馬爾堡病檢測方法

本標準規(guī)定了馬爾堡病檢測方法。本標準適用于馬爾堡病抗體水平的檢測。2縮略語下列縮略語適用于本標準。ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗。IF免疫熒光試驗。MBG馬爾堡病。PBS磷酸鹽緩沖液。TCID?半數(shù)細胞感染量。CPE細胞病變效應(yīng)。將感染MBG病毒的細胞固定在帶面的載玻片上，在特異性抗體存在時，利用抗原抗體反應(yīng)具有高度特異性這一特點，再加上熒光色素標記的二抗，與結(jié)合在抗原上的抗體結(jié)合，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。將抗原包被在酶標板上，在特異性抗體存在時，抗原抗體結(jié)合，再加入酶標二抗，形成抗原抗體酶標二抗復(fù)合物。復(fù)合物中的酶在遇到相應(yīng)的底物時，催化底物分解，產(chǎn)生有色物質(zhì)。根據(jù)有色物質(zhì)的有無及其濃度，間接推測抗體是否存在以及其效價。4試劑和材料試劑和材料的準備如下：—MBG病毒：由指定單位提供；—包被用重組核蛋白抗原；由指定單位提供；—陰，陽性血清；由指定單位提供；——細胞抗原片；由指定單位提供或自制；2——被檢血清：用真空管采集血液，無菌分離血清，-20℃保存。用前60℃滅活1h;—酶標二抗：由指定單位提供；——底物溶液：由指定單位提供；——熒光素標記二抗：由指定單位提供；——細胞背養(yǎng)液、維持液、細胞分散液、包被液、洗滌液、稻釋液、終止液、PBS的配剖見附錄A。5器械和設(shè)備器械和設(shè)備的準備如下：——熒光顯微鏡；——酶標儀；——96孔酶標板；——帶圈載玻片；——單道和多道可調(diào)微量移液器20pL～200pL;——倒置顯微鏡；6操作方法6.1.1細胞抗原片的制備將Vero細胞培養(yǎng)成單層，用無菌PBS洗一遍，接種10*TCIDg/0.05mL～10TCIDa/0.05mL量的MBG病毒，6d后，20%～40%感染細胞出現(xiàn)CPE,例掉液體，用細胞分散液漂洗一次，加入細胞分散液，37℃作用3min~5min,待細胞開始脫落前將分散液倒掉，(150mL細胞瓶)加入10mL.PBS(含5%犢牛血清，防止細胞成團),用吸管用力吹打。取5mL細胞懸液加到直徑10cm的平皿內(nèi)，紫外線照射20min滅活病毒，將細胞懸液稀釋成1.2×10°個細胞/mL,在帶圈載玻片上每孔加0.015mL,保證大多數(shù)細胞未感染，少部分細胞為帶毒細胞。將載玻片空氣干燥后，丙酮固定10min,放在塑料袋內(nèi)，Co照射(200000rnds),以消除病毒的傳染性，后保存于一70℃?zhèn)溆茫陨喜襟E必須在生物安全N級實驗室內(nèi)進行，6.1.2正式試驗取出細胞抗原片，溫至常溫。將持檢血清和陰，陽性血清用PBS作1:2、1:4、1:8等倍比稀釋，加到細胞抗原片上，每個稻釋度的血清加兩孔，量以不溢出為宜，置濕盒內(nèi)，37℃感作30min,取出用PBS沖洗三遍，加用PBS作(1:10)～(1:50)稀釋的熒光素標記二抗(內(nèi)含伊文斯蘭1:1000),置濕盒內(nèi)，37℃感作30min,取出用PBS沖洗三遍，空氣干燥后，用pH9,0的碳酸緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。按照提供的重組核蛋白抗原所附說明書要求，用包被液將抗原稻釋，包被96孔板，每孔100pL,置4℃冰箱過夜，6.2.2血清稀釋將待檢血清和陰，陽性血清用稀釋液作11400至116400的倍比稀釋。取出96孔板，用洗滌液洗滌三次，每孔加100μL稀釋血清，每個稀釋度的血清加兩孔，37℃感作倒掉血清，用洗滌液洗滌三次，每次5min。6.2.5加酶標二抗用稀釋液將酶標二抗按說明書要求稀釋，加到96孔板內(nèi)，每孔100μL,37℃感作1h,倒掉酶標二抗，用洗滌液洗滌三次，每次5min。每孔加100pL底物溶液，酶標板置暗盒內(nèi)15min。6.2.8加終止液取出酶標板，每孔加50pL終止液。用酶標儀在410nm下測定每孔光密度值。7結(jié)果判定當(dāng)陰性血清孔細胞內(nèi)無綠色黃光，所有細胞呈紅色，陽性血清孔感染細胞的胸漿內(nèi)出現(xiàn)特異性綠色熒光，其他未感染細胞呈紅色時，可以判定結(jié)果。待檢血清114以上稀釋度，胞漿內(nèi)有特異性綠色熒光者判為陽性。血清校正OD值一測得OD值-無抗原孔OD值判定值-陰性樣品校正OD值+3倍標準差待檢血清1:400以上稀釋度的校正OD值高于判定值的判為陽性，反之為陰性。(規(guī)范性附錄)A.1細胞營養(yǎng)液按說明書要求配制E-MEM培養(yǎng)基，抽濾除菌，加10%健康胎牛血清、青霉素200IU/mL,鏈霉素A.2細胞維持液同細胞營養(yǎng)液，只是健康犢牛血清加2%。A.3細胞分散液(10倍濃縮液)氯化鈉40.0F氯化鉀2.0g葡萄糖5.01碳酸氨鈉2.9r乙二胺四乙戩二鈉1.0g以上成分依次溶于450mL二級水中，然后加入1%酚紅1mL,加二級水至500mL,抽濾除菌，分裝后—20℃保存。臨用時用除菌二級水稀釋。0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液碳酸氧鈉1.46R碳酸鈉0.97g二級水500ml,本標準指0.01mol/LpH7.4PBS氯化鈉4.0g磷酸二氫鉀0.1g十二水磷酸氧二鈉1.45g氯化鉀0.1g二級水500ml.A.6洗滌液0.01mol/LpH7.4PBSPBS5