基因表達載體的構(gòu)建專家講座

第六章

外源基因在大腸桿菌中表示調(diào)控第一節(jié)

基因表示概述和基本條件第二節(jié)

在大腸桿菌中影響外源基因表示原因基因表達載體的構(gòu)建專家講座第1頁第一節(jié)

基因表示概述和基本條件

一、基因表示基本概念二、基因表示基本條件三、真核基因在原核細(xì)胞中表示及調(diào)控基因表達載體的構(gòu)建專家講座第2頁第二節(jié)

在大腸桿菌中影響外源基因表示原因一、開啟子結(jié)構(gòu)對表示效率影響二、表示載體選擇三、外源基因（cDNA）中密碼子作用四、mRNA一級結(jié)構(gòu)與基因表示五、mRNA二級結(jié)構(gòu)對翻譯起始影響六、mRNA穩(wěn)定性影響七、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對外源基因表示效率影響八、轉(zhuǎn)錄后若干原因與基因表示關(guān)系九、宿主選擇對表示影響十、培養(yǎng)條件控制對表示效率影響基因表達載體的構(gòu)建專家講座第3頁一、基因表示基本概念

生物體遺傳信息都是以核苷酸序列編碼形式儲存在遺傳物質(zhì)DNA上,基因表示是目標(biāo)基因DNA在導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成mRNA,再以mRNA指導(dǎo)翻譯成蛋白質(zhì)?；虮硎疽蕾囉谟行мD(zhuǎn)錄和mRNA正確翻譯以及翻譯后加工處理等各個步驟調(diào)整作用，其中轉(zhuǎn)錄最為關(guān)鍵，原核基因表示過程和方式與真核細(xì)胞有顯著不一樣?；虮磉_載體的構(gòu)建專家講座第4頁二、基因表示基本條件1.外源基因插入序列必須保持正確方向和閱讀框架。其遺傳密碼不得缺失、遺漏、或錯位及錯碼。不然會造成編碼錯誤蛋白質(zhì)分子，尤其是目標(biāo)基因序列內(nèi)部應(yīng)不含兩端酶切位點識別序列。2.插入外源基因必須放在原核開啟子控制之下，也就是使原核RNA聚合酶能夠識別插入基因。3.外源基因必須能在大腸桿菌中進行有效轉(zhuǎn)錄（如無內(nèi)含子），轉(zhuǎn)錄后mRNA在菌體必須相當(dāng)穩(wěn)定，而且能有效地進行翻譯，轉(zhuǎn)譯蛋白分子在菌體內(nèi)不致于受菌體蛋白酶降解。

基因表達載體的構(gòu)建專家講座第5頁三、真核基因在原核細(xì)胞中表示及調(diào)控真核基因在原核細(xì)胞中表示及調(diào)控特點㈠有效轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控元件

㈡正確轉(zhuǎn)譯

㈢原核表示載體構(gòu)建基因表達載體的構(gòu)建專家講座第6頁㈠有效轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控元件

1.RNA聚合酶2.開啟子及其轉(zhuǎn)錄作用開啟（開啟子概念、分類）3.轉(zhuǎn)錄作用終止4.轉(zhuǎn)錄弱化作用基因表達載體的構(gòu)建專家講座第7頁㈡正確轉(zhuǎn)譯

1.起始密碼子（intiqtioncodon,initiator）2.核糖體結(jié)合位點（RBS，又稱SD序列）基因表達載體的構(gòu)建專家講座第8頁㈢原核表示載體構(gòu)建

原核表示載體構(gòu)建要求1.表示載體類型2.表示載體舉例3.包涵體表示載體基因表達載體的構(gòu)建專家講座第9頁開啟子⑴乳糖開啟子（Lac）⑵Trp開啟子⑶Tac開啟子⑷噬菌體PL和PR開啟子⑸脂蛋白開啟子（LPP）基因表達載體的構(gòu)建專家講座第10頁開啟子結(jié)構(gòu)對表示效率影響開啟子-35區(qū)和-10區(qū)序列與通用轉(zhuǎn)錄序列一致，間距為17bp，大于17bp效果差，不一樣產(chǎn)物選取不一樣開啟子，如尿激酶用ptac，IL2/2FU-V用PRPL開啟子效果好。基因表達載體的構(gòu)建專家講座第11頁表示載體選擇載體分子量不宜過大，以2.5-5.6kb為佳，高拷貝，不一樣產(chǎn)物選取不一樣類型表示載體?；虮磉_載體的構(gòu)建專家講座第12頁外源基因（cDNA）中密碼子作用細(xì)菌中基因表示對密碼子有偏愛性，不偏愛稀有密碼子（AGA、AGG）表示效果差，尤其當(dāng)有AGA-AGG連續(xù)序列存在時表示效率低基因表達載體的構(gòu)建專家講座第13頁mRNA一級結(jié)構(gòu)與基因表示啟始密碼子：表示效率AUG>GUG>UUGSD序列：較長效率高，如UAAGGAGG比AAGAA高三倍；SD序列與AUG間距普通6-12bp，4-10bp較佳，9bp最正確；SD序列5’非翻譯區(qū)，若有5’-UGAUCU，則有增強作用。基因表達載體的構(gòu)建專家講座第14頁mRNA二級結(jié)構(gòu)對翻譯起始影響mRNA形成二級結(jié)構(gòu)時，可產(chǎn)生莖環(huán)。若SD序列、AUG位于莖環(huán)內(nèi)或發(fā)夾內(nèi)，轉(zhuǎn)譯受抑制；在莖環(huán)外則有利于轉(zhuǎn)譯。見表6-1基因表達載體的構(gòu)建專家講座第15頁mRNA穩(wěn)定性影響REP序列可阻止mRNA降解，偏愛密碼子也起保護作用?；虮磉_載體的構(gòu)建專家講座第16頁真核基因在原核細(xì)胞中表示及調(diào)控特點只有一個RNA聚合酶以操縱子為單位來完成基因轉(zhuǎn)錄基因轉(zhuǎn)錄無RNA剪接功效因無核仁、核膜，核酸均為裸露，轉(zhuǎn)錄與翻譯是連續(xù)進行轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在多聚核糖體上合成，同時合成多條肽鏈有特有SD序列，調(diào)控mRNA與核糖體有效結(jié)合和翻譯起始無糖基化功效基因表達載體的構(gòu)建專家講座第17頁RNA聚合酶原核細(xì)胞只有一個RNA聚合酶，當(dāng)其關(guān)鍵酶與σ因子結(jié)合，形成全酶后，才能識別DNA上開啟子進行轉(zhuǎn)錄。基因表達載體的構(gòu)建專家講座第18頁開啟子概念開啟子是位于結(jié)構(gòu)基因上游，轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控所必需一段DNA序列，內(nèi)含-35區(qū)（與σ因子結(jié)合）和-10區(qū)（和關(guān)鍵酶結(jié)合）保守序列。當(dāng)開啟子與全酶結(jié)合后可在+1轉(zhuǎn)錄起始點開始轉(zhuǎn)錄，如圖6-1?；虮磉_載體的構(gòu)建專家講座第19頁轉(zhuǎn)錄作用終止由轉(zhuǎn)錄終止子發(fā)揮作用，凡能使轉(zhuǎn)錄終止相關(guān)DNA序列稱終止子。強終止子：不依賴ρ因子發(fā)揮終止作用，回文序列中G/C配對多，有四個以上U，致使RNA聚合酶構(gòu)象改變而終止轉(zhuǎn)錄。如圖6-9,如圖6-10弱終止子：依賴ρ因子發(fā)揮終止作用。如圖6-11基因表達載體的構(gòu)建專家講座第20頁轉(zhuǎn)錄弱化作用轉(zhuǎn)錄弱化作用使轉(zhuǎn)錄沒有抵達終止信號處而中途停頓轉(zhuǎn)錄，使mRNA轉(zhuǎn)錄發(fā)生部分停頓，而不是發(fā)生全部停頓。

基因表達載體的構(gòu)建專家講座第21頁起始密碼子起始密碼子是編碼多肽鏈第一位氨基酸密碼子AUG（或ATG），編碼甲硫氨酸（蛋氨酸）。在細(xì)菌中也有罕見起始密碼子GUG，編碼纈氨酸。其起始表示作用AUG＞GUG?；虮磉_載體的構(gòu)建專家講座第22頁核糖體結(jié)合位點轉(zhuǎn)錄mRNAAUG上游含有，能與核糖體發(fā)生有效結(jié)合和轉(zhuǎn)譯所需要序列（RBS），長度為3-9bp，距AUG3-11bp，它與16srRNA3’末端（AUUCCUCCAC-DAG-5’）互補其互補程度、SD與AUG間距等與轉(zhuǎn)譯效果相關(guān)。如圖基因表達載體的構(gòu)建專家講座第23頁表示載體類型表示載體類型主要有四種：非融合型表示載體，如PKK223-3如圖6-14分泌型表示載體，如PINⅢ-ompA1如圖6-15融合蛋白型表示載體，如PGEX如圖6-16包涵體型表示載體，如pBV220如圖6-17基因表達載體的構(gòu)建專家講座第24頁原核表示載體構(gòu)建要求完整表示載體（質(zhì)粒）應(yīng)有強開啟子（P）、終止子（T）、多個酶切位點、有抗性標(biāo)識、復(fù)制子和RBSSD序列。（如圖6-13）還應(yīng)結(jié)合考慮：質(zhì)粒拷貝能力和穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)譯蛋白表示形式和存放地點（分泌型/包涵體/融合蛋白），蛋白質(zhì)分子量、性質(zhì)和穩(wěn)定性以及選擇適當(dāng)宿主細(xì)胞。基因表達載體的構(gòu)建專家講座第25頁乳糖開啟子（Lac）無乳糖時，調(diào)整基因（I）產(chǎn)生阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合，阻止RNA聚合酶結(jié)合進而阻止轉(zhuǎn)錄；有乳糖時，乳糖能與阻遏蛋白結(jié)合，使其變構(gòu)解離而行使轉(zhuǎn)錄功效。如圖6-2而LacZ基因可由IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。Lac開啟子改建如圖6-3、6-4(a)

(b)基因表達載體的構(gòu)建專家講座第26頁Trp開啟子色氨酸開啟子（Trp）阻遏蛋白在有色氨酸時，二者結(jié)合，阻遏蛋白變構(gòu)激活而與開啟子結(jié)合，阻止RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。無色氨酸時，阻遏解除，因β-吲哚丙烯酸是色氨酸競爭性抑制劑，慣用作誘導(dǎo)劑，誘發(fā)色氨酸開啟子轉(zhuǎn)錄。（如圖6-5）同時，衰減子對Trp轉(zhuǎn)錄也有調(diào)整作用（如圖6-6）基因表達載體的構(gòu)建專家講座第27頁Tac開啟子Tac開啟子是由Trp開啟子和Lac開啟子構(gòu)建而成雜合開啟子，-35區(qū)為Trp開啟子次序，-10為LacUV5開啟子次序，二者之間距離為16bp者為pTrc，17bp者為pTac。該開啟子只需用IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄即可。如圖6-7基因表達載體的構(gòu)建專家講座第28頁噬菌體PL和PR開啟子PL為λφ左向開啟區(qū)，PR為右向轉(zhuǎn)錄開啟區(qū)，與CI阻遏蛋白結(jié)合，可抑制OL或OR轉(zhuǎn)錄，但CI在42℃誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄（如圖6-8）?；虮磉_載體的構(gòu)建專家講座第29頁脂蛋白開啟子（LPP）脂蛋白為細(xì)胞外膜蛋白，細(xì)菌中含量高，該開啟子表示效率高，由信號肽可將基因表示產(chǎn)物分泌到胞外，慣用來結(jié)構(gòu)分泌型表示載體?；虮磉_載體的構(gòu)建專家講座第30頁基因表達載體的構(gòu)建專家講座第31頁基因表達載體的構(gòu)建專家講座第32頁基因表達載體的構(gòu)建專家講座第33頁基因表達載體的構(gòu)建專家講座第34頁基因表達載體的構(gòu)建專家講座第35頁基因表達載體的構(gòu)建專家講座第36頁基因表達載體的構(gòu)建專家講座第37頁基因表達載體的構(gòu)