核酸提取與鑒定

核酸提取與鑒定核酸提取與鑒定第1頁(yè)研究對(duì)象：基因組DNA、質(zhì)粒DNA、總RNA、mRNA等過(guò)程：

核酸提取裂解：破碎細(xì)胞，使細(xì)胞中核酸游離在裂解體系中

純化：使核酸與裂解體系中其它成份，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離

核酸提取與鑒定第2頁(yè)核酸提取主要步驟：破碎細(xì)胞提取純化I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜——內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸提取與鑒定第3頁(yè)

總標(biāo)準(zhǔn)：

①應(yīng)確保核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)完整性；②排除其它分子污染。判定：濃度、純度、完整性判定技術(shù)：分光光度技術(shù)、凝膠電泳技術(shù)

核酸提取與鑒定第4頁(yè)第一節(jié)預(yù)處理

一、樣品預(yù)處理

1、組織

組織有新鮮組織、甲醛固定或石蠟包埋組織。

新鮮組織先用生理鹽水洗，然后將其搗碎或剪碎，加液氮研磨成粉狀，加細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞；

甲醛固定組織要先去掉甲醛；

石蠟包埋組織要經(jīng)過(guò)組織切片和二甲苯脫蠟等處理。核酸提取與鑒定第5頁(yè)2、培養(yǎng)細(xì)胞

培養(yǎng)細(xì)胞需棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用緩沖液進(jìn)行屢次漂洗，方可用于提取核酸。

核酸提取與鑒定第6頁(yè)3、血液血液能夠是新鮮血液或者凍貯血液；注意抗凝劑選擇，普通用EDTA-Na2或枸櫞酸鈉，不可使用肝素；全血離心棄血清（或血漿）、加適量紅細(xì)胞裂解液（破膜液），裂解紅細(xì)胞，再加適量細(xì)胞核裂液（破核液），裂解白細(xì)胞中細(xì)胞核，使核內(nèi)DNA釋放出來(lái)。核酸提取與鑒定第7頁(yè)二、提取用具預(yù)處理（一）DNA提取用具處理試劑、器材高壓干燥等進(jìn)行無(wú)DNA酶處理。（二）RNA提取用具處理核酸提取與鑒定第8頁(yè)1、提取RNA所用器皿處理及溶液準(zhǔn)備塑料制品：使用滅菌一次性用具?；蛴?.1％DEPC水浸泡或用氯仿沖洗(注意:有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕,故不能使用氯仿處理)。玻璃用具：使用前于180℃高溫下干烤6h以上，或在220℃下干烤3h以上。有機(jī)玻璃電泳槽等,可先用去污劑洗滌,雙蒸水沖洗,乙醇干燥,再用3％H2O2室溫浸泡10min，然后用0.1％DEPC水沖洗，晾干。

核酸提取與鑒定第9頁(yè)所需溶液配制：必須用高壓滅菌水和RNA提取專用化學(xué)試劑配制溶液，用干烤過(guò)藥匙稱取試劑，把溶液裝入無(wú)RNase玻璃器皿。嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，全部溶液均應(yīng)用0.1％DEPC于37℃處理12小時(shí)以上，然后于100℃加熱15分鐘或高壓滅菌15分鐘，去除殘余DEPC。核酸提取與鑒定第10頁(yè)

在包括RNA一切操作過(guò)程中，都應(yīng)戴一次性手套和口罩，應(yīng)勤換手套。2．RNA提取中RNase污染控制

核酸提取與鑒定第11頁(yè)第二節(jié)DNA提取

一、DNA常規(guī)提取真核生物DNA主要以核蛋白形式(DNP)存在于細(xì)胞核中，所以要從細(xì)胞中提取DNA時(shí)，必須先粉碎組織，裂解細(xì)胞膜和核膜，使核蛋白釋放，再把蛋白質(zhì)除去，再除去細(xì)胞中糖類，脂類、RNA等物質(zhì)，沉淀DNA,去除鹽類，有機(jī)劑等雜質(zhì),得到純化DNA。核酸提取與鑒定第12頁(yè)1、酚-氯仿提取法

核酸提取與鑒定第13頁(yè)2、濃鹽法

核糖蛋白（RNP）與脫氧核糖蛋白（DNP）在不一樣濃度NaCl溶液中溶解度顯著不一樣。DNP在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度最小，僅為水中1％。當(dāng)NaCl濃度增至1mol/L時(shí)，DNP溶解度比在水中大2倍。利用這一性質(zhì)可將DNP從破碎后細(xì)胞勻漿中分離出來(lái)，也能夠使DNP和RNP分離，DNP蛋白個(gè)別可用苯酚、SDS等其它方法將其除去。

核酸提取與鑒定第14頁(yè)3、玻璃棒纏繞法用鹽酸胍裂解細(xì)胞，然后將細(xì)胞裂解物小心鋪在離心管中乙醇上，用一個(gè)代溝或前端為U型玻璃棒在這兩層溶液交界面慢慢攪動(dòng)，沉淀出膠狀DNA纏繞在玻璃棒上。玻璃棒上DNA經(jīng)屢次乙醇浸泡并與室溫下蒸發(fā)乙醇，由膠狀逐步回縮，然后浸入TE緩沖液中，使其重新吸水膨脹而和玻璃棒分離。核酸提取與鑒定第15頁(yè)4、玻璃顆粒吸附法

首先利用含異硫氰酸胍細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，然后加入能夠與DNA結(jié)合玻璃顆粒緩沖液，經(jīng)沉淀搜集結(jié)合DNA玻璃顆粒，利用洗脫液進(jìn)行洗脫取得DNA。不但玻璃顆粒能夠和DNA結(jié)合，一定大小硅膠顆粒也能夠和DNA結(jié)合。核酸提取與鑒定第16頁(yè)二、質(zhì)粒DNA提取（1）是存在于細(xì)菌染色體外小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。（2）小1-3kb，大可達(dá)數(shù)百kb。（3）進(jìn)入細(xì)菌，可自我復(fù)制或表示。核酸提取與鑒定第17頁(yè)質(zhì)粒DNA提取有效方法方法：堿裂解法；氯化銫密度梯度分離法；煮沸裂解法等。全部分離質(zhì)粒DNA方法都包含3個(gè)基礎(chǔ)步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；搜集和裂解細(xì)菌；分離質(zhì)粒DNA(有時(shí)還要求純化質(zhì)粒DNA，依據(jù)試驗(yàn)所需)選擇哪一個(gè)方法主要取決于以下幾個(gè)原因：質(zhì)粒大小、大腸桿菌菌株、裂解后用于純化技術(shù)和試驗(yàn)要求。核酸提取與鑒定第18頁(yè)1、培養(yǎng)細(xì)菌和擴(kuò)增質(zhì)粒

用氯霉素抑制宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，從而抑制染色體復(fù)制和分裂；質(zhì)粒復(fù)制系統(tǒng)成份半衰期較長(zhǎng)，使質(zhì)粒得以擴(kuò)增。核酸提取與鑒定第19頁(yè)2、收獲細(xì)菌和溶菌細(xì)菌裂解三種方法：機(jī)械法（如超聲波等）化學(xué)試劑法（如SDS等）溶菌酶－化學(xué)試劑聯(lián)正當(dāng)（最常見）核酸提取與鑒定第20頁(yè)3、提取質(zhì)粒主要使染色體DNA與質(zhì)粒DNA分離

分離主要依據(jù)染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，而且染色體DNA被斷裂成線狀分子，但質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)加熱或用酸、堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA輕易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA在冷卻和回到中性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象。核酸提取與鑒定第21頁(yè)

當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠快速?gòu)?fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不復(fù)性而呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來(lái)（1）堿裂解法核酸提取與鑒定第22頁(yè)（2）氯化銫密度梯度分離法

EB分子可嵌入堿基對(duì)之間，使DNA解旋開環(huán)DNA或線性DNA存在游離末端易于解旋，可結(jié)合大量EB，DNA-EB復(fù)合物含EB越多，密度越小。閉環(huán)質(zhì)粒DNA沒有游離末端，不易解旋，結(jié)合少許EB，密度較大。在飽和EB條件下，質(zhì)粒DNA密度比斷裂染色體DNA密度大，經(jīng)氯化銫密度梯度離心，可分離提取質(zhì)粒DNA。核酸提取與鑒定第23頁(yè)（3）煮沸裂解法經(jīng)過(guò)加熱，使細(xì)菌裂解、蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。降低溫度，閉環(huán)質(zhì)粒DNA復(fù)性留于上清液，染色體DNA不能復(fù)性與變性蛋白質(zhì)形成沉淀，可經(jīng)過(guò)離心出去而分離。核酸提取與鑒定第24頁(yè)第三節(jié)RNA提取一、總RNA提取全部RNA提取過(guò)程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，即：①樣品細(xì)胞或組織有效破碎；②有效地使核蛋白復(fù)合體變性；③對(duì)內(nèi)源RNA酶有效抑制；④有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；⑤對(duì)于多糖含量高樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)有效除去。但其中最關(guān)鍵是抑制RNA酶活性。核酸提取與鑒定第25頁(yè)常見RNA酶抑制劑

①焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一個(gè)強(qiáng)烈但不徹底R(shí)NA酶抑制劑。②異硫氰酸胍：當(dāng)前被認(rèn)為是最有效RNA酶抑制劑。③氧釩核糖核苷復(fù)合物④RNA酶蛋白抑制劑(RNasin)⑤其它：SDS、尿素、硅藻土等對(duì)RNA酶也有一定抑制作用。核酸提取與鑒定第26頁(yè)RNA提取方法

1、異硫氰酸胍-氯化銫超速離心法

使用蛋白質(zhì)強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍裂解組織和有效抑制RNA酶活性，再進(jìn)行CsCl密度梯度超速離心，RNA沉淀于管底，而DNA與蛋白質(zhì)在上清液中。使用這種方法，不但能得到高質(zhì)量RNA，而且能同時(shí)分離出細(xì)胞染色體DNA。本法已成為提取哺乳動(dòng)物細(xì)胞RNA常規(guī)方法。

核酸提取與鑒定第27頁(yè)2、鹽酸胍-有機(jī)溶劑法鹽酸胍變性蛋白質(zhì)，抑制RNA酶，有機(jī)溶劑抽提去除蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)選擇性沉淀RNA分子而去除DNA。此法適合用于沒有超速離心設(shè)施情況下提取細(xì)胞總RNA，提取RNA質(zhì)量很好，但整個(gè)操作過(guò)程繁雜費(fèi)時(shí)。核酸提取與鑒定第28頁(yè)3、氯化鋰-尿素法利用高濃度尿素變性蛋白質(zhì)同時(shí)抑制RNA酶，氯化鋰選擇性沉淀RNA。其缺點(diǎn)是有時(shí)會(huì)存在DNA污染，氯化鋰沉淀RNA會(huì)丟失一些小分子RNA，如5sRNA等。優(yōu)點(diǎn)是快速、簡(jiǎn)便、產(chǎn)量高，尤其適合用于大量樣品少許組織細(xì)胞RNA提取。核酸提取與鑒定第29頁(yè)4、一步快速熱酚抽提法將異硫氰酸胍、巰基乙醇和去污劑N-十二烷基肌氨酸鈉（SLS）等聯(lián)合使用，抑制RNA降解，裂解細(xì)胞，增強(qiáng)對(duì)核蛋白復(fù)合物解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離；然后用苯酚、氯仿等抽提去除蛋白質(zhì)和DNA，乙醇或異丙醇沉淀純化RNA。此法操作簡(jiǎn)便快速，可在3小時(shí)以內(nèi)處理大批樣品，對(duì)大量或少許組織細(xì)胞RNA提取均甚適當(dāng)。核酸提取與鑒定第30頁(yè)

二、mRNA提取

從提取總RNA中分離mRNA，用Oligo（dT）-柱層析法分離：mRNA含polyA，在高鹽濃度條件下與Oligo（dT）結(jié)合，其它成份被洗掉，再經(jīng)過(guò)低鹽濃度洗脫mRNA而分離。核酸提取與鑒定第31頁(yè)第四節(jié)核酸判定一、核酸濃度檢測(cè)1、定磷法DNA和RNA中都含有磷酸，依據(jù)元素分析獲知RNA平均含磷量為9.4%，DNA平均含磷量為9.9%，所以可從樣品中測(cè)得含磷量來(lái)計(jì)算DNA或RNA含量。

2、定糖法RNA含核糖，DNA含有脫氧核糖，依據(jù)這兩種糖顏色反應(yīng)可對(duì)DNA和RNA進(jìn)行定量測(cè)定。核酸提取與鑒定第32頁(yè)3、紫外吸收法DNA和RNA在波長(zhǎng)260nm處有很高吸收峰值，用標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得在波長(zhǎng)260nm處，A260＝1時(shí)，樣品中雙鏈DNA濃度為50μg/ml，單鏈DNA或RNA濃度為40μg/ml。DNA(μg/μl)=A260×50×稀釋倍數(shù)/1000RNA（μg/μl）=A260×40×稀釋倍數(shù)/1000核酸提取與鑒定第33頁(yè)二、核酸純度檢測(cè)

核酸純度用A260/A280比值表示。OD260/OD280

＝1.8——為DNA純品OD260/OD280

＝1.8~2.0——為RNA純品核酸提取與鑒定第34頁(yè)三、核酸完整性檢測(cè)核酸樣本完整性和分子量可經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定（RNA常采取甲醛瓊脂糖變性凝膠電泳），溴化乙錠染色，紫外燈觀察。凝膠上DNA存在處可觀察到清楚條帶。完整性良好總RNA應(yīng)該清楚地看到28srRNA、18srRNA、5srRNA三條帶，其中28srRNA亮度應(yīng)為18srRNA兩倍，5srRNA較弱。

核酸提取與鑒定第35頁(yè)

基因組DNA抽提結(jié)果電泳圖核酸提取與鑒定第36頁(yè)總RNA抽提結(jié)果電泳圖mRNA核酸提取與鑒定第37頁(yè)第五節(jié)電泳依據(jù)電泳支持介質(zhì)分：瓊脂糖凝膠電泳：多用于判定較大核酸片段（0.1～60kb），尤其是分子量測(cè)定聚丙烯酰胺凝膠電泳：用于判定較小核酸片段，尤其是DNA測(cè)序核酸提取與鑒定第38頁(yè)電泳基礎(chǔ)原理電泳是指帶電顆粒在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移過(guò)程。許多主要生物分子，如蛋白質(zhì)、核酸等都含有可電離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定pH值下能夠帶正電或負(fù)電，在電場(chǎng)作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷性質(zhì)相反電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)作用下，因?yàn)榇蛛x樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)差異，使帶電分子產(chǎn)生不一樣遷移速度，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、判定或提純技術(shù)。

核酸提取與鑒定第39頁(yè)一、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是一個(gè)非常簡(jiǎn)便、快速、最常見分離、純化和判定核酸方法。瓊脂糖是從瓊脂中提純出來(lái)一個(gè)線性多糖。瓊脂糖凝膠制作是將適量瓊脂糖粉末懸浮于緩沖液中，加熱煮沸至溶液變?yōu)槌吻澹⑷肽０搴笫覝叵吕鋮s凝聚即成瓊脂糖凝膠。凝膠含有剛性濾孔，凝膠孔徑大小決定于瓊脂糖濃度，低濃度瓊脂糖形成較大孔徑，而高濃度瓊脂糖形成較小孔徑。核酸提取與鑒定第40頁(yè)瓊脂糖凝膠濃度與DNA分離范圍

瓊脂糖濃度(％)線型DNA分子分離范圍(kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2核酸提取與鑒定第41頁(yè)瓊脂糖凝膠電泳裝置核酸提取與鑒定第42頁(yè)DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不一樣DNA分子量大小及構(gòu)型不一樣，電泳時(shí)泳動(dòng)率就不一樣，從而分出不一樣區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。因而就可依據(jù)DNA分子大小使其分離。核酸提取與鑒定第43頁(yè)RNA能夠使用非變性或變性凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。在非變性電泳中，能夠分離混合物中不一樣分子量RNA分子，不過(guò)無(wú)法確定分子量。只