2013-5-檸檬酸循環(huán)-1課件

Chapter23檸檬酸循環(huán)CitricAcidCycle(TricarboxylicAcidCycle)TCASelectedtopicsinthehistoryofbiochemistry:personalrecollections,IX.

作者：GiorgioSemenza,AnthonyJohnTurner

（Krebs循環(huán)）早期發(fā)現(xiàn):

檸檬酸、琥珀酸、延胡索酸等能迅速被肝、腎切片氧化上述二羧酸能增加鴿胸肌懸液攝取氧，其程度遠(yuǎn)較本身氧化時所需氧為多？

它們對鴿胸肌的氧化營養(yǎng)物起著催化作用。

檸檬酸可經(jīng)異檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?酮戊二酸

α-酮戊二酸可轉(zhuǎn)變?yōu)殓晁岜崾晴晁崦摎涿傅母偁幮砸种莆铮瑢?dǎo)致琥珀酸不能脫氫氧化成為延胡索酸。在加有丙二酸的肌肉勻漿中加入檸檬酸，可引起琥珀酸的堆積。

Krebs發(fā)現(xiàn)草酰乙酸加入肌肉組織，可迅速與來自丙酮酸或加入的乙酸合成檸檬酸，

三羧酸循環(huán)的學(xué)說。Born25August1900)

Hildesheim,GermanyDied22November1981(aged

81)

Oxford,England

CitizenshipUnitedKingdomNationalityGermanyFieldsInternalmedicine,biochemistryInstitutionsKaiserWilhelmInstituteforBiology

UniversityofHamburg

CambridgeUniversity

UniversityofSheffield

UniversityofOxfordKnown

fordiscoveryoftheureacycleandthecitricacidcycleNotableawardsNobelPrizeinPhysiologyorMedicine(1953)Dr.HansKrebs一.檸檬酸循環(huán)的準(zhǔn)備過程二.檸檬酸循環(huán)反應(yīng)機(jī)制三.檸檬酸循環(huán)的調(diào)控四.檸檬酸循環(huán)的生物學(xué)意義因?yàn)樵谘h(huán)的一系列反應(yīng)中,關(guān)鍵的化合物是檸檬酸,所以稱為檸檬酸循環(huán),又因?yàn)樗腥齻€羧基,所以亦稱為三羧酸循環(huán),簡稱TCA循環(huán)。由于它是由H.A.Krebs（德國）正式提出的，所以又稱Krebs循環(huán)。C6H12O6+6O26CO2+6H2O+30/32ATP檸檬酸循環(huán)：在有氧的情況下，葡萄糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸跨越線粒體膜時氧化脫羧形成乙酰CoA，在線粒體基質(zhì)中乙酰CoA經(jīng)一系列氧化、脫羧、水合及脫氫等，最終生成CO2和還原型遞氫體，后者進(jìn)入氧化呼吸鏈生成H2O并產(chǎn)生能量的過程.葡萄糖有氧氧化總反應(yīng)：葡萄糖酵解丙酮酸氧化脫羧檸檬酸循環(huán)TAC循環(huán)

G（Gn）丙酮酸乙酰CoA

CO23NADH+H+1FADH2H2O

[O]ATPADP胞液

線粒體

糖的有氧氧化代謝途徑（三階段）線粒體膜氧化呼吸鏈GTP（ATP）C3C2C6C5C4CO2CO2…..NADH+H+NADH+H+

FADH2C架變化與遞氫NADH跨線粒體膜CO2丙酮酸進(jìn)入線粒體反應(yīng)概況ATP進(jìn)入循環(huán)2次脫羧1次直接產(chǎn)能（2種遞氫體）4次脫氫４CNADH+H+一.檸檬酸循環(huán)的準(zhǔn)備過程

——丙酮酸脫羧形成乙酰CoA1.1生物轉(zhuǎn)化總反應(yīng)式1.2丙酮酸脫氫酶復(fù)合體1.3反應(yīng)機(jī)制1.4丙酮酸脫氫酶的調(diào)控NAD+NADH+H+

丙酮酸乙酰CoA+CoA-SH輔酶A+CO2丙酮酸脫氫酶系1.1生物轉(zhuǎn)化總反應(yīng)式丙酮酸+CoA-SH+NAD+乙酰CoA+CO2+

NADH+H+

丙酮酸脫氫酶系酶輔因子功能丙酮酸脫氫酶（E1）TPP,Mg2+

丙酮酸氧化脫羧二氫硫辛酰轉(zhuǎn)乙?；福‥2）硫辛酰胺輔酶A轉(zhuǎn)乙?；罜oA激酶、磷酸酶二氫硫辛酸脫氫酶（E3）FADNAD+

使二氫硫辛酰胺再氧化丙酮酸脫氫多酶復(fù)合體：是催化功能上有聯(lián)系的幾種酶通過非共價鍵連接彼此嵌合形成的復(fù)合體。其中每一個酶都有其特定的催化功能，且具有其催化活性必需的輔酶。1.2丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDC)組成與功能CryoEMimages.ZhouZHetal.PNAS2001;98:14802-14807?2001byTheNationalAcademyofSciences1.2.1丙酮酸脫氫酶復(fù)合體立體結(jié)構(gòu)模型E2:硫辛酰轉(zhuǎn)乙酰基酶

E3:二氫硫辛酸脫氫酶E1:丙酮酸脫氫酶不同多聚體的三種酶鑲嵌構(gòu)成多酶復(fù)合體。丙酮酸脫氫酶

E1:8個三聚體硫辛酰轉(zhuǎn)乙酰基酶

E2:8個三聚體二氫硫辛酸脫氫酶

E3:6個二聚體不同多亞基蛋白的三種酶鑲嵌構(gòu)成多酶復(fù)合體1.2.2TPP輔酶C-OHC-O`OC-H3形成活性負(fù)碳離子，結(jié)合丙酮酸TPP催化脫羧的機(jī)制E1-TPP-羥乙基E2中硫辛酰賴氨酰長鏈結(jié)構(gòu)氧化態(tài)還原態(tài)乙?；Y(jié)合態(tài)Lys殘基硫辛酸E2中Lys殘基通過酰胺鍵連接硫辛酸硫辛酸分子含2個SH，有氧-還變化硫辛酸分子中的SH起?；D(zhuǎn)運(yùn)作用1.2.3硫辛酰胺輔酶1.2.4輔酶FAD（復(fù)習(xí)）丙酮酸+CoA-SH+NAD+乙酰CoA+CO2+NADH+H+

1.3丙酮酸氧化脫羧反應(yīng)機(jī)制/chemistry_d/templates/student_resources/shared_resources/animations/pdc/pdc.html總化學(xué)反應(yīng)方程：反應(yīng)的動態(tài)過程與分子機(jī)制：圖解見后一頁△G0’=-39.5kJ/mol1.

-羥乙基-TPP的生成2A.羥乙基脫氫、與硫辛酰胺結(jié)合

3.乙酰CoA的生成2B.乙酰基傳遞4.硫辛酰胺的還原

5.NADH+H+的生成砷化物對E2輔基硫辛酰胺的毒害作用E2-O-As(p96)-（R-As）亞砷酸鹽和有機(jī)砷化物破壞硫辛酸：破壞SH的還原性而致酶失活。（與砷酸對糖酵解阻斷比較？）

1.4丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的調(diào)控①NADH、乙酰CoA產(chǎn)物競爭性抑制（別構(gòu)調(diào)節(jié)）②磷酸化和去磷酸化的共價修飾調(diào)控（主要調(diào)節(jié)E1）抑制劑激活劑E1E2上的激酶E2上的磷酸酶、Ca2+E2乙酰CoACoAE3NADHNAD+E1

E1+

活性上升活性下降

P共價修飾（Covalentmodification）是酶中的氨基酸殘基與某種化學(xué)基團(tuán)發(fā)生可逆的共價結(jié)合而使酶發(fā)生活性變化的過程，這是酶的一種活性可逆的調(diào)節(jié)機(jī)制。酶輔因子功能丙酮酸脫氫酶（E1）TPP,Mg2+

丙酮酸氧化脫羧二氫硫辛酰轉(zhuǎn)乙?；福‥2）硫辛酰胺輔酶A轉(zhuǎn)乙?；罜oA激酶、磷酸酶二氫硫辛酸脫氫酶（E3）FADNAD+

使二氫硫辛酰胺再氧化丙酮酸脫氫多酶復(fù)合體：是催化功能上有聯(lián)系的幾種酶通過非共價鍵連接彼此嵌合形成的復(fù)合體。其中每一個酶都有其特定的催化功能，且具有其催化活性必需的輔酶。1.2丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDC)組成與功能2.1反應(yīng)機(jī)制2.2反應(yīng)的質(zhì)能結(jié)算2.3反應(yīng)調(diào)控2.4生理意義乙酰CoA進(jìn)入TAC徹底氧化（線粒體）二.檸檬酸循環(huán)TCA概貌⑴乙酰CoA與草酰乙酸縮合形成檸檬酸檸檬酸合酶草酰乙酸CH3CO～SCoA乙酰輔酶A檸檬酸HSCoA關(guān)鍵限速酶H2O2.1檸檬酸循環(huán)各步反應(yīng)乙酰CoA

+草酰乙酸

檸檬酸+CoA-SH△G0’=-32.2kJ/mol檸檬酸合酶是同二聚體酶，其二級結(jié)構(gòu)幾乎全部為α-螺旋。各亞基具有大小兩個結(jié)構(gòu)域，游離時呈開放狀態(tài)，以結(jié)合草酰乙酸，結(jié)合后，小結(jié)構(gòu)域發(fā)生18度旋轉(zhuǎn)，封閉結(jié)合部位，同時暴露乙酰CoA結(jié)合位點(diǎn)，與之結(jié)合催化縮合反應(yīng)進(jìn)行。/wiki/index.php/The_Citric_Acid_Cycle/lehninger5e/content/cat_010/1609_citrate_synthase.html?v=chapter&i=16010.01&s=16000&n=00010&o=%7C00610%7C00580%7C00590%7C00510%7C00540%7C00600%7C00550%7C00570%7C00630%7C00010%7C00020%7C00030%7C00040%7C00070%7C00080%7C00090%7C00100%7C01000%7C02000%7C03000%7C04000%7C05000%7C06000%7C07000%7C08000%7C09000%7C1000克萊森酯縮和反應(yīng)KeyAAHis320His274Asp375具有嚴(yán)格的底物專一性和立體選擇性，可調(diào)控。抑制劑:ATP,NADH,琥珀酰CoA，酯酰CoA

氟乙酰CoA——氟檸檬酸（致死性合成）不可逆結(jié)合順-烏頭酸酶，抑制TCA。丙酮酰CoA——乙酰CoA類似物

檸檬酸合酶的調(diào)節(jié)異檸檬酸⑵檸檬酸異構(gòu)化生成異檸檬酸檸檬酸順烏頭酸順烏頭酸酶H2OHOHCOOHCOOHCH2CCOOHCHHOHCOOHCOOHCH2CCOOHCH平衡狀態(tài)下濃度比：90:4:6檸檬酸異檸檬酸鐵原子硫原子是鐵-硫蛋白，催化可逆反應(yīng)（脫水與水合）形成的中間產(chǎn)物順-烏頭酸與酶的脫離緩慢

順-烏頭酸酶CO2NAD+異檸檬酸⑶異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸α-酮戊二酸草酰琥珀酸NADH+H+異檸檬酸脫氫酶關(guān)鍵酶ΔG0’=-20.92kJ/mol異檸檬酸脫氫酶酶活性:(+)ADP,NAD+；(-)ATP,NADH反應(yīng)方程ΔG0’=-20.92kJ/molα-酮戊二酸異檸檬酸TCA中第一次氧化還原(脫羧脫氫)反應(yīng)異檸檬酸+NAD+α-酮戊二酸+CO2+NADH+H+酶活中心結(jié)合NAD+或NADP+及Mg2+或Ca2+。金屬離子對酶活是必需的。參與底物結(jié)合與催化的AA殘基：Asp275、279、252，Lys212，Tyr140，Ser278、95，Asn97和Thr78；下面還有Arg101、110、133三個殘基抓住異檸檬酸異檸檬酸脫氫酶氧化脫羧脫氫反應(yīng)

E－Tyr：E-Tyr吸引C2－羥基H；C2－H傳到NAD＋E-Lys吸引

C相鄰羧基H；金屬離子絡(luò)合穩(wěn)定富電O；C－C鍵破裂脫羧，C雙建接受Tyr上的H，回復(fù)羰基異檸檬酸在植物或微生物中，還可以有另一條轉(zhuǎn)化途徑，即當(dāng)能量貯備充足時，由異檸檬酸裂解酶催化，裂解產(chǎn)生琥珀酸和乙醛酸（乙醛酸循環(huán)）。異檸檬酸脫氫酶活性的調(diào)節(jié)變構(gòu)激活劑：ADP，異檸檬酸，NAD+，Mg++，變構(gòu)抑制劑：ATP,NADH+H+,低能核狀態(tài)時，酶活加強(qiáng)，三羧酸循環(huán)增強(qiáng)。細(xì)菌中的異檸檬酸脫氫酶，還可以通過Ser殘基的磷酸化（共價修飾）而大大降低酶活性，去磷酸化后活性升高。CO2⑷α-酮戊二酸氧化脫羧

生成琥珀酰輔酶A

α-酮戊二酸脫氫酶系HSCoANAD+NADH+H+琥珀酰CoAα-酮戊二酸α-酮戊二酸+CoA-SH+NAD+

琥珀酰CoA

+CO2+NADH+H+

OCOOHCH2CH2COOHC關(guān)鍵酶ΔG0’=-33.47kJ/mol第二次脫羧脫氫反應(yīng)機(jī)制與調(diào)節(jié)TCA中第二次脫羧脫氫,形成高能化合物并釋放大量能量α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體:組成\催化機(jī)制和調(diào)控均類似于丙酮酸脫氫酶系,酶1催化α-酮戊二酸脫羧，并轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生的4C琥珀?；l(fā)生后續(xù)反應(yīng).抑制劑：琥珀酰CoA，NADH，ATP與丙酮酸脫氫酶系不同之處是酶無共價修飾調(diào)節(jié)。丙酮酸進(jìn)入線粒體后產(chǎn)生幾個高能中間代謝產(chǎn)物？酶催化反應(yīng)機(jī)制⑸琥珀酰CoA轉(zhuǎn)變?yōu)殓晁幔ǖ孜锼搅姿峄╃牾oA合成酶琥珀酰CoAATPADP琥珀酸GDP+PiGTPHSCoA琥珀酰CoA

+

GDP

+Pi

琥珀酸+GTP

+CoA-SH

(TCA唯一一次直接產(chǎn)能)ΔG0’=-30.12kJ/mol⑹琥珀酸氧化脫氫生成延胡索酸TCA循環(huán)延胡索酸琥珀酸脫氫酶FADFADH2琥珀酸

+FAD

延胡索酸+

FADH2琥珀酸3rd氧化還原反應(yīng)ΔG0’=-3.35kJ/mol琥珀酸脫氫酶TCA途徑中唯一嵌入線粒體內(nèi)膜的酶與氧化磷酸化從結(jié)構(gòu)上關(guān)聯(lián)(參與兩條代謝途徑）

Fe-S蛋白質(zhì)（將在生物氧化章中詳述）高度立體專一性FAD為輔酶,與酶蛋白共價連接丙二酸（強(qiáng)抑制劑）⑺延胡索酸水化生成蘋果酸延胡索酸蘋果酸延胡索酸酶H2O延胡索酸+H2O

蘋果酸⑻蘋果酸脫氫生成草酰乙酸

蘋果酸脫氫酶

草酰乙酸NAD+NADH+H+蘋果酸+

NAD+草酰乙酸+NADH+H+

蘋果酸第4次氧化還原反應(yīng)P草酰乙酸CH2CO～SoA(乙酰輔酶A)蘋果酸琥珀酸琥珀酰CoAα-酮戊二酸異檸檬酸檸檬酸CO22HCO22HGTP延胡索酸2H2HNAD+NAD+FADNAD+三羧酸循環(huán)總圖2.2TCA循環(huán)結(jié)算：

加入一分子乙酰CoA

A.兩次脫羧--2分子CO2

B.四次氧化還原轉(zhuǎn)移4對H

(3NADH2+1FADH2)

C.產(chǎn)生1分子GTP(ATP)

D.自由能變化(P108)

/legacy/college/boyer/0470003790/animations/tca/tca.swf

TCA運(yùn)轉(zhuǎn)一周的凈結(jié)果是氧化1分子乙酰CoA，草酰乙酸僅起載體作用，反應(yīng)前后無改變。TCA中的一些