生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座

第十三章

生化藥品和基因工程藥品分析概念生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第1頁1、了解生化藥品、基因工程藥品定義、種類。2、熟悉質量檢驗基本程序與方法。3、掌握生化藥品、基因工程藥品特點及慣用化學定量分析方法。本章學習關鍵點生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第2頁人類用于預防、治療和診療疾病三大主要藥品第一節(jié)概述化學藥品生物藥品中藥生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第3頁生物藥品定義：利用生物體、生物組織或器官等成份，綜合利用生物學、生物化學、微生物學、免疫學、物理化學和藥學原理與方法制得一大類藥品。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第4頁生物藥品分類：生化藥品生物技術藥品生物制品從生物體分離純化制得生化基本物質，以及用化學合成、微生物合成或當代生物技術制得一類藥品。利用生物體或其組成部分發(fā)展產品技術體系即當代生物技術研制藥品稱之。應用普通或基因工程、細胞工程、蛋白質工程、發(fā)酵工程等生物技術取得微生物、細胞及各種動物和人源組織和體液等生物材料制備，用于人類疾病預防、治療和診療藥品。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第5頁一、生化藥品和基因工程藥品定義1、生化藥品定義從動物、植物及微生物提取，也可用生物－化學半合成或用當代生物技術制得生命基本物質及其衍生物、降解物以及大分子結構修飾物等。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第6頁2、基因工程藥品定義先確定對某種疾病含有預防和治療作用蛋白質，然后將控制該蛋白質合成過程基因進行分離、純化或人工合成，利用重組DNA技術加以改造，最終將該基因導入能夠大量生產受體細胞中不停繁殖或表示，并能進行大規(guī)模生產含有預防和治療這種疾病蛋白質，經過這種方法生產藥品稱之。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第7頁1、氨基酸、多肽與蛋白質類藥品二、生化藥品和基因工程藥品種類（一）生化藥品種類（1）氨基酸及其衍生物：①單氨基酸：亮氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、色氨酸、賴氨酸、甘氨酸等。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第8頁②氨基酸衍生物：N-乙酰-L-半胱氨酸、S-氨基甲酰半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸、谷胺酰胺、S-羥色氨酸。③復合氨基酸注射液：3S、6S、9S、11S、13S、14S、15S、17S、18S復合氨基酸注射液。（S代表氨基酸種類）生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第9頁（2）多肽類藥品：①垂體多肽：促腎上腺皮質激素、促胃液素、加壓素。②消化道多肽：促胰液素（胰泌素）、胃泌素、抑胃肽。③下丘腦多肽：促甲狀腺素釋放激素、促性腺激素釋放激素、生長激素釋放激素。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第10頁④腦多肽：由人及動物腦和腦脊液中分離出來多肽、蛋氨酸腦啡肽和亮氨酸腦啡肽等。⑤激肽類：血管擔心肽I、II、III等活性肽。⑥其它肽類：谷脫甘肽、降鈣素、睡眠肽、松果肽、血活素（分子量為3000肽為主成份)。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第11頁（3）蛋白類藥品豬或牛纖維蛋白原、纖維蛋白、胃膜素（糖蛋白）、水蛭素、肝細胞生長因子；屬蛋白質類激素還有生長素、催乳素、促甲狀腺素、促泡激素（FSH）、促黃體激素（LH）；植物起源蛋白類藥品有植物凝集素、天花粉蛋白、蓖麻和相思豆毒蛋白等。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第12頁2、酶類藥品（1）助消化酶類：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶、麥芽淀粉酶。（2）蛋白水解酶類：溶菌酶、胰DNA酶、木瓜蛋白酶、膠原蛋白酶。（3）凝血酶及抗栓酶：凝血酶（豬、牛血）、纖溶酶、尿激酶、蛇毒凝血酶。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第13頁（4）抗腫瘤酶類：L-天門冬酰胺酶、甲硫氨酸酶、組氨酸酶、谷氨酸胺酶。（5）其它酶類：細胞色素C、超氧化物歧化酶（SOD）、RNA酶、青霉素酶。（6）輔酶：CoA、黃素單核苷酸（FMN）、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。

生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第14頁3、多糖類藥品（1）肝素、硫酸軟骨素A和C、硫酸皮膚素（硫酸軟骨素B）、硫酸角質素、透明質酸等。（2）類肝素（酸性粘多糖）、鹿茸多糖、殼聚多糖、右旋糖苷、靈芝多糖、豬苓多糖、人參多糖、黃芪多糖等。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第15頁4、脂質類藥品卵磷脂、腦磷脂、膽固醇、麥角固醇、B谷固醇、膽汁酸（膽酸與甘氨酸或牛黃酸結合物）、鵝脫氧膽酸、膽紅素、原葉琳、血葉琳、亞油酸、花生四烯酸、五-六烯酸、前列腺素系列（PGE1、PGE2、PGE2a和PG12）。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第16頁5、核酸類藥品RNA（包含iRNA-免疫核糖核酸）、DNA（脫氧核糖核酸）、聚肌苷酸、巰基聚胞苷酸、cAMP、AMP、肌苷。另外，有核酪制劑，6-巰基嘌呤、6-硫代嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、5-碘苷和無環(huán)鳥苷等。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第17頁二、基因工程工藥品種類1、激素類及神經遞質類藥品（1）人生長激素釋放抑制因子（2）人胰島素（3）人生長激素2、細胞因子類藥品（1）人干擾素生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第18頁（2）人白細胞介素（3）集落刺激因子（4）促紅細胞生長素3、酶類及凝血因子類藥品單克隆抗體、疫苗、基因治療藥品、白介素、生長因子、反義藥品、腫瘤壞死因子等。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第19頁1、共同特點：含有一定生物活性或生理功效，能夠參加、影響和調控人體代謝和生理功效，對于一些疾病治療含有針對性強、毒副作用小、易為人體所吸收等特點。三、生化藥品和基因工程藥品特點生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第20頁2、分子量不是定值除氨基酸、核苷酸、輔酶及甾體激素等屬化學結構明確小分子化合物外，大部分為大分子物質，其分子量普通幾千至幾十萬。對大分子藥品而言，即使組分相同，往往因為分子量不一樣而產生不一樣生理活性。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第21頁

3、結構確證難在這類藥品中，因為有效結構或分子量不確定，其結構確實證極難沿用元素分析、IR、UV、NMR、MS等方法加以證實，往往還要用生化法如氨基酸序列等法加以證實。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第22頁4、全過程質量控制這類藥品對熱、酸、堿、重金屬以及pH較敏感，需對原材料、生產過程和最終產品進行質量控制。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第23頁5、生物活性檢驗在制備多肽或蛋白質類藥品時，有時因工藝條件改變，造成蛋白質失活。所以，除了用通常采取理化法檢驗外：尚需用生物檢定法進行檢定，以證實藥品生物活性。

生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第24頁6、安全性檢驗因為這類藥品性質特殊，生產工藝復雜，易引入特殊雜質和污染物，故常需做安全性檢驗。7、效價測定對酶類藥品需進行效價測定或酶活力測定，以表明其有效成份含量高低。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第25頁第二節(jié)質量檢驗基本程序與方法

一、判別試驗（一）理化判別法利用化學法、物理法及生物學方法來確證生化藥品真?zhèn)?。用標準品或對照品在同一條件下進行對照試驗。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第26頁1、化學反應法通常利用藥品與某試劑在一定條件下反應，生成有顏色產物或沉淀進行判別。比如，溶菌酶判別采取呈色法；胃蛋白酶判別采取沉淀法。2、HPLC法生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第27頁3、UV法三磷酸腺苷二鈉分子中含有共軛系統(tǒng)，能吸收紫外光。本品0.01mol／L鹽酸水溶液（20μg／ml），在（257±1）nm波優(yōu)點有最大吸收。A250nm／A260nm值應為0.17～0.27。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第28頁（二）生化判別法

1、酶法：尿激酶是專屬性較強蛋白水解酶，依據(jù)尿激酶能激活牛纖維蛋白溶酶原，而含有相同作用鏈激酶不能激活牛纖維蛋白溶酶原而加以區(qū)分，并用直接觀察溶解纖維蛋白作用氣泡上升法作為判斷指標。

生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第29頁2、電泳法肝素判別采取糖凝膠電泳法：肝素是由D-硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子間組成酸性粘多糖，其水溶液帶強負電荷，于瓊脂凝膠板上，在電場作用下，向正極方向移動，與肝素國家標準品對照，其移動位置應相一致。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第30頁3、樣品脫鹽后等電點聚焦法測定測定藥品等電點（為出現(xiàn)多條區(qū)帶多個等電點），同批次同一產品等電點應相同，表明其工藝穩(wěn)定。（三）生物判別法：利用生物體進行試驗來判別藥品。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第31頁二、雜質檢驗（一）普通雜質檢驗檢驗項目包含氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度、溶液澄清度或溶液顏色、水分及干燥失重、熾灼殘渣等。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第32頁（二）特殊雜質檢驗許多藥品是從生物組織中提取或用微生物發(fā)酵法制得，藥品中易殘余一些雜質或其它成份。1、原料藥純度分析2、生產過程中雜質檢驗生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第33頁三、安全性檢驗（一）熱原檢驗法（家兔、鱟試劑）（二）異常毒性試驗：用一定劑量藥品按指定操作方法和給藥路徑給予要求體重某種試驗動物，觀察其急性毒性反應。反應判斷以試驗動物死亡是否為終點。

生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第34頁（三）過敏試驗（檢驗異性蛋白）藥品中若夾雜有異性蛋白，在臨床使用時易引發(fā)病人各種過敏反應，輕者皮膚出現(xiàn)紅斑或丘疹，嚴重者可出現(xiàn)窒息、發(fā)結、血管神經性水腫、血壓下降，甚至休克和死亡。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第35頁（四）降壓物質檢驗法降壓物質是指一些藥品中含有能造成血壓降低雜質，包含組胺、類組胺或其它造成血壓降低物質。起源：用動物臟器或組織為原料制備生化藥品，正常組織內存在組胺及部分氨基酸脫羧形成組胺、酪胺等膠類物質。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第36頁（五）無菌檢驗法（檢驗活菌）因為許多藥品是在無菌條件下制備，且不能高溫滅菌。所以，無菌檢驗就更有必要。中國藥典中幾乎全部注射用藥如注射用尿激酶等，均做無菌檢驗。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第37頁1、無菌檢驗基本步驟：①培養(yǎng)基制備，為細菌生長、繁殖提供所必需營養(yǎng)物質─碳源、氮源、維生素、礦物質等。②選擇對照用菌液，供對照試驗用。③詳細檢驗，如接種、培養(yǎng)等操作。④結果判斷，得出陰性或陽性結論。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第38頁2、注意事項：①無菌檢驗全部過程應嚴格恪守無菌操作法，包含對操作環(huán)境、試驗材料及用具酶滅菌等，預防微生物污染。②應防止在有抑菌條件下操作。③從事無菌操作人員應具備微生物學基礎知識及一定工作經驗，不然要經過無菌技能培訓，方能從事此工作。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第39頁（六）基因工程藥品中可能雜質與污染物檢驗可能雜質：殘留DNA、宿主細胞蛋白質、內毒素等；主要污染物：微生物、熱原、病毒等。主要檢驗項目：外源性DNA、其它外源性雜質測定生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第40頁（七）致突變試驗包含：微生物回復突變試驗、哺乳動物培養(yǎng)細胞染色體畸變試驗、嚙齒動物微核試驗等。（八）生殖毒性試驗包含：普通生殖毒性試驗、圍生期毒性試驗。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第41頁四、含量（效價）測定含量表示方法百分含量，適合用于結構明確小分子藥品或經水解后變成小分子藥品。生物效價或酶活力，適合用于酶類、蛋白質類等藥品。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第42頁（一）含量測定1、HPLC法2、SDS法（二）效價測定：采取國際或國家參考品，或經國家檢定機構認可參考品，以體內或體外法測定其生物學活性，并標明其活性單位。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第43頁第三節(jié)慣用定量分析方法及其應用一、理化法（一）化學分析法1、重量法：依據(jù)樣品中分離出單質或化合物重量測定所含成份含量。（1）提取法（2）揮發(fā)法（3）沉淀法生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第44頁（二）電化學分析法

離子選擇性電極：測量離子活度指示電極。

2、滴定分析法：依據(jù)樣品中一些成份與標準溶液能定量地發(fā)生酸堿中和、氧化還原或絡合反應等進行測定。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第45頁（三）光譜分析法1、比色法：樣品與顯色劑可發(fā)生顏色反應，依顏色反應強度測定含量。如蛋白質含量測定，可利用蛋白質與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反應，而進行定量測定。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第46頁2、UV法：樣品或轉化后產物在某一波優(yōu)點有最大吸收，在一定濃度范圍內，其濃度與吸收度成正比，則可進行定量測定。如蛋白質在280nm左右有最大吸收

。3、熒光分光光度法：依據(jù)物質被UV光照射后產生熒光強度進行定量測定。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第47頁（四）色譜分析法1、HPLC法（1）RP-HPLC法：適合用于肽類、氨基酸、蛋白質和多糖測定，如生白能。固定相：C8、C18烷基硅烷鍵合相流動相：甲醇-水、乙腈-水（甲醇）、乙腈-緩沖液生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第48頁（2）高效離子交換色譜法（HPIEC）HPIEC特點以下：①蛋白質、多肽分離是依據(jù)其對應離子化程度而進行。②分離過程是以鹽濃度增大梯度洗脫法進行③柱效中等并具較高質量活性回收。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第49頁（3）高效凝膠過濾色譜法（HPGFC）HPGFC特點以下：①活性蛋白質可得以回收。②分離是在固定百分比水溶液中進行。③分離是依據(jù)蛋白質或多肽在溶液中對應有效粒徑而進行。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第50頁2、高效毛細管電泳法（HPCE）HPCE是依據(jù)帶電組分在管中因為其所帶電荷和分子量大小，即荷質比不一樣產生不一樣遷移速度而分離。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第51頁類型酶活力測定法：以酶為分析對象，測定樣品中某種酶活力或活性，并用活力單位和比活性表示

。酶分析法：以酶為分析工具或分析試劑，測定樣品中酶以外其它物質含量。二、酶法生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第52頁（一）酶活力測定法1、定義：酶活力是指酶催化一定化學反應能力。酶活力測定實際上是測定一個被酶所催化化學反應速度─能夠用單位時間反應底物降低或產物增加來表示。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第53頁2、方法（1）終點法：在適當條件下，把酶和底物混合，測定生成一定量產物所需時間。（2）將酶和底物混合后隔一定時間，間斷地或連續(xù)地測定反應連續(xù)改變。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第54頁（3）將酶與底物混合后，讓其反應一定時間，然后停頓反應，定量測定底物降低或產物生成量。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第55頁（二）酶分析法1、動力學分析法：

經過條件控制，分別使底物、輔酶活化劑或抑制劑濃度在酶反應中起決定反應速度主導作用。則酶反應速度和上述對應原因濃度間將含有確定百分比關系，經過測定酶反應速度即可求出它們濃度。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第56頁2、總變量分析法（平衡法或終點法）：

依據(jù)被測物質（底物）性質，選擇適宜分析工具酶對該物質進行作用，在反應完成后，借助理化方法測出其總改變量，并參考反應平衡點，計算出被測物實際含量或濃度。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第57頁三、電泳法（一）基本原理電泳法是指帶電微粒如蛋白質、核苷酸、其它微粒分子或離子在電場作用下，向其對應電極方向按各自速度泳動而使