不同，導(dǎo)致譜峰展寬、變形、甚至出現(xiàn)單一蛋白有多個峰的現(xiàn)象，部分變性也易使蛋白在柱上聚集，造成被洗脫蛋白的回收率低和鬼峰．反相色譜固定相表面烷基鏈長度對蛋白質(zhì)的反相保留和蛋白質(zhì)的活性回收有很大差異，烷基鏈越長(CCC30)，固定相疏水性越強，為使蛋白質(zhì)等生物分子洗脫，流動相合機溶劑的含量較高，疏水性過強，會導(dǎo)致生物分子的不可逆吸附和生物活性損失，因此短鏈烷基固定相(CC苯基等)在生物大分子分離中表現(xiàn)出優(yōu)勢。對多數(shù)小蛋白，在低pH乙腈/水梯度下，用C3~C8色譜柱分離，使蛋白完全展開并避免聚集或沉淀，能夠得到理想的分離結(jié)果．在低pH流動相條件下進行分離，如1%TFA適合于大多數(shù)樣品，10~25mmol/L磷酸對疏水性強的蛋白質(zhì)更有利；以乙腈作有機溶劑，丙醇可能對疏水性強的蛋白質(zhì)有利；柱溫50~80℃；將樣品溶于6mol/L尿素或鹽