如何養(yǎng)好懸浮細(xì)胞

最近有很多小伙伴向小尚訴苦：“懸浮細(xì)胞太難養(yǎng)了，操作不方便，總感覺(jué)長(zhǎng)得很慢！”其實(shí)呀，只要掌握訣竅，懸浮細(xì)胞也可以輕松培養(yǎng)。小尚多年培養(yǎng)80余種懸浮細(xì)胞，精心總結(jié)了這份懸浮細(xì)胞培養(yǎng)指南，相信肯定能幫到你。1.選擇合適的容器培養(yǎng)懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，需要選擇合適的容器，就像選擇一個(gè)合適的家一樣。但家并不是越大越好，對(duì)于初期擴(kuò)增培養(yǎng)，較小的容器往往具有更好的培養(yǎng)效果，如T25培養(yǎng)瓶、10cm培養(yǎng)皿。等到細(xì)胞數(shù)量足夠多時(shí)，再轉(zhuǎn)移至更大的容器中進(jìn)行培養(yǎng)。2.密切關(guān)注細(xì)胞的密度懸浮細(xì)胞有著較顯著的密度依賴性，密度越低細(xì)胞生長(zhǎng)速度越慢，有些較難養(yǎng)的懸浮細(xì)胞在低密度時(shí)可能會(huì)死亡。因此接種密度不可過(guò)低，30-50萬(wàn)細(xì)胞/ml為宜。當(dāng)然密度也不是越高越好，一般來(lái)說(shuō)，密度達(dá)到80萬(wàn)細(xì)胞/ml就可以傳代了，最好不超過(guò)100萬(wàn)。綜上，推薦培養(yǎng)時(shí)密度控制在30-100萬(wàn)細(xì)胞/ml。Q：沒(méi)有計(jì)數(shù)板或計(jì)數(shù)儀怎么估算懸浮細(xì)胞的密度？A：對(duì)于單個(gè)分散生長(zhǎng)的細(xì)胞，將細(xì)胞置于顯微鏡下靜置10min，等待細(xì)胞沉底，隨后用4x或10x倍鏡觀察，若細(xì)胞幾乎鋪滿整個(gè)視野，密度一般已經(jīng)達(dá)到80-100萬(wàn)細(xì)胞/ml（圖1）圖1.THP-1細(xì)胞（10x物鏡）A：對(duì)于聚團(tuán)生長(zhǎng)的細(xì)胞，難以估算細(xì)胞數(shù)量，主要看團(tuán)塊數(shù)量和大小。若10x倍物鏡下觀察每個(gè)視野都有較多、較大的細(xì)胞團(tuán)，可以進(jìn)行傳代。（圖2）圖2.NK92MI細(xì)胞（10x物鏡）3.穩(wěn)定的環(huán)境懸浮細(xì)胞喜歡安穩(wěn)的生活環(huán)境，不喜歡經(jīng)常被打擾。若是頻繁的將細(xì)胞拿出觀察，造成溫度、CO2濃度、濕度、培養(yǎng)基酸堿度的波動(dòng)，細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期需要的時(shí)間就會(huì)變長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度減慢。建議一天觀察一次為宜，對(duì)于難養(yǎng)的懸浮細(xì)胞，可以兩天觀察一次。4.懸浮細(xì)胞害怕機(jī)械損傷懸浮細(xì)胞對(duì)吹打造成和離心帶來(lái)的機(jī)械損傷比較敏感，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)很慢或者狀態(tài)不好的時(shí)候，應(yīng)該盡量避免離心和吹打，換液和傳代都可采用不離心的方法（圖3-4）。圖3.半換液示意圖圖4.傳代示意圖5.細(xì)胞聚團(tuán)是正常的嗎？不同情況而定。有些懸浮細(xì)胞天生就是聚團(tuán)生長(zhǎng)的，如NK92MI等（圖2）。而單個(gè)分散生長(zhǎng)的懸浮細(xì)胞偶爾也會(huì)出現(xiàn)一些十幾個(gè)細(xì)胞聚集成的小團(tuán)（圖5），這也是正?，F(xiàn)象，不必把團(tuán)塊吹開(kāi)（除非實(shí)驗(yàn)需要）。圖5.偶有小聚團(tuán)是正?，F(xiàn)象然而本該單個(gè)分散生長(zhǎng)的細(xì)胞出現(xiàn)大量的巨大團(tuán)塊就要引起注意了，這可能是細(xì)胞不適應(yīng)環(huán)境或者受到損傷的表現(xiàn)。需檢查培養(yǎng)基配方是否正確，使用的血清是否合適，是否因?yàn)榇荡?、離心等過(guò)程中細(xì)胞受到了機(jī)械損傷。Q：異常大量聚團(tuán)的細(xì)胞就只能丟棄嗎？A：建議不要立刻丟棄?？蓪⒓?xì)胞離心收集起來(lái)，用新鮮培養(yǎng)基重懸吹散細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色法確認(rèn)細(xì)胞活性。若活細(xì)胞較多，可以繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)嘗試優(yōu)化培養(yǎng)條件（如更換血清品牌、減少吹打離心頻率等）改善細(xì)胞聚團(tuán)問(wèn)題。6.懸浮細(xì)胞出現(xiàn)貼壁怎么處理？懸浮細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)少量貼壁是正?，F(xiàn)象，無(wú)需特殊處理。在同一器皿中靜置培養(yǎng)時(shí)間越久，出現(xiàn)貼壁的細(xì)胞可能就越多，可試著用手掌輕拍瓶身側(cè)面（勿用力敲打），將松散貼壁的細(xì)胞拍起來(lái)。如果出現(xiàn)少量貼壁非常緊并且出現(xiàn)上皮樣形態(tài)的細(xì)胞，這可能和培養(yǎng)器皿材質(zhì)或細(xì)胞特性有關(guān)。可將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新瓶中培養(yǎng)，舍棄異常貼壁的細(xì)胞。如果出現(xiàn)大量貼壁，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞也狀態(tài)不佳，則需要檢查培養(yǎng)基成分是否有誤，或者存在污染等異常情況。7.細(xì)胞碎片怎么處理？在培養(yǎng)過(guò)程中，常常會(huì)有少量細(xì)胞死亡從而產(chǎn)生碎片，然而懸浮細(xì)胞并不能像貼壁細(xì)胞那樣通過(guò)換液就將碎片清干凈。通常，為了保持細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境穩(wěn)定，不會(huì)對(duì)少量的細(xì)胞碎片進(jìn)行特殊處理，少量碎片的存在也不影響細(xì)胞生長(zhǎng)。隨著培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)量越來(lái)越多，碎片也可能逐漸減少（碎片自己降解或被細(xì)胞吸收）。當(dāng)碎片特別多時(shí)，待到細(xì)胞密度較大時(shí)，可以進(jìn)行低速離心（800-900rpm，3min）去除部分碎片。低速離心將損失一些細(xì)胞，因此不要在細(xì)胞數(shù)量較少時(shí)使用這種方式去除碎片。8.細(xì)胞形態(tài)不圓潤(rùn)不均勻是正常的嗎？懸浮細(xì)胞不一定都是規(guī)則圓形的細(xì)胞，需結(jié)合生長(zhǎng)速度和細(xì)胞整體狀態(tài)來(lái)確定細(xì)胞狀態(tài)。有些種類的懸浮細(xì)胞本身形態(tài)不均一；而有些細(xì)胞在受到較為劇烈的環(huán)境變化后（比如長(zhǎng)途運(yùn)輸）形態(tài)可能發(fā)生輕微改變。若細(xì)胞邊緣平滑發(fā)