牛結(jié)節(jié)疹檢疫技術(shù)規(guī)范

牛結(jié)節(jié)疹檢疫技術(shù)規(guī)范8.3.1.2用培養(yǎng)液稀釋病毒至100TCIDo/50gL。加入50μL工作病毒抗原置滴定試驗(yàn)孔中。每一塊96孔培養(yǎng)板可檢驗(yàn)32份血清。8.3.1.3將培養(yǎng)板置5%的二氧化碳培養(yǎng)箱37℃感作1h。8.3.1.4輯孔加已培養(yǎng)好的3×10°ml.細(xì)胞懸液100μl.。8.3.1.5置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)9d,連續(xù)觀察CPE。8.3.1.6同時(shí)做病毒回歸試驗(yàn)以測(cè)定病毒實(shí)際TCIDko,8.3.2對(duì)照8.3.2.1陽性血清和陰性血清均按被檢血清進(jìn)行。8.3.2.2病毒回歸試驗(yàn)，即重新測(cè)定病毒的TCIDn。將病毒抗原做10倍系列稀釋至10-*,每個(gè)稀樣度加4孔，每孔加50pL,補(bǔ)加50pL.培養(yǎng)液，再加入細(xì)胞懸液100pL,計(jì)算試驗(yàn)所用50pL.病毒液含有實(shí)際的TCIDo。8.3.3結(jié)果判定8.3.3.1用倒置顯微鏡從第4大起每天觀察細(xì)胞CPE變化，當(dāng)病毒抗原對(duì)照、陰性血清對(duì)照均出現(xiàn)CPE.陽性血清對(duì)照無CPE,待檢血清對(duì)細(xì)胞無毒性，對(duì)照細(xì)胞生長正常，抗原實(shí)際用量在50TCID/50gL~150TCID/50pL.范圍內(nèi)方能判定結(jié)果，第9天終判，抗體效價(jià)滴定判讀標(biāo)準(zhǔn)是以待檢血清最高稀釋度50%保護(hù)為該待檢血清的中和效價(jià)，以能保護(hù)細(xì)胞免于破壞的血清最高稀釋度為該血清滴度。8.3.3.2中和滴度大于等于115為陽性，小于115為陰性。8.3.3.3每次試驗(yàn)中，陽性對(duì)照血清滴度不應(yīng)比其已知效價(jià)差1個(gè)滴度以上，回歸滴度變化應(yīng)在8.3.4結(jié)果解釋通常血清中和試驗(yàn)是最特異的血清學(xué)試驗(yàn)方法，但LSD感染后主要是細(xì)胞免疫，陰性結(jié)果免疫應(yīng)答較溫和，并非意味著動(dòng)物沒有產(chǎn)生抗體，而動(dòng)物感染LSD病毒僅產(chǎn)生低水平的中和抗體，因而不夠敏感。因此在采用中和試驗(yàn)結(jié)果的同時(shí)，結(jié)合臨床癥狀(參見附錄B)等方法做最終判定。(規(guī)范性附錄)EDTA用量為1.5mg/mL~2.5mg/ml.血液終濃度。Hank's平衡鹽10倍濃縮液硫酸鎂(MgSO?·7H:O)氯化鎂(MgClg·6H?O)貯存于室溫或4℃。使用前，取Hank’s平衡鹽10倍濃縮液，用滅菌雙蒸水稀釋至工作液，并含復(fù)合抗生素及10%甘油，即為10%甘油運(yùn)輸液。B液磷酸氫二鈉(Na?HPO?)磷酸二氫鉀(KH?PO?)以0.104MPa~0.112MPa15min高壓滅菌A液和B液。貯存于4℃或室溫。A.5復(fù)合抗生素青霉素銷鹽，每毫升含1000國際單位(IU/ml.),硫酸鏈霉素1mg/mL,制霉菌素100IU/ml.,或兩性霉素2.5μg/mL,和新霉素200lU/mL。A.6蘇木精-伊紅染色蘇木精氧化汞乙醇硫酸鋁鉀(或硫酸鋁銨)去離子水200mla)在酒精內(nèi)溶解蘇木精，在水內(nèi)溶解硫酸鋁鉀，加熱助溶；b)混合蘇木精和硫酸鋁鉀溶液，盡快煮沸；c)加入氧化錄，此時(shí)溶液變成深紫色；d)在自來水中迅速冷卻；e)濾紙過濾：f)裝入瓶中蓋緊，室溫保存。A.6.2使用方法a)制備涂片(或蓋玻片細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)本)在空氣中干燥；b)用磷酸緩沖藏洗3次，以去除蛋白：c)在Zenker's液(配方見第A.7章)中固定12h~36h;d)自來水中洗30min;e)80%乙醇中脫水：f)轉(zhuǎn)到0.5%碘液(用95%酒精配制)5min;g)轉(zhuǎn)到0.5%硫代硫酸鈉水溶液中5min;h)在自來水中洗5min:i)用蘇木精染色10min:j)在稀釋的氨水中分化，直到呈藍(lán)色(約10min);k)用0.5%伊紅復(fù)染2s~5s;1)在三缸95%乙醇中脫水(即3次),然后很快轉(zhuǎn)到二缸純乙醇中(即2次)1m)在二甲苯中脫脂2次，每次2min~5min;n)用中性香膠固封。氯化汞硫酸鈉次氯酸鉀去離子水(資料性附錄)牛結(jié)節(jié)疹(lumpyskindisease,LSD)是牛的一種痘病，又稱疙瘩皮膚病、結(jié)節(jié)性皮膚病、偽荀麻疹等，是牛疙瘩皮膚病病毒(lumpyskindiseasevirus)引起的牛的一種急性、亞急性或慢性病毒性傳染病。該病可導(dǎo)致牛的產(chǎn)量下降及奶牛產(chǎn)奶量下降，還可損壞皮張。結(jié)節(jié)性皮膚病(LSD)1929年首次在贊比亞發(fā)現(xiàn)，1943年傳到博茨瓦納，然后又傳到南非，800多萬頭牛受影響，感染牛死亡率達(dá)20%,造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。本病在1988年以前僅局限于非洲撒哈拉以南，后來傳到非洲北部的埃及。于1988年埃及首次發(fā)現(xiàn)本病。在非洲以外，實(shí)驗(yàn)室證實(shí)只有1989年在以色列暴發(fā)了一次，所有感染牛和接觸牛全部被撲殺，其余牛注射疫苗后，疫情得以消滅。1993年在非州的巴林，留尼旺島有暴發(fā)的報(bào)告，但沒有分離到病毒。本病病毒屬痘病毒科(Poxviridae),山羊痘病毒屬(Capriparvirus),代表株為Neethling株，核酸類型為DNA。LSD是由山羊疸病毒屬病毒株引起的，其抗原性與引起綿羊痘和山羊痘的毒株之間的抗原性難以區(qū)別。然而，LSD具有與綿羊痘和山羊痘不同的地理分布，這表明牛型山羊痘病毒株不感染山羊和綿羊，在它們之間也不傳播。LSD病毒主要通過昆蟲傳播，自然界中在沒有媒介昆蟲的情況下，很難接觸傳播。在給子家兔、綿羊、山羊、長頸鹿和黑羚羊經(jīng)皮內(nèi)人工感染后，在局部形成輕度