馬病毒性動(dòng)脈炎檢疫技術(shù)規(guī)范

馬病毒性動(dòng)脈炎檢疫技術(shù)規(guī)范5病毒分離鑒定5.1儀器設(shè)備超凈工作臺(tái)或生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、液氮貯存罐，蔡氏濾器和微孔濾膜(0.22ym)、高壓滅菌鋼、離心機(jī)、超聲波破碎儀、微量細(xì)胞培養(yǎng)板(96孔)、微型振蕩器、微量可調(diào)移液器(200pL)、電子天平、細(xì)胞瓶和吸管(1mL,2mL,5mL,10mL)等。5.2試劑與材料MEM培養(yǎng)基、抗生素貯存液、細(xì)胞消化液、細(xì)胞培養(yǎng)皺和細(xì)胞維持液，1%細(xì)胞染色液，7.5%羧甲基纖維素、紅細(xì)胞裂解液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、兔腎細(xì)胞(RK-13)、馬病毒性動(dòng)脈炎病毒(EAV)標(biāo)準(zhǔn)病毒株(Bucyrus株)和各種常規(guī)試劑等，試劑配制見附錄A。5.3樣品采集與處理5.3.1樣品采集與運(yùn)送無菌采集動(dòng)物抗凝全血(不宜用肝素作抗凝劑),死胎或活產(chǎn)馬駒的腦、心、肺、肝、腎、脾和淋巴結(jié)等組織，公馬可采集精液。采集的樣品應(yīng)立即放入冰盒中，盡快運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。如果不能及時(shí)送往實(shí)驗(yàn)室，組織樣品冷凍于-20℃以下保存(抗凝全血樣品4℃保存)。5.3.2樣品處理5.3.2.1全血樣品的處理：取抗凝血加入2倍～3倍體積紅細(xì)胞裂解液，混勻靜止4min~5min,待紅細(xì)胞完全破碎，1500r/min離心5min,棄上清液除去破碎的紅細(xì)胞，得到白細(xì)胞沉淀(若仍有紅細(xì)胞，則重復(fù)上述步驟，直到紅細(xì)胞除盡),加入PBS緩沖液，制成白細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融兩次，低溫(-20℃)保存?zhèn)溆谩?.3.2.2動(dòng)物組織樣品的處理；無菌處理樣品，樣品稱量，置于無菌容器內(nèi)，加入少量維持液，用滅菌研槌研磨，制備成組織懸液。再加培養(yǎng)液，制成終濃度為10%的組織懸液。以2000r/min離心10min,收取上清液低溫(-20℃)保存?zhèn)溆谩?.3.2.3動(dòng)物精液的處理：將料液超聲波裂解三次(300w),每次15s;然后在4℃下2000r/min離心10min,沉淀精子細(xì)胞，取上清液低溫(-20℃)保存?zhèn)溆谩?.4病毒分離5.4.1將上述上清液或細(xì)胞懸液用維持液作倍比稀釋，無菌接種于已長(zhǎng)成單層的RK-13組胞瓶或細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)滴度接種兩瓶或兩孔。同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，單層細(xì)胞僅加維持液作細(xì)胞對(duì)照，用60倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)病毒接種作陽(yáng)性對(duì)照。5.4.2加蓋搖勻使之均勻分布于整個(gè)細(xì)胞層，置于5%二氧化碳路養(yǎng)箱中37℃吸附1h。5.4.3加入含0.75%羧甲基纖維素的培養(yǎng)液，置于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃維續(xù)培養(yǎng)，每日在顯微鏡下觀察細(xì)胞病變(CPE)情況(細(xì)胞圓縮、脫離、裂解)。5.4.4如果不出現(xiàn)CPE,應(yīng)盲傳2代～3代，即將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融兩次，再接種到單層細(xì)胞培養(yǎng)5d~7d后，用細(xì)胞染色液(工作液為0.1%福爾馬林緩沖結(jié)品紫溶液)染色。觀察細(xì)胞單層是否細(xì)胞壁不完整的死細(xì)胞區(qū)域。5.5結(jié)果判定檢查各種對(duì)照試驗(yàn)，細(xì)胞對(duì)照正常，無CPE;陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)明顯的CPE,說明試驗(yàn)成立。如果試驗(yàn)組出現(xiàn)明顯的CPE,表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、脫落、裂解，則判為病毒分離陽(yáng)性：如果沒有明顯的CPE,結(jié)晶紫染色后，細(xì)胞單層出現(xiàn)細(xì)胞酸不完整的死細(xì)胞區(qū)域，也判為病毒分離陽(yáng)性。5.6病毒鑒定用微量血清中和試驗(yàn)和熒光RT-PCR方法對(duì)分離的病毒進(jìn)行鑒定。6微量血清中和試驗(yàn)6.1儀器設(shè)備生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱、例置顯微鏡、液氮貯存罐、高壓滅菌鍋、微量細(xì)胞培養(yǎng)板、微型振蕩器，吸管(1mL,2mL,5m6.2試劑與材料細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞維持液、細(xì)胞消化液和抗生素貯存液等(試劑配制見附錄A),標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，陰性血清和被檢血清經(jīng)滅活備用(馬血清56℃滅活30min,驢、驟血清60℃滅活30min>,RK-13細(xì)胞和馬病毒性動(dòng)脈炎病毒(EAV)Bucyrus株或其他參考毒株。6.3操作方法6.3.1中和病毒滴廢(TCID)測(cè)定6.3.1.1中和病毒制備：將保存于液氮中的標(biāo)準(zhǔn)種毒EAVBucyrus株取出置于4℃緩慢融化，將融化的種毒用維持液作60倍稀釋后，取1mL接種于長(zhǎng)成單層RK-13細(xì)胞的細(xì)胞瓶中，37℃吸附1h。然后，先用維持液洗滌一次，再加入維持液，放置于37℃慍溫箱中培養(yǎng)36h~48h,當(dāng)50%～75%細(xì)胞出現(xiàn)CPE,即可收獲病毒培養(yǎng)液，分裝成1mL后凍存(-70℃以下)備用。6.3.1.2病毒滴度測(cè)定；在微量細(xì)胞培養(yǎng)板(96孔)每孔加25pL.細(xì)胞培養(yǎng)液，用病毒稀釋液將凍存病毒作10-1,10-3……10-”系列稀釋。每一稀釋度的病毒接種八孔，每孔25pL。正常細(xì)胞對(duì)照，四孔至八孔不加病毒，僅加25μL病毒稀釋液。每孔100pLRK-13細(xì)胞(5×10'/100pL),置37℃培養(yǎng)，48h后初判，72h終判。如細(xì)胞對(duì)照正常，接種病毒的細(xì)胞出現(xiàn)CPE(細(xì)胞圓縮、脫離、裂解),記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)。根據(jù)Karber法計(jì)算該批病毒的毒價(jià)(半數(shù)組織感染量TCID)。6.3.2微量中和試驗(yàn)6.3.2.1在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上每孔加25L細(xì)胞培養(yǎng)液。第一列四孔作被檢血清(毒性)對(duì)照，每孔加25pl.被檢血清，用移液器混勻后棄25μL;第二列四孔，每孔加25μL被檢血清，混勻后吸出25pL至第三孔，依次倍比稀釋到第四孔，即血清稀釋為1+2,114和118,每一稀釋度各四孔。6.3.2.2用病毒稀釋液將病毒稻釋成工作濃度200TCID,第一列四孔加病毒稻釋液(無病毒)作被檢血清(毒性)對(duì)照，第二至四列的各孔加25pL.稀釋的病毒。蓋上培養(yǎng)板，輕輕搖勻，放入5%二氧化碳保濕培養(yǎng)箱37℃解育1h。剛、陽(yáng)性血清對(duì)照(方法同上)。6.3.2.3病毒滴度驗(yàn)證試驗(yàn)，將工作濃度的中和病毒再作101、10-2、10-°稀釋，再加25pl,病毒稀釋液，每一稻釋度各四孔。正常細(xì)胞對(duì)照，留四孔至八孔，每孔僅加25μL的病毒稀釋液，不加血清和病毒。上述每孔加100μLRK-13細(xì)胞·細(xì)胞濃度為(5×10+/100pL)。故入5%二氧化碳培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，48h用例置顯微鏡進(jìn)行初步判定，72h后最終判定結(jié)果。6.4結(jié)果判定6.4.1檢查各種對(duì)照試驗(yàn)，細(xì)胞對(duì)照正常，無CPE;陰性血清出現(xiàn)明顯的CPE,表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、脫落、裂解：陽(yáng)性血清無CPE,細(xì)胞不出現(xiàn)病變。病毒滴度驗(yàn)證時(shí)滴度與原測(cè)定滴度相差應(yīng)在0.31ogm范圍內(nèi)，說明病毒稀釋濃度符合微量血清中和試驗(yàn)的工作濃度。被檢血清對(duì)照孔不出現(xiàn)病變，說明被檢血清無毒性反應(yīng)。6.4.2在各種對(duì)照成立的情況下，檢查各個(gè)被檢血清的CPE。如果出現(xiàn)CPE比例大于50%,則判為陰性孔；如果CPE比例少于50%或不出現(xiàn)CPE,則判為陽(yáng)性孔。以中和病毒感染性50%以上的最大稀釋度為該血清的中和抗體效價(jià)。6.4.3被檢血清孔1:4為陰性，判該動(dòng)物為血清學(xué)陰性。被檢血清1:4或更高稀釋度的孔為陽(yáng)性，判該動(dòng)物為血清學(xué)陽(yáng)性。被檢血清孔1:2為陽(yáng)性，或1:4孔出現(xiàn)的CPE不完全抑制(25%≤CPE≤50%)時(shí)，均判為可疑。出現(xiàn)可疑情況時(shí)，應(yīng)對(duì)可疑血清重試一次，最終判定結(jié)果以重試為準(zhǔn)。如果兩次試驗(yàn)均為可疑反應(yīng)，則該動(dòng)物視為血清學(xué)陽(yáng)性動(dòng)物處理。7酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)7.1儀器設(shè)備酶標(biāo)儀、96孔酶標(biāo)板，單孔道和多孔道可調(diào)微量移液器(1pL.、50yL、100pL、1000pL),振蕩培養(yǎng)箱等。7.2試劑與材料抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、陰性血清、被檢血清、PBS脂奶粉、H?O?和酶標(biāo)二抗等，試劑配制見附錄B,7.3操作方法7.3.1按照包被抗原所附說明書要求，用包被緩沖液稀釋抗原，包被96孔酶標(biāo)板，每孔100pL…,置4℃過夜。7.3.2倒掉孔內(nèi)液體，在吸水紙上吸干，每孔加滿洗滌液(PBS-T),靜置1min~2min后倒掉，吸干，重復(fù)洗五次。7.3.3加入封閉液，每孔100pl.,置37℃振蕩孵育90min,按7,3,2洗滌。置4℃冰箱備用。7.3.4被檢血清用籍釋液1?25稀釋，每份血清加兩孔，每孔100gL,每板均設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清(不需稀釋)及稀釋液對(duì)照各兩孔，每孔100pL。加樣完畢后放37℃振蕩培養(yǎng)箱作用18h~24h。7.3.5按7.3.2洗滌。7.3.6每孔加人用稀釋液稀釋至工作濃度的酶標(biāo)二抗100pL,置37℃培養(yǎng)箱作用30min,按7,3.2洗滌。7.3.7每孔加入底物溶液100pL,置室溫避光反應(yīng)5min,從加第一孔開始計(jì)時(shí)。7.3.8每孔加終止液100pL,在30min內(nèi)測(cè)定OD值。7.4結(jié)果判定判定標(biāo)準(zhǔn)：用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450nm下測(cè)定OD值。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照OD值≥0.5,陰性對(duì)照OD值<0.2,試驗(yàn)成立，否則試驗(yàn)不成立，應(yīng)重做。當(dāng)樣品OD值-陰性對(duì)照OD值>0.22,判為陽(yáng)性。當(dāng)樣品OD值-陰性對(duì)照OD值<0,18,判為陰性。當(dāng)0.18<樣品OD值-陰性對(duì)照OD值<0.22之間時(shí)，判為可疑，應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)，若仍為可疑，則判為陽(yáng)性。8熒光RT-PCR檢測(cè)方法8.1儀器設(shè)備熒光PCR檢測(cè)儀、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、混勻器、冰箱(2℃~8℃和-20℃兩種)、微量可調(diào)移液器(10pL.,100pL,1000pL)及配套吸頭，離心管(1.5ml)。8.2試劑與材料裂解液、三氟甲烷、異丙醇(-20℃預(yù)冷)、75%乙醇、DEPC水、引物、TagManome-stepRT-PCRMixReagents試劑盒等(參見附錄C)。除特別說明外，所用試劑均為分析純，所有試劑均用無RNA酶污染的容器(川DEPC水處理后高壓滅菌)分裝。8.3操作方法8.3.1樣品處理參考5.3.2,8.3.2樣本RNA的提取(按下述方法進(jìn)行或采用等效的其他RNA提取試劑與方法進(jìn)行)。8.3.2.1取n個(gè)(n-樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)1.5mL.滅菌離心管，作好標(biāo)記。8.3.2.2加入600pL.裂解液，然后分別加入待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各200pL(每份樣本換一個(gè)吸頭),再加入200μL三氯甲烷，混勻器上振滿混勻5%(不宜過于強(qiáng)烈，以免產(chǎn)生乳化層；也可用手顏倒8.3.2.3另外取x個(gè)1.5mL滅菌離心管，加入400μL異丙醇(-20℃預(yù)冷)作好標(biāo)記。吸取上步驟各管中的上清液至少500pL(注意不要吸出中間層》,加到相應(yīng)的管中，顛倒混勻。于12000r/min離心15min,輕倒去上清液：然后將離心管倒置于吸水紙上，盡量沾干液體(不同樣品應(yīng)在吸水紙的不同地方沾干):加入600pl.75%乙醇，顏倒洗滌。8.3.2.4于12000r/min離心15min,輕輕倒去上清液；然后將離心管倒置于吸水紙上，盡量沾干液體，不同樣品應(yīng)在吸水紙的不同地方沾干。8.3.2.54000r/min離心10s.將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干。每份樣本換一個(gè)吸頭，注意暖頭不要碰到有沉淀的一面。室溫干燥3min(不宜過于干燥，以免RNA不溶)。8.3.2.6加入20μL.DEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA。2000r/min離心5s,在冰上保存?zhèn)溆?注意：此時(shí)的RNA最易受RNA酶降解，請(qǐng)?jiān)?h內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若長(zhǎng)期保存應(yīng)故置在-70℃)。8.3.3.1擴(kuò)增試劑的準(zhǔn)備與加樣從試劑盒中取出相應(yīng)的各種試劑，在室溫下融化后，2000r/min離心5s。每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制見表1。A.77.5%羧甲基纖維素羧甲基纖維素粉7.5g溶解于100ml.雙蒸水，充分?jǐn)嚢杌靹颍?21℃高壓15min,分裝成5mL一瓶，4℃保存?zhèn)溆谩１４嫫诓怀^30d。9(規(guī)范性附錄)ELISA試驗(yàn)試劑的配制B.1包被緩沖液Nn?CO?0.9溶解后置于4℃冰箱。B.2磷酸鹽緩沖液(PBS)KH?PO?KC1先加適量的雙蒸水，完全溶解后加雙燕水