核酸測定專題知識講座

核酸測定專題知識講座核酸測定專題知識講座第1頁一、紫外分光光度法二、ECL法三、共振光散射法四、熒光探針菲啶溴紅法五：地衣酚法測定RNA含量核酸測定專題知識講座第2頁一、紫外分光光法（定磷法）原理：①元素分析表明，RNA含磷量平均為9.4%，DNA含磷量平均為9.9％，由此能夠推導(dǎo)出核酸質(zhì)量約為其含磷量11倍，所以可從測得核酸樣品含磷量計算核酸含量。②DNA、RNA分子在強酸作用下降解糖，再與濃酸、酚或胺生成有色化合物，其顏色深淺與核酸含量呈正比，所以經(jīng)過比色法可測得核酸含量。核酸測定專題知識講座第3頁儀器：分析天平、離心機、容量瓶、紫外分光光度計、吸管等試劑：氨水、鉬酸銨-高氯酸注意事項：因為蛋白質(zhì)含有芳香族氨基酸，故也能吸收紫外光，通常吸收峰在280nm處，在260nm處吸收值僅為核酸十分之一或更低，若樣品中蛋白質(zhì)含量較低時對核酸紫外測定影響不大，若蛋白質(zhì)含量較高時，會影響核酸含量測定，故應(yīng)去除蛋白質(zhì)干擾。核酸測定專題知識講座第4頁二、ECL法ECL(電化學(xué)發(fā)光分析):將電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光完美結(jié)合新型免疫分析技術(shù)電化學(xué)發(fā)光技術(shù)(electroehemiluminesenee,ECL),同時聯(lián)合新型免疫固相放大技術(shù)—鏈霉親和素系統(tǒng),在免疫學(xué)檢瀏中尤其是核酸測定中,發(fā)揮了以往發(fā)光技術(shù)無可比擬優(yōu)勢。核酸測定專題知識講座第5頁儀器：ECL測量室、磁性微球、電極等注意事項：ECL技術(shù)是電化學(xué)技術(shù)和化學(xué)發(fā)光技術(shù)相結(jié)合新型免疫分析方法，與普通化學(xué)發(fā)光(酶促發(fā)光或生物發(fā)光)有顯著區(qū)分．前者為電促發(fā)光，在極表面經(jīng)過三角形脈沖電壓激發(fā)產(chǎn)生穩(wěn)定、連續(xù)、高效發(fā)光，后者則是標識辣根過氧化物酶作用下催化化學(xué)發(fā)光劑如魯米那，吖啶酶等產(chǎn)生不穩(wěn)定、間斷、閃爍性發(fā)光，且反應(yīng)過程中輕易發(fā)生裂變而使結(jié)果不穩(wěn)定。ECL測定照光度依據(jù)釋放光于，波長仍屬熒光測定范圍，但與直接熒光發(fā)光不一樣，熒光發(fā)光靈敏度蹙熒光發(fā)光本底和光學(xué)部件散射光影響，適應(yīng)范圍也較低。核酸測定專題知識講座第6頁三、共振光散射法原理：在普通熒光分光光度計上進行測量分析技術(shù)，靈敏度高、簡便快速。該技術(shù)能夠用于研究核酸與有機小分子探針間相互作用并進行核酸定量測定。在核酸測定分析中，該方法靈敏度主要取決于探針分子與核酸作用強弱，所以尋找靈敏核酸測定探針成為核酸分析主要內(nèi)容核酸測定專題知識講座第7頁儀器：F-2500型熒光分光光度計，QL-901型旋渦混合器，pHS-3C酸度計試劑：fsDNA貯備液、溴化十六烷基三甲銨、依來鉻藍黑、Britton-Robinson緩沖液、M/25混合酸注意事項：緩沖溶液（BR）加入次序?qū)LS強度影響不大，而染料加入次序則很關(guān)鍵。主要是因為陽離子表面活性劑CTMAB首先與大分子fsDNA以靜電引力結(jié)合，再進而與染料結(jié)合形成離子締合物而使RLS強度顯著增強。在試驗中，凡最終加入染料組合其RLS信號都尤其強，即CTMAB與fsDNA作用之后再讓染料聚集，所獲RLS信號更強。所以試劑加入最正確次序應(yīng)是先加入fsDNA和CTMAB，最終再加入染料核酸測定專題知識講座第8頁四、熒光探針菲啶溴紅法原理：常溫下核酸本身熒光很弱,不能直接探測到。利用熒光探針—菲啶溴紅(簡稱EthBr)插入核酸雙鏈區(qū)時,其量子產(chǎn)率大大增高,它和核酸形成一個較強熒光絡(luò)合物。在一定條件下,這種絡(luò)合物熒光強度和核酸濃度成正比利用核酸酶處理就能確定樣品中DNA和RNA含量利用這種方法可檢測核酸最小含量為0.02微克/毫升核酸測定專題知識講座第9頁儀器：熒光分光光度計、MPF-4型熒光分光光度計、組織勻漿器試劑：菲啶溴紅、核搪核酸鈉鹽、廣譜蛋白酶、三羥甲基氨基甲烷、EthBr溶液、Tris一HCL緩沖液注意事項：這種方法也有一定不足,如熒光測定試驗條件嚴格;不能側(cè)定失去雙鏈區(qū)核酸;勻漿樣品中若干擾物質(zhì)(如蛋白質(zhì)等)含量大大超出核酸含量時,對于結(jié)果有影響。不過利用這種熒光方法測定微量核酸含有顯著優(yōu)點;簡便、快速、靈敏和專一性強。核酸測定專題知識講座第10頁原理：核糖核酸與濃鹽酸共熱時，即發(fā)生降解，形成核糖繼而轉(zhuǎn)變成糖醛，后者與3，5—二羥基甲苯（地衣酚）反應(yīng)呈鮮綠色，該反應(yīng)需用三氯化鐵或氯化銅作催化劑，反應(yīng)產(chǎn)物在670nm處有最大吸收，RNA濃度在0微克/毫升范圍內(nèi)，光密度與RNA濃度成正比關(guān)系，在反應(yīng)液中如混有DNA或其它雜質(zhì)。也能給出類似顏色。所以測定RNA時可先測定DNA含量，再計算RNA含量。五、地衣酚法測定RNA含量核酸測定專題知識講座第11頁儀器：試管及管架、水浴鍋、移液管、可見光分光光度計注意事項：①地衣酚法只能測定RNA中與嘌呤連接核糖，不一樣起源RNA所含嘌呤與嘧啶百分比各不相同，所以，用所測得核糖量來換算