牛海綿狀腦病診斷技術(shù)

牛海綿狀腦病診斷技術(shù)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了診斷牛海綿狀腦病(BSE)的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛海綿狀腦病的診斷；也可用于其他動(dòng)物的傳染性海綿狀腦病(TSE)的診斷。2臨床診斷BSE病牛臨床癥狀各種各樣，病程多為數(shù)月至一年，最終死亡。當(dāng)病牛出現(xiàn)以下全部或部分癥狀而又不能確定為其他疾病時(shí)，應(yīng)懷疑BSE的可能。a)行為異常：表現(xiàn)為不安、恐懼、異常震驚或沉郁；不自主運(yùn)動(dòng)，如磨牙、震顫；不愿接觸水泥地面或進(jìn)入畜欄等。b)感覺或反應(yīng)過敏：表現(xiàn)為觸、視、聽三覺過敏。對(duì)頸部觸摸、光線的明暗變化以及外部聲響過度敏感，這是BSE病牛重要的臨床表現(xiàn)。c)運(yùn)動(dòng)異常：病牛步態(tài)呈“鵝步”狀，共濟(jì)失調(diào)，四肢伸展過度，有時(shí)倒地，難以站立。d)體重和體況下降。其他動(dòng)物的TSE臨床癥狀不盡相同，但確診須依靠實(shí)驗(yàn)室診斷。3實(shí)驗(yàn)室診斷發(fā)現(xiàn)可疑病例后，應(yīng)進(jìn)行采樣，送專門實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。3.1采樣將牛頭固定，用電鋸從前額兩牛角根部向枕骨大孔背側(cè)緣方向鋸開，使腦部暴露。用剪刀剪開腦膜并切斷所有與腦部相連的神經(jīng)和血管，取出整腦。大規(guī)模監(jiān)測(cè)時(shí)，可用專用工具從枕骨大孔處，取出延腦部分即可。將完整的腦組織浸入10倍體積的固定液(配方見附錄A)中固定。一周后更換固定液，再維持一周。3.3組織病理學(xué)診斷3.3.1病料處理3.3.1.1把固定好的腦組織取出，將大腦和小腦去除，橫切腦干選取厚度為3mm～5mm的腦閂部延髓、小腦后腳部延髓和前丘部中腦組織塊。3.3.1.2將選取好的組織塊放入新配的固定液中再固定一周，其間更換固定液三次，并在水平搖床上不斷搖蕩，以提高固定液的滲透力。3.3.1.3將固定好的組織塊放入流水中漂洗24b。3.3.1.4放入下列不同濃度的酒精中脫水：23.3.1.5放入下列香柏油和二甲苯中透明：a)香柏油中12h;3.3.1.6按下述方法浸蠟：a)軟蠟中40min;3.3.1.7將浸好蠟的組織塊放入包埋框中用硬蠟包埋，冷卻過夜。3.3.1.8將石蠟塊切成5μm厚的切片，用干凈的載玻片貼片。3.3.2蘇木素伊紅H-E染色3.3.2.1試劑配制：見附錄B。3.3.2.2操作步驟如下：a)二甲苯I中10min;b)二甲苯Ⅱ中10min;g)85%酒精中2min;h)75%酒精中2min;i)自來水洗2min;j)哈里斯酸性蘇木精12min;k)自來水漂洗2min;1)酸性酒精10min;m)自來水漂洗5min;n)飽和碳酸鋰藍(lán)染30min;o)自來水漂洗10min;p)75%酒精中2min;q)85%酒精中2min;r)95%酒精伊紅液中復(fù)染1min;s)95%酒精中2min;t)100%酒精中2min;u)100%酒精中2min;v)二甲苯I中2min;w)二甲苯Ⅱ中2min。用中性樹膠封片。3.3.4結(jié)果觀察在光學(xué)顯微鏡下(10×10,10×40)觀察切片，若被檢樣品腦干灰質(zhì)區(qū)特別是腦閂部位的孤束核、迷走神經(jīng)背核、三叉神經(jīng)脊束核等處的神經(jīng)元核周質(zhì)或神經(jīng)纖維網(wǎng)胞漿中出現(xiàn)雙側(cè)對(duì)稱性海綿狀空泡病變，且空泡呈規(guī)則的圓形或橢圓形，周邊整齊，則可判定為BSE感染。在正常情況下，動(dòng)眼神經(jīng)核和紅核處的核周質(zhì)也可能有少量空泡出現(xiàn)，但不呈雙側(cè)對(duì)稱，應(yīng)注意區(qū)別。3同3.3.1。3.4.2試劑配制見附錄C。3.4.3.2磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次5min。3.4.3.3將蛋白酶K緩沖液水浴至3蓋好盒蓋，在121℃(約103kPa)條件下高壓蒸汽處理20min,而后自然冷卻。3.4.3.5PBS洗3次，每次5min。3.4.3.6甲醇-過氧化氫中室溫處理5min。3.4.3.7PBS洗3次，每次5min。3.4.3.8洗完后用吸水紙吸干組織塊四周的液體，然后在組織切片上滴加5%的正常豬血清，確保組3.4.3.9將切片放入1:800稀釋的兔抗牛PrP抗體溶液中，確保切片完全浸入，37℃作用4h。也可用1:1000的兔抗牛PrP抗體溶液37℃過夜處理。3.4.3.10PBS洗3次，每次5min。3.4.3.11洗完后用吸水紙吸干組織塊四周的液體，然后在組織切片上滴加顯示系統(tǒng)(見第C.6章)中3.4.3.12PBS洗3次，每次5min。3.4.3.13洗完后用吸水紙吸干組織塊四周的液體，然后在組織切片上滴加顯示系統(tǒng)中試劑B的溶3.4.3.14PBS洗3次，每次5min。3.4.3.15將切片在蒸餾水中放1min～2min。3.4.3.16洗完后用吸水紙吸干組織塊四周的液體，然后在組織切片上滴加顯示系統(tǒng)中試劑C的溶3.4.3.17將切片在蒸餾水中放1min～2min。4(規(guī)范性附錄)10%福爾馬林生理鹽水固定液的配制：蒸餾水40%福爾馬林混勻即可。g(規(guī)范性附錄)組織病理學(xué)診斷(H-E染色)的試劑配制B.1哈里斯酸性蘇木精染液蘇木精無水乙醇蒸餾水氧化汞冰乙酸鉀明礬先將蘇木精溶于無水乙醇，然后將鉀明礬和蒸餾水煮沸溶化，去火速加入蘇木精無水乙醇溶液中，再去火，立即加入氧化汞煮沸，迅速冷卻后加入冰乙酸，過濾使用。B.2酸性酒精在100mL的70%或80%酒精中加入0.5mL或1mL的濃鹽酸。B.3碳酸鋰飽和水溶液碳酸鋰2g加100mL蒸餾水，充分溶解。B.495%酒精伊紅液伊紅0.5g加入100mL95%酒精中配制。5(規(guī)范性附錄)免疫組織化學(xué)診斷的試劑配制C.1蛋白酶K緩沖溶液1mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)(pH8.0)2.5mL0.1mol/L氯化鈣(CaCl?)0.75mL蒸餾水47mL先將Tris/HCl、CaCl?和蒸餾水混勻。用前在37℃水浴中加入蛋白酶K(17μL)。C.2甲醇-過氧化氫(使用前5min配)甲醇過氧化氫(H?O?)(30%)1.5mLC.30.1mol/LPB.氯化鈉(NaCl)氯化鉀(KCI)0.2g磷酸氫二鈉(Na?HPO?)1.44g磷酸二氫鉀(KH?PO?)0.24g加水800mL溶解