PCR實(shí)驗(yàn)室如何防止新冠病毒核酸檢測(cè)假陽(yáng)性

2/2PCR實(shí)驗(yàn)室如何防止新冠病毒核酸檢測(cè)假陽(yáng)性核酸檢測(cè)是新型冠狀病毒檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法是臨床檢測(cè)常用方法，隨著各級(jí)實(shí)驗(yàn)室該方法的廣泛使用，大批量樣本的臨床檢測(cè)，假陽(yáng)性也是不容忽視的問(wèn)題。熒光定量PCR假陽(yáng)性簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是在不該出現(xiàn)熒光信號(hào)的樣本中出現(xiàn)了熒光信號(hào)，導(dǎo)致誤判斷陽(yáng)性結(jié)果。出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因主要有以下幾個(gè)方面:一、引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的基因序列。但在臨床實(shí)際中，由于基本使用的是成品試劑盒，引物設(shè)計(jì)不合適的情況一般不會(huì)出現(xiàn)，但個(gè)別廠家試劑仍存在非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象，建議在使用前進(jìn)行性能評(píng)價(jià)，比對(duì)篩選。二、靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染，這種污染有兩種原因：1.是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染導(dǎo)致假陽(yáng)性。2.是空氣中的小片段核酸污染，雖然這些小片段比靶基因序列短，但有一定的同源性?；ハ嗥唇雍笈c引物互補(bǔ)結(jié)合，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生。在規(guī)范操作的前提下，應(yīng)該盡量避免第二種情況的發(fā)生。三、標(biāo)本間交叉污染：標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染；標(biāo)本核酸模板在提取過(guò)程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。

四、PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過(guò)程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。五、實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染：試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照參與核酸提取過(guò)程造成交叉污染，一些試劑盒為了監(jiān)控核酸提取過(guò)程的質(zhì)量，要求將試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照（含有目的基因的假病毒）與樣本一起進(jìn)行核酸提取，自動(dòng)化的核酸提取儀由于加溫、振動(dòng)等過(guò)程，在操作過(guò)程中氣溶膠會(huì)可能會(huì)污染提取儀。有的實(shí)驗(yàn)室可能會(huì)將提取的核酸樣本板加膜保存，以備擴(kuò)增，再次打開(kāi)封膜的樣本板時(shí)可能會(huì)造成交叉污染。因此，不建議對(duì)提取后的樣本核酸封膜保存，最好立即檢測(cè)，同時(shí)，應(yīng)對(duì)每一批提取后的儀器用75%酒精擦拭。當(dāng)PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性的時(shí)候，我們常常會(huì)考慮是不是引物、反應(yīng)液、移液器等污染模板，然后需要一一排查，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。其實(shí)產(chǎn)生這一現(xiàn)象最常見(jiàn)的原因是核酸氣溶膠。離心機(jī)離心、劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管、PCR開(kāi)蓋、移液器的反復(fù)吹打等會(huì)產(chǎn)生空氣與液體表面摩擦的情況，都會(huì)產(chǎn)生核酸氣溶膠，也就是實(shí)驗(yàn)室里（或移液器腔內(nèi)）彌漫著含有長(zhǎng)短不一核酸片段的小顆粒，這些小顆粒沉降到樣本中導(dǎo)致最后擴(kuò)增出了假陽(yáng)性熒光曲線。

可想而知，這些核酸小顆粒還會(huì)落到實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、PCR儀、移液器、吸頭盒等等地方，如果我們不注意，這些核酸小顆粒就會(huì)日積月累地積聚，當(dāng)實(shí)驗(yàn)室里核酸氣溶膠的濃度達(dá)到一定濃度，就會(huì)造成實(shí)驗(yàn)室的污染進(jìn)而產(chǎn)生PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性。我們平常工作應(yīng)在以下幾方面避免核酸氣溶膠污染的產(chǎn)生:一、試劑要提前分裝：反應(yīng)液盡量分裝，避免多次取用，引物與探針稀釋到一定濃度后分裝，保證有備份，以防一管污染之后全軍覆沒(méi)；二、水需要使用無(wú)RNA酶的去離子水，可以從試劑公司購(gòu)買專用水；三、加樣時(shí)動(dòng)作要小心輕柔，防止將模板吸入加樣器內(nèi)或?yàn)R出離心管外，加樣順序是最后加模板。四、所用離心管及加樣吸頭均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，使用前反應(yīng)管用紫外線照射，以破壞存在的核酸。

在實(shí)驗(yàn)室日常管理方面應(yīng)注意以下幾方面：一、實(shí)驗(yàn)室至少要分三區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)、模板制備區(qū)、產(chǎn)物擴(kuò)增分析區(qū)，各區(qū)配有單獨(dú)移液器（有條件的每個(gè)區(qū)都應(yīng)在不同的房間，這樣才能最大限度的避免污染）。二、實(shí)驗(yàn)室要注意風(fēng)向和各區(qū)的壓力差，相對(duì)壓差也應(yīng)從試劑準(zhǔn)備至產(chǎn)物分析方向由高到低的過(guò)程;三、定期清潔實(shí)驗(yàn)室，不同的區(qū)各有自己專用的抹