固相膜免疫技術

關于固相膜免疫技術一、固相免疫測定B與F分離

Ab*Ab*Ag+Ag+Ab*AbAb第一節(jié)概述第2頁,共63頁，2024年2月25日，星期天二、固相膜的特點多孔性

毛細管作用非共價鍵高度吸附抗體或抗原

高度敏感性易于漂洗

操作簡便第3頁,共63頁，2024年2月25日，星期天三、常用的固相膜玻璃纖維素(fiberglass)膜尼龍(nylon)膜聚偏氟乙稀(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜第4頁,共63頁，2024年2月25日，星期天四、固相膜的技術要求孔徑：0.2~0.6μm或5~10μm流速：以ml/cm2/min表示蛋白質結合力：吸附力很強，以μg/cm2表示均一性第5頁,共63頁，2024年2月25日，星期天固相NC膜第6頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第7頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共63頁，2024年2月25日，星期天五、固相微孔膜測定種類1.斑點金免疫滲濾試驗(dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)2.免疫層析試驗（immunochromatographyassay,ICA）3.斑點ELISA

(dotenzymelinkedimmunosorbentassay,Dot-ELISA)

4.酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzymelinkedimmunospotassay,ELISPOT)5.免疫印跡法(ImmunoblottingTest,IBT)

6.放射免疫沉淀試驗(radioimmunoprecipitationassay,RIPA)

第9頁,共63頁，2024年2月25日，星期天六、膜固相免疫測定的特點優(yōu)點不足之處簡便，快速敏感度略低，價格略高（與ELISA比）單份測定精密度較差，質控困難保存期長（優(yōu)質試劑）穩(wěn)定性較差（普通試劑）可測定物范圍廣（主要為定性試驗）不易制備定量、半定量試劑感染性疾病的診斷妊娠、排卵的診斷腫瘤標志心肌標志濫用藥物第10頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

第二節(jié)免疫金標記技術

(ImmunogoldLabellingTechique)臨床免疫學和檢驗第11頁,共63頁，2024年2月25日，星期天一、概述1.概念

以膠體金作為標記物的免疫檢測技術2.類型

免疫金組織化學技術金免疫技術金免疫測定技術第12頁,共63頁，2024年2月25日，星期天二、膠體金基本知識1.膠體金的制備(1)在一定濃度的金溶液內加入定量的還原劑使金離子變成金原子，形成金顆粒懸液，即膠體金（colloidalgold）,也稱金溶膠（goldsol）。(2)HAuCl4是主要原料，常用的還原劑有檸檬酸鈉等。良好的膠體金應清亮透明，在潔凈的玻璃器皿中可較長時間保存，加入NaN3防腐。第13頁,共63頁，2024年2月25日，星期天2.四種粒徑膠體金的制備及特性膠體金粒徑膠體金特性（nm）呈色λmax16橙色518nm

24.5橙紅522nm

41紅色525nm

71.5紫色535nm

通過改變檸檬酸鈉的用量可制得不同大小的膠體金顆粒第14頁,共63頁，2024年2月25日，星期天方法金顆粒直徑白磷法5~12nm抗壞血酸法8~13nm枸櫞酸鈉法16~95nm檸檬酸鈉法16~147nm乙醇-超聲波法6~10nm硼酸鈉法2~5nm鞣酸-枸櫞酸鈉法15nm還原劑不同，膠體金顆粒大小及特性不同第15頁,共63頁，2024年2月25日，星期天膠體金（ColloidalGold）15~60nm優(yōu)質劣質第16頁,共63頁，2024年2月25日，星期天三、免疫金的特性和制備

膠體金可以和蛋白質等各種大分子物質結合，在免疫組化技術中，習慣上將膠體金結合蛋白質的復合物稱為金探針。用于免疫測定時，膠體金多與免疫活性物質（Ag或Ab）結合，這類結合物常稱為免疫金。第17頁,共63頁，2024年2月25日，星期天膠體金結合物（Conjugate）第18頁,共63頁，2024年2月25日，星期天四、免疫金（銀）染色（ImmunogoldsilverStaining，IGSS

）金標抗體待測抗原+金標抗體-抗原銀染液銀（金標抗體-抗原）第19頁,共63頁，2024年2月25日，星期天銀離子的還原劑：對苯二酚膠體金及銀原子起催化作用第20頁,共63頁，2024年2月25日，星期天免疫金（銀）染色應用多用于組織化學檢測敏感度低于其它標記免疫技術，但經(jīng)銀加強染色后敏感度與熒光免疫技術和酶免疫技術相當近年來發(fā)展了不少IGSS方法以替代熒光免疫技術，可以在普通顯微鏡下進行檢測第21頁,共63頁，2024年2月25日，星期天五、金免疫測定

斑點金免疫滲濾試驗（DotImmunogoldFiltrationAssay,DIGFA）金免疫層析試驗（gold

immuno－chromatographyassay，GICA）

第22頁,共63頁，2024年2月25日，星期天1.斑點金免疫滲濾試驗（DIGFA）原理

硝酸纖維素膜為載體，利用微孔濾膜的吸附性及可濾過性，使抗原抗體反應和洗滌在一特殊的滲濾裝置上以液體滲濾過膜的方式迅速完成

第23頁,共63頁，2024年2月25日，星期天DIGFA原理圖操作示意圖裝置分解圖蓋微孔膜吸水墊料底第24頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共63頁，2024年2月25日，星期天技術類型雙抗體夾心法

包被抗體待檢抗原金標抗體間接法

包被抗原待檢抗體金標抗抗體競爭法包被抗原待檢抗原金標抗體斑點金免疫滲濾試驗（DIGFA)第26頁,共63頁，2024年2月25日，星期天技術要點試劑盒組成免疫金標記物滲濾裝置（充滿吸水墊料的塑料小盒,盒蓋中央的小孔下面放置一片NC膜,膜上預包被Ag或Ab斑點）

洗滌液斑點金免疫滲濾試驗（DIGFA)第27頁,共63頁，2024年2月25日，星期天2.膠體金免疫層析試驗原理

以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔膜的毛細管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端橫向滲移，猶如橫向層析一般，層析過程中在適當部位進行抗原抗體反應第28頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第29頁,共63頁，2024年2月25日，星期天膠體金免疫層析試驗技術類型雙抗體夾心法競爭法間接法

第30頁,共63頁，2024年2月25日，星期天雙抗體夾心法測抗原膠體金免疫層析試驗第31頁,共63頁，2024年2月25日，星期天ICA——間接法測抗體膠體金免疫層析試驗第32頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第33頁,共63頁，2024年2月25日，星期天IFA與ICA的比較IFAICA試劑形式滲濾裝置及附加試劑試劑條試劑保存4~8℃6個月室溫一年操作步驟3~51觀察時間3min3~20min陽性反應顏色濃度操作結束顏色不變顏色逐漸加深第34頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第35頁,共63頁，2024年2月25日，星期天GIFA技術的發(fā)展（間接法測抗體）陽性陰性固相膜固相抗原待測抗體金標記抗人IgG抗體人IgG固相抗人IgG抗體快速檢測（滲濾法）原理圖第36頁,共63頁，2024年2月25日，星期天ICA技術的發(fā)展1990年ABBOTT公司膠體硒標記ICAUnipath公司CLEARVIEW立明衣原體彩色膠乳標記ICAROCHECardiacReaderTnT定量0.1~3ng/ml

合成TnT質控點第37頁,共63頁，2024年2月25日，星期天IFA肌紅蛋白雙孔法

S：測定孔

C：定量質控

100μg/LIFA微量白蛋白單孔法

T：測定孔

C1：定量質控30mg/LC2：定量質控200mg/L

結果判定：（-）<30（+）30~100、（++）100～200（+++）>200mg/LICA甲胎蛋白（AFP）參考值：30μg/L肝癌診斷值：>400μg/L結果判定：（-）<30（+）30~200（++）200~400（+++）>400μg/LSCTC2C1測定線對照線

半定量測定第38頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

金免疫測定方法特點

試驗所用試劑全部為干試劑，多個試劑被組合在一個約6mm×70mm的塑料板條上，成為一單一試劑條。

1.吸水材料2.免疫金復合物干片（下），硝酸纖維素膜（上）T：硝酸纖維素膜條包被特異抗體，R：參照區(qū)，包被有抗小鼠IgG。第39頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

金免疫測定方法評價

簡便、快速、單份測定，立等結果，除試劑外無需任何儀器，且試劑穩(wěn)定，適合于急診檢驗，但不能定量。(pointofcaretest,POCT)”

第40頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

金免疫測定應用1.臨床應用：定性分析，主要檢測正常體液中不存在的生物活性物質，以及正常情況下體液中含量很低而在某些疾病中升高的生物活性物質。（1）傳染?。?/p>

病毒相應抗原、抗體；性病病原體；細菌；寄生蟲。（2）激素：

生殖標志物，如診斷早早孕HCG、檢測排卵的促黃體生成素、促卵泡激素（FSH）等。第41頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

金免疫測定應用

（3）心血管?。?/p>

急性心肌梗死的標志物：肌酸激酶的同工酶CK-MB，肌紅蛋白，肌鈣蛋白-T及脂肪酸結合蛋白質（PABP）等；與心血管疾病有重要關系的D-二聚體（D-dimer）（4）腫瘤：腫瘤標志物如前列腺特異抗原（PSA），AFP，CEA，CA125及CA15-3，以及對腸道腫瘤篩查有重要意義的大便潛血免疫檢測（FOB）等（5）自身免疫?。?/p>

抗雙鏈DNA抗體和診斷甲狀腺自身免疫病的甲狀腺過氧化物酶（TPO）抗體

第42頁,共63頁，2024年2月25日，星期天金免疫測定應用（6）毒品

檢測：尿液中的可卡因、大麻、嗎啡、海洛因、苯丙胺等。國外報道有可同時測7種毒品的GICA。（7）其它

檢測：C-反應蛋白，半定量檢測血清α-脂蛋白。2.非臨床應用：

可用于食品檢測，環(huán)境污染，生物沾染，還可用于生物戰(zhàn)劑的快速檢測，獸醫(yī)學及法醫(yī)學等方面檢測。

第43頁,共63頁，2024年2月25日，星期天金免疫測定的重點和展望

臨床應用的重點應放在（1）急需快速診斷以便進行治療的急重癥，如協(xié)助確診急性心肌梗死的急性心梗標志物。（2）有普查意義的檢查和流行病學調查：如各種傳染?。ú《拘愿窝?，艾滋病，性病及其它各種流行?。┝餍胁≌{查；（3）某些腫瘤（如前列腺癌，結腸癌，肝癌，乳腺癌）的普查及預防檢查；（4）圍產期的健康普查等。（5）作為快速的初篩普查手段，對陽性和可疑的結果再進一步做更細的可靠的檢查。

第44頁,共63頁，2024年2月25日，星期天金免疫測定今后的發(fā)展

(1)

全面提高質量。突出質量控制的保證。(2)

提高檢測的靈敏度。目前檢測的靈敏度都低于相應的定量免疫分析，應盡量縮小差距。除使用各種優(yōu)質的原料，如膜條，高純度高親和力的配體（特別是配伍好的優(yōu)質單抗），優(yōu)質高比度的標記配體以及先進的工藝外，還應引進信號放大系統(tǒng)，例如生物素-鏈親和素系統(tǒng)，應用鏈親和素與生物素結合的四價性及極高的親和常數(shù)，可明顯提高靈敏度。

第45頁,共63頁，2024年2月25日，星期天金免疫測定今后的發(fā)展(3)

實現(xiàn)半定量和定量化。(4)

檢測多種分析物。同一個膜上可同時測定幾種有相關意義的分析物，如乙型肝炎不同的抗原及抗體。

(5)

建立檢測全血的方法。主要針對急重癥快速診斷之用，以減少分離血清的時間。德國寶靈曼生產的人肌鈣蛋白GICA便采用全血檢測方法。檢測全血的方法對自檢，患者床旁檢查和邊遠地區(qū)的普查都有實際應用意義。第46頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)其他膜免疫測定技術第47頁,共63頁，2024年2月25日，星期天一、斑點酶免疫吸附試驗

——Dot-ELISA第48頁,共63頁，2024年2月25日，星期天二、酶聯(lián)免疫斑點試驗

——ELISPOT20世紀80年代，國外的科研工作者根據(jù)ELISA技術的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌B細胞和細胞因子分泌T細胞的酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)。第49頁,共63頁，2024年2月25日，星期天ELISPOT檢測原理細胞受到刺激后局部產生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后，被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結合，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細胞產生了細胞因子，通過ELISPOT酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結果。第50頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第51頁,共63頁，2024年2月25日，星期天ELISAPOT第52頁,共63頁，2024年2月25日，星期天ELISPOT結果判斷第53頁,共63頁，2024年2月