高三生物二輪復(fù)習(xí)課件PCR技術(shù)及應(yīng)用

聚焦“PCR技術(shù)”張曉宇高三生物組

應(yīng)用類型條件優(yōu)化基本概念原理、條件、基本過程溫度時間的控制、引物的設(shè)計僅擴(kuò)增、擴(kuò)增且截取、擴(kuò)增且延長、定點(diǎn)誘變、定量分析等目錄全稱：原理：操作環(huán)境：組分：步驟：優(yōu)點(diǎn)：與體內(nèi)DNA復(fù)制比較聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制、DNA的熱變性體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）模板（目的基因）、2種引物、4種脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合酶、含“Mg2+”緩沖溶液可以在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因變性——復(fù)性（退火）——延伸一、基本概念一、基本概念與體內(nèi)DNA復(fù)制比較PCR細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制反應(yīng)場所解旋方式引物酶新鏈延伸解旋酶催化細(xì)胞內(nèi)(主要在細(xì)胞核內(nèi))兩條新鏈都連續(xù)延伸單鏈DNA高溫解旋細(xì)胞外(在PCR擴(kuò)增儀內(nèi))耐高溫的DNA聚合酶單鏈RNA解旋酶、普通DNA聚合酶等半不連續(xù)復(fù)制(2022·全國乙卷)一、基本概念(2)為了確保新冠病毒核酸檢測的準(zhǔn)確性，在設(shè)計PCR引物時必須依據(jù)新冠病毒RNA中的__________________來進(jìn)行。PCR過程每次循環(huán)分為3步，其中溫度最低的一步是______。特異性核苷酸序列復(fù)性(3)通過PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性的擴(kuò)增出Wx基因的cDNA，原因是

。引物能與WX基因的cDNA特異性結(jié)合(2020·新高考Ⅰ)

(2022·山東卷)(1)研究者針對每個需要擴(kuò)增的酶基因設(shè)計一對______，利用PCR技術(shù)，在優(yōu)化反應(yīng)條件后擴(kuò)增得到目標(biāo)酶基因。引物(2022·廣東卷)（2021·全國卷）PCR技術(shù)可用于臨床的病原菌檢測。為檢測病人是否感染了某種病原菌，進(jìn)行了相關(guān)操作：①分析PCR擴(kuò)增結(jié)果；②從病人組織樣本中提取DNA；③利用PCR擴(kuò)增DNA片段；④采集病人組織樣本。回答問題(1)若要得到正確的檢測結(jié)果，正確的操作順序應(yīng)該是

（用數(shù)字序號表示）。(2)操作③中使用的酶是

，PCR反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、

三步，其中復(fù)性的結(jié)果是

。

(3)為了做出正確的診斷，PCR反應(yīng)所用的引物應(yīng)該能與

特異性結(jié)合。

(4)PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)是指

。該技術(shù)目前被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷等方面。一、基本概念④②③①耐高溫的DNA聚合酶延伸病原菌DNA在生物體外大量快速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)二、條件優(yōu)化溫度時間控制①解旋溫度影響擴(kuò)增的特異性；②退火溫度會影響引物與模板的配對，進(jìn)而會影響產(chǎn)物的特異性③延伸溫度影響Taq酶的活性④延伸時間與產(chǎn)物的特異性及產(chǎn)量有關(guān)（2021·湖北）某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶（引物與模板完全配對）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對）。為了減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是A.增加模板DNA的量 B.延長熱變性的時間C.延長延伸的時間 D.提高復(fù)性的溫度二、條件優(yōu)化D

BC二、條件優(yōu)化(2021·江蘇卷)引物設(shè)計二、條件優(yōu)化①引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列；②引物長度及GC含量合適，以保證合適的解鏈溫度；③引物在模板序列中的特異性；根據(jù)一段已知序列設(shè)計，達(dá)到相應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計的兩組引物（只標(biāo)注了部分堿基序列）都不合理（見圖2），請分別說明理由。①第1組：

；②第2組：

。二、條件優(yōu)化(2017·江蘇卷)引物Ⅰ與引物Ⅱ局部互補(bǔ)配對而失效引物Ⅰ′自身折疊后互補(bǔ)配對而失效三、應(yīng)用類型僅擴(kuò)增擴(kuò)增且截取擴(kuò)增且延長定點(diǎn)誘變定量分析特殊PCR技術(shù)三、應(yīng)用類型僅擴(kuò)增已經(jīng)獲得了目的基因全長序列，使用PCR技術(shù)擴(kuò)增該序列的操作以1個DNA分子為模板，進(jìn)行n次PCR循環(huán)?①至少需要多少個引物？②形成的DNA分子中含多少個引物1？③含引物1的單鏈有多少條？④含引物1的DNA分子有多少個？三、應(yīng)用類型2.擴(kuò)增且截取目的基因位于模板DNA分子中間位置，從模板DNA中截取目的基因并擴(kuò)增的操作。

BA.①+③

B.①+②

C.③+②

D.③+④三、應(yīng)用類型三、應(yīng)用類型3.擴(kuò)增且延長在引物的5′端增加若干堿基，獲得比模板DNA更長的產(chǎn)物分子的操作。通過設(shè)計引物來延長擴(kuò)增產(chǎn)物長度：添加限制酶切割位點(diǎn)，添加保護(hù)序列添加啟動子連接兩段目的基因片段等

三、應(yīng)用類型(2022·山東卷)5′端(2023·模擬卷)

5′端DNA合成新鏈的延伸方向是5‘→3’，不會影響目的基因的正常復(fù)制融合PCR技術(shù)是采用具有互補(bǔ)末端的引物，將不同來源的擴(kuò)增片段連接起來的方法，其過程如圖所示.(1)第一階段中PCR至少進(jìn)行____次循環(huán)，才能獲得含引物2且雙鏈等長的DNA，第二階段中兩DNA能成功"搭橋"連接的原因________________。(2)若通過融合PCR技術(shù)將啟動子、標(biāo)記基因、目的基因、終止子拼接起來，需要設(shè)計_____種引物，其中能夠起著"搭橋"作用的引物有____種.第二階段融合擴(kuò)增時____（需要、不需要）再次添加引物.三、應(yīng)用類型2堿基互補(bǔ)配對86不需要三、應(yīng)用類型4.定點(diǎn)誘變指在引物中改變個別堿基，造成擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生基因突變的操作。突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點(diǎn)，而這兩條引物有部分堿基（包括突變位點(diǎn)）是可以互補(bǔ)的。分別利用引物1和2/引物3和4進(jìn)行PCR后，得到的片段可以通過引物2和3互補(bǔ)堿基雜交，再在DNA聚合酶的作用下延伸，成為一條完整的DNA片段。最后，用引物1和4進(jìn)行擴(kuò)增得到含有突變位點(diǎn)的DNA片段。三、應(yīng)用類型重疊延伸PCR三、應(yīng)用類型bcab3不需要，可以分別以AB上鏈和CD下鏈為引物進(jìn)行延伸；①實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)誘變時,需要根據(jù)目的基因序列設(shè)計兩個常規(guī)引物和根據(jù)突變堿基序列所處位置設(shè)計兩個突變引物,圖中屬于突變引物的是

,通過PCRl能得到大量產(chǎn)物AB,該過程需要加入引物

,至少要經(jīng)過_____次復(fù)制可以得到產(chǎn)物AB。②用同樣的方法通過PCR2可以得到大量產(chǎn)物CD,然后取產(chǎn)物AB的上鏈和產(chǎn)物CD的下鏈再次進(jìn)行擴(kuò)增,即可得到突變產(chǎn)物AD,該過程是否需要加入引物?并說明原因_____________________________________________(2023·模擬卷)大引物PCR需要用到三條引物進(jìn)行兩輪PCR。第一輪PCR利用突變上游引物和常規(guī)下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到不完整的含有突變位點(diǎn)的DNA片段；第二輪PCR利用第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物中的一條DNA鏈作為下游大引物，它與常規(guī)上游引物一起擴(kuò)增得到完整的含有突變位點(diǎn)的DNA片段。三、應(yīng)用類型大引物PCR大引物PCR定點(diǎn)突變常用來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的功能變化。單核苷酸的定點(diǎn)誘變需進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)即可獲得,過程如圖所示。下列敘述不正確的是()。A.第一輪PCR過程中復(fù)性所用的溫度與第二輪PCR復(fù)性的溫度不一樣B.PCR擴(kuò)增的定點(diǎn)誘變產(chǎn)物通常需要連接到載體分子上才能表達(dá)出相應(yīng)的性狀,該定點(diǎn)誘變產(chǎn)物需具備啟動子、終止子等結(jié)構(gòu)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯C.第二輪PCR所用的引物是第一輪PCR的產(chǎn)物DNA的兩條鏈D.將某功能蛋白的第17位Cys(UGU)改造成Ser(UCU),屬于蛋白質(zhì)工程三、應(yīng)用類型C(2023·精煉案)三、應(yīng)用類型5.定量分析在PCR反應(yīng)體系中加入標(biāo)記物，從而測算PCR產(chǎn)物或模板的量的操作。常用的標(biāo)記物為熒光標(biāo)記三、應(yīng)用類型實(shí)時熒光定量PCRTaqMan探針是實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)中一種常用探針,其5’端接熒光基團(tuán)(R),3'端接淬滅劑(Q).探針完整時，R發(fā)出的熒光被Q吸收而不發(fā)熒光.PCR過程中,當(dāng)Taq酶遇到探針時會使探針?biāo)?R發(fā)出的熒光信號被相應(yīng)儀器檢測到,熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物數(shù)量完全同步三、應(yīng)用類型“實(shí)時熒光定量RT-PCR”是新冠疫情防控的一把利刃。TaqMan探針是實(shí)時熒光定量RT-PCR技術(shù)中一種常用探針（如圖1），其5末端連接熒光基團(tuán)（R），3末端連接淬滅劑（Q）。當(dāng)探針完整時，R發(fā)出的熒光信號被Q吸收而不發(fā)熒光。在PCR擴(kuò)增過程中，當(dāng)Taq酶遇到探針時會使探針?biāo)舛尫懦鲇坞x的R和Q，R發(fā)出的熒光信號被相應(yīng)儀器檢測到，熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物數(shù)量完全同步（如圖2）。請據(jù)圖回答：(1)結(jié)合圖1和圖2分析，“熒光RT-PCR技術(shù)”所用的試劑盒中通常都應(yīng)該含有______酶、______酶、TaqMan探針、引物、dNTP、Mg2+、緩沖劑系等。這種分子層面的熒光RT-PCR檢測具有特異性和靈敏性都很高的特點(diǎn)，主要與試劑盒中的______、______有關(guān)。逆轉(zhuǎn)錄TaqTaqMan探針引物(2)根據(jù)TaqMan探針功能分析，探針中堿基序列的設(shè)計應(yīng)主要依據(jù)____________。新冠病毒（nCoV-2019）是冠狀病毒大家庭中的新的一員，其堿基序列與引起SARS的冠狀病毒堿基序列有79.5%的相似性，與流感病毒堿基相似度也較高，因此在設(shè)計TaqMan探針時應(yīng)篩選出nCoV-2019特有序列，以避免______（填“假陰性”或“假陽性”）的出現(xiàn)。(3)根據(jù)圖1和圖2，Taq酶的除了能催化DNA子鏈的延伸，還能______________。若每分子探針?biāo)忉尫诺腞基團(tuán)熒光強(qiáng)度為定值a，則反應(yīng)體系中某時刻熒光信號強(qiáng)度（Rn）主要與______、________有關(guān)。新冠病毒RNA內(nèi)部的一段序列假陽性催化TaqMan探針?biāo)鈹U(kuò)增次數(shù)樣品初始量三、應(yīng)用類型6.特殊PCR不對稱PCR反向PCR巢式PCR①不對稱PCR三、應(yīng)用類型是擴(kuò)增單鏈DNA的一種方法，基本原理是采用不等量的一對引物產(chǎn)生大量的單鏈DNA，常見的為引物濃度不對稱PCR。兩引物的濃度不同，其中濃度低的為限制性引物，起決定性作用，只有當(dāng)限制性引物耗盡后才會開始大量產(chǎn)生單鏈DNA；濃度高的為非限制性引物。前10-15循環(huán)為雙鏈產(chǎn)物，而后為單鏈。三、應(yīng)用類型三、應(yīng)用類型(2023·模擬卷)目的基因表達(dá)檢測過程中需要大量探針,若僅擴(kuò)增探針這段單鏈,需要利用不對稱PCR,即采用不等量的一對引物,經(jīng)若干次循環(huán)后,低濃度的引物被耗盡,以后的探針循環(huán)只產(chǎn)生高濃度引物的延伸產(chǎn)物,結(jié)果產(chǎn)生大量的單鏈DNA。這兩種引物分別引物1引物2,為限制性引物與非限制性引物,其最佳比例一般為1:50~1:100。據(jù)此分析,圖3中的引物_____應(yīng)該為非限制性引物。假設(shè)反應(yīng)體系中原來有1個模板DNA分子,最初25個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)生雙鏈DNA,后15個循環(huán)均只擴(kuò)增一條鏈,則需要非限制性引物

個。1前25次需要非限制性引物和需要限制性引物一樣,也是=225一1個,后15次,需要利用前25次擴(kuò)增到的DNA為模板,需要非限制性引物=225×15,所以一共需要非限制性引物為225一1＋225×15=225×16-1=229—1(個)。229—1標(biāo)準(zhǔn)PCR用來擴(kuò)增位于兩條引物內(nèi)側(cè)的DNA片段，與此相反，反向PCR技術(shù)是用于擴(kuò)增一段已知DNA序列旁側(cè)的DNA序列。反向PCR技術(shù)是確定未知DNA片段的主要選擇手段。三、應(yīng)用類型②反向PCR用限制酶處理該DNA，隨后使用DNA連接酶將獲得的酶切產(chǎn)物環(huán)化，獲得已知序列兩側(cè)攜帶有未知序列的環(huán)狀DNA分子。以該已知序列為模板設(shè)計一對相反方向的特異性引物，該引物對已知序列反向，但對未知序列卻是相向的，從而得以擴(kuò)增出未知序列。三、應(yīng)用類型②④如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如下圖所示(以EcoRⅠ酶切為例)。若下表所列為已知的DNA序列和設(shè)計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是_____三、應(yīng)用類型(2020·江蘇卷)引物①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′②5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′③5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′(4)對PCR產(chǎn)物測序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結(jié)果正確的是___。A.5′—AACTATGCG－－－－AGCCCTT—3′B.5′—AATTCCATG－－－－CTGAATT—3′C.5′—GCAATGCGT－－－－TCGGG