固相膜免疫技術(shù)

關(guān)于固相膜免疫技術(shù)一、固相免疫測(cè)定B與F分離

Ab*Ab*Ag+Ag+Ab*AbAb第一節(jié)概述第2頁,共63頁，2024年2月25日，星期天二、固相膜的特點(diǎn)多孔性

毛細(xì)管作用非共價(jià)鍵高度吸附抗體或抗原

高度敏感性易于漂洗

操作簡(jiǎn)便第3頁,共63頁，2024年2月25日，星期天三、常用的固相膜玻璃纖維素(fiberglass)膜尼龍(nylon)膜聚偏氟乙稀(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜第4頁,共63頁，2024年2月25日，星期天四、固相膜的技術(shù)要求孔徑：0.2~0.6μm或5~10μm流速：以ml/cm2/min表示蛋白質(zhì)結(jié)合力：吸附力很強(qiáng)，以μg/cm2表示均一性第5頁,共63頁，2024年2月25日，星期天固相NC膜第6頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第7頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共63頁，2024年2月25日，星期天五、固相微孔膜測(cè)定種類1.斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)(dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)2.免疫層析試驗(yàn)（immunochromatographyassay,ICA）3.斑點(diǎn)ELISA

(dotenzymelinkedimmunosorbentassay,Dot-ELISA)

4.酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(enzymelinkedimmunospotassay,ELISPOT)5.免疫印跡法(ImmunoblottingTest,IBT)

6.放射免疫沉淀試驗(yàn)(radioimmunoprecipitationassay,RIPA)

第9頁,共63頁，2024年2月25日，星期天六、膜固相免疫測(cè)定的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)不足之處簡(jiǎn)便，快速敏感度略低，價(jià)格略高（與ELISA比）單份測(cè)定精密度較差，質(zhì)控困難保存期長(zhǎng)（優(yōu)質(zhì)試劑）穩(wěn)定性較差（普通試劑）可測(cè)定物范圍廣（主要為定性試驗(yàn)）不易制備定量、半定量試劑感染性疾病的診斷妊娠、排卵的診斷腫瘤標(biāo)志心肌標(biāo)志濫用藥物第10頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

第二節(jié)免疫金標(biāo)記技術(shù)

(ImmunogoldLabellingTechique)臨床免疫學(xué)和檢驗(yàn)第11頁,共63頁，2024年2月25日，星期天一、概述1.概念

以膠體金作為標(biāo)記物的免疫檢測(cè)技術(shù)2.類型

免疫金組織化學(xué)技術(shù)金免疫技術(shù)金免疫測(cè)定技術(shù)第12頁,共63頁，2024年2月25日，星期天二、膠體金基本知識(shí)1.膠體金的制備(1)在一定濃度的金溶液內(nèi)加入定量的還原劑使金離子變成金原子，形成金顆粒懸液，即膠體金（colloidalgold）,也稱金溶膠（goldsol）。(2)HAuCl4是主要原料，常用的還原劑有檸檬酸鈉等。良好的膠體金應(yīng)清亮透明，在潔凈的玻璃器皿中可較長(zhǎng)時(shí)間保存，加入NaN3防腐。第13頁,共63頁，2024年2月25日，星期天2.四種粒徑膠體金的制備及特性膠體金粒徑膠體金特性（nm）呈色λmax16橙色518nm

24.5橙紅522nm

41紅色525nm

71.5紫色535nm

通過改變檸檬酸鈉的用量可制得不同大小的膠體金顆粒第14頁,共63頁，2024年2月25日，星期天方法金顆粒直徑白磷法5~12nm抗壞血酸法8~13nm枸櫞酸鈉法16~95nm檸檬酸鈉法16~147nm乙醇-超聲波法6~10nm硼酸鈉法2~5nm鞣酸-枸櫞酸鈉法15nm還原劑不同，膠體金顆粒大小及特性不同第15頁,共63頁，2024年2月25日，星期天膠體金（ColloidalGold）15~60nm優(yōu)質(zhì)劣質(zhì)第16頁,共63頁，2024年2月25日，星期天三、免疫金的特性和制備

膠體金可以和蛋白質(zhì)等各種大分子物質(zhì)結(jié)合，在免疫組化技術(shù)中，習(xí)慣上將膠體金結(jié)合蛋白質(zhì)的復(fù)合物稱為金探針。用于免疫測(cè)定時(shí)，膠體金多與免疫活性物質(zhì)（Ag或Ab）結(jié)合，這類結(jié)合物常稱為免疫金。第17頁,共63頁，2024年2月25日，星期天膠體金結(jié)合物（Conjugate）第18頁,共63頁，2024年2月25日，星期天四、免疫金（銀）染色（ImmunogoldsilverStaining，IGSS

）金標(biāo)抗體待測(cè)抗原+金標(biāo)抗體-抗原銀染液銀（金標(biāo)抗體-抗原）第19頁,共63頁，2024年2月25日，星期天銀離子的還原劑：對(duì)苯二酚膠體金及銀原子起催化作用第20頁,共63頁，2024年2月25日，星期天免疫金（銀）染色應(yīng)用多用于組織化學(xué)檢測(cè)敏感度低于其它標(biāo)記免疫技術(shù)，但經(jīng)銀加強(qiáng)染色后敏感度與熒光免疫技術(shù)和酶免疫技術(shù)相當(dāng)近年來發(fā)展了不少IGSS方法以替代熒光免疫技術(shù)，可以在普通顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)第21頁,共63頁，2024年2月25日，星期天五、金免疫測(cè)定

斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)（DotImmunogoldFiltrationAssay,DIGFA）金免疫層析試驗(yàn)（gold

immuno－chromatographyassay，GICA）

第22頁,共63頁，2024年2月25日，星期天1.斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)（DIGFA）原理

硝酸纖維素膜為載體，利用微孔濾膜的吸附性及可濾過性，使抗原抗體反應(yīng)和洗滌在一特殊的滲濾裝置上以液體滲濾過膜的方式迅速完成

第23頁,共63頁，2024年2月25日，星期天DIGFA原理圖操作示意圖裝置分解圖蓋微孔膜吸水墊料底第24頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共63頁，2024年2月25日，星期天技術(shù)類型雙抗體夾心法

包被抗體待檢抗原金標(biāo)抗體間接法

包被抗原待檢抗體金標(biāo)抗抗體競(jìng)爭(zhēng)法包被抗原待檢抗原金標(biāo)抗體斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)（DIGFA)第26頁,共63頁，2024年2月25日，星期天技術(shù)要點(diǎn)試劑盒組成免疫金標(biāo)記物滲濾裝置（充滿吸水墊料的塑料小盒,盒蓋中央的小孔下面放置一片NC膜,膜上預(yù)包被Ag或Ab斑點(diǎn)）

洗滌液斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)（DIGFA)第27頁,共63頁，2024年2月25日，星期天2.膠體金免疫層析試驗(yàn)原理

以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔膜的毛細(xì)管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端橫向滲移，猶如橫向?qū)游鲆话?，層析過程中在適當(dāng)部位進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)第28頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第29頁,共63頁，2024年2月25日，星期天膠體金免疫層析試驗(yàn)技術(shù)類型雙抗體夾心法競(jìng)爭(zhēng)法間接法

第30頁,共63頁，2024年2月25日，星期天雙抗體夾心法測(cè)抗原膠體金免疫層析試驗(yàn)第31頁,共63頁，2024年2月25日，星期天ICA——間接法測(cè)抗體膠體金免疫層析試驗(yàn)第32頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第33頁,共63頁，2024年2月25日，星期天IFA與ICA的比較IFAICA試劑形式滲濾裝置及附加試劑試劑條試劑保存4~8℃6個(gè)月室溫一年操作步驟3~51觀察時(shí)間3min3~20min陽性反應(yīng)顏色濃度操作結(jié)束顏色不變顏色逐漸加深第34頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第35頁,共63頁，2024年2月25日，星期天GIFA技術(shù)的發(fā)展（間接法測(cè)抗體）陽性陰性固相膜固相抗原待測(cè)抗體金標(biāo)記抗人IgG抗體人IgG固相抗人IgG抗體快速檢測(cè)（滲濾法）原理圖第36頁,共63頁，2024年2月25日，星期天ICA技術(shù)的發(fā)展1990年ABBOTT公司膠體硒標(biāo)記ICAUnipath公司CLEARVIEW立明衣原體彩色膠乳標(biāo)記ICAROCHECardiacReaderTnT定量0.1~3ng/ml

合成TnT質(zhì)控點(diǎn)第37頁,共63頁，2024年2月25日，星期天IFA肌紅蛋白雙孔法

S：測(cè)定孔

C：定量質(zhì)控

100μg/LIFA微量白蛋白單孔法

T：測(cè)定孔

C1：定量質(zhì)控30mg/LC2：定量質(zhì)控200mg/L

結(jié)果判定：（-）<30（+）30~100、（++）100～200（+++）>200mg/LICA甲胎蛋白（AFP）參考值：30μg/L肝癌診斷值：>400μg/L結(jié)果判定：（-）<30（+）30~200（++）200~400（+++）>400μg/LSCTC2C1測(cè)定線對(duì)照線

半定量測(cè)定第38頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

金免疫測(cè)定方法特點(diǎn)

試驗(yàn)所用試劑全部為干試劑，多個(gè)試劑被組合在一個(gè)約6mm×70mm的塑料板條上，成為一單一試劑條。

1.吸水材料2.免疫金復(fù)合物干片（下），硝酸纖維素膜（上）T：硝酸纖維素膜條包被特異抗體，R：參照區(qū)，包被有抗小鼠IgG。第39頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

金免疫測(cè)定方法評(píng)價(jià)

簡(jiǎn)便、快速、單份測(cè)定，立等結(jié)果，除試劑外無需任何儀器，且試劑穩(wěn)定，適合于急診檢驗(yàn)，但不能定量。(pointofcaretest,POCT)”

第40頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

金免疫測(cè)定應(yīng)用1.臨床應(yīng)用：定性分析，主要檢測(cè)正常體液中不存在的生物活性物質(zhì)，以及正常情況下體液中含量很低而在某些疾病中升高的生物活性物質(zhì)。（1）傳染病：

病毒相應(yīng)抗原、抗體；性病病原體；細(xì)菌；寄生蟲。（2）激素：

生殖標(biāo)志物，如診斷早早孕HCG、檢測(cè)排卵的促黃體生成素、促卵泡激素（FSH）等。第41頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

金免疫測(cè)定應(yīng)用

（3）心血管病：

急性心肌梗死的標(biāo)志物：肌酸激酶的同工酶CK-MB，肌紅蛋白，肌鈣蛋白-T及脂肪酸結(jié)合蛋白質(zhì)（PABP）等；與心血管疾病有重要關(guān)系的D-二聚體（D-dimer）（4）腫瘤：腫瘤標(biāo)志物如前列腺特異抗原（PSA），AFP，CEA，CA125及CA15-3，以及對(duì)腸道腫瘤篩查有重要意義的大便潛血免疫檢測(cè)（FOB）等（5）自身免疫病：

抗雙鏈DNA抗體和診斷甲狀腺自身免疫病的甲狀腺過氧化物酶（TPO）抗體

第42頁,共63頁，2024年2月25日，星期天金免疫測(cè)定應(yīng)用（6）毒品

檢測(cè)：尿液中的可卡因、大麻、嗎啡、海洛因、苯丙胺等。國(guó)外報(bào)道有可同時(shí)測(cè)7種毒品的GICA。（7）其它

檢測(cè)：C-反應(yīng)蛋白，半定量檢測(cè)血清α-脂蛋白。2.非臨床應(yīng)用：

可用于食品檢測(cè)，環(huán)境污染，生物沾染，還可用于生物戰(zhàn)劑的快速檢測(cè)，獸醫(yī)學(xué)及法醫(yī)學(xué)等方面檢測(cè)。

第43頁,共63頁，2024年2月25日，星期天金免疫測(cè)定的重點(diǎn)和展望

臨床應(yīng)用的重點(diǎn)應(yīng)放在（1）急需快速診斷以便進(jìn)行治療的急重癥，如協(xié)助確診急性心肌梗死的急性心梗標(biāo)志物。（2）有普查意義的檢查和流行病學(xué)調(diào)查：如各種傳染?。ú《拘愿窝?，艾滋病，性病及其它各種流行?。┝餍胁≌{(diào)查；（3）某些腫瘤（如前列腺癌，結(jié)腸癌，肝癌，乳腺癌）的普查及預(yù)防檢查；（4）圍產(chǎn)期的健康普查等。（5）作為快速的初篩普查手段，對(duì)陽性和可疑的結(jié)果再進(jìn)一步做更細(xì)的可靠的檢查。

第44頁,共63頁，2024年2月25日，星期天金免疫測(cè)定今后的發(fā)展

(1)

全面提高質(zhì)量。突出質(zhì)量控制的保證。(2)

提高檢測(cè)的靈敏度。目前檢測(cè)的靈敏度都低于相應(yīng)的定量免疫分析，應(yīng)盡量縮小差距。除使用各種優(yōu)質(zhì)的原料，如膜條，高純度高親和力的配體（特別是配伍好的優(yōu)質(zhì)單抗），優(yōu)質(zhì)高比度的標(biāo)記配體以及先進(jìn)的工藝外，還應(yīng)引進(jìn)信號(hào)放大系統(tǒng)，例如生物素-鏈親和素系統(tǒng)，應(yīng)用鏈親和素與生物素結(jié)合的四價(jià)性及極高的親和常數(shù)，可明顯提高靈敏度。

第45頁,共63頁，2024年2月25日，星期天金免疫測(cè)定今后的發(fā)展(3)

實(shí)現(xiàn)半定量和定量化。(4)

檢測(cè)多種分析物。同一個(gè)膜上可同時(shí)測(cè)定幾種有相關(guān)意義的分析物，如乙型肝炎不同的抗原及抗體。

(5)

建立檢測(cè)全血的方法。主要針對(duì)急重癥快速診斷之用，以減少分離血清的時(shí)間。德國(guó)寶靈曼生產(chǎn)的人肌鈣蛋白GICA便采用全血檢測(cè)方法。檢測(cè)全血的方法對(duì)自檢，患者床旁檢查和邊遠(yuǎn)地區(qū)的普查都有實(shí)際應(yīng)用意義。第46頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)其他膜免疫測(cè)定技術(shù)第47頁,共63頁，2024年2月25日，星期天一、斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)

——Dot-ELISA第48頁,共63頁，2024年2月25日，星期天二、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)

——ELISPOT20世紀(jì)80年代，國(guó)外的科研工作者根據(jù)ELISA技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測(cè)特異性抗體分泌B細(xì)胞和細(xì)胞因子分泌T細(xì)胞的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)。第49頁,共63頁，2024年2月25日，星期天ELISPOT檢測(cè)原理細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后，被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過ELISPOT酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果。第50頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第51頁,共63頁，2024年2月25日，星期天ELISAPOT第52頁,共63頁，2024年2月25日，星期天ELISPOT結(jié)果判斷第53頁,共63頁，2024年2月