輸入性嚙齒類動物攜帶鉤端螺旋體的檢測方法

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A.附錄B.附錄C均為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由國家認證認可監(jiān)督管理委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國寧波出入境檢驗檢疫局、中華人民共和國新江出入境檢驗檢疫局，中華人民共和國陜西出入境檢驗檢疫局負責(zé)超草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：鄭劍寧、葉仲華、楊定波、裘本標(biāo)準(zhǔn)系首次發(fā)布的出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。輸入性嚙齒動物攜帶鉤端螺旋體的檢測方法 (規(guī)范性附錄)嚙齒動物采樣操作方法小動物解剖固定板(蜻板或木板)、各種型號手術(shù)剪、手術(shù)鍛子、小動物麻醉缸、二氧化碳麻醉裝置、75%乙醇、乙醚、注射器及針頭、毛細取血管。A.2操作方法將嚙齒動物放入小動物麻醉缸用乙醚麻醉或放入二氧化碳麻醉裝置用二氧化碳麻醉。A.2.2.1眼眶后靜脈叢取血麻醉后，用左手拇指和食指抓住兩耳間的頭部皮膚，使頭部固定、眼球充分外突，眶后靜脈從充血。右手持玻璃毛細取血管(內(nèi)涂抗凝劑),與而部成45°的夾角，經(jīng)眼瞼和眼球之間刺入眼球后部的靜脈從。血液自動流入取血管。A.2.2.2眼眶取血麻醉后，用左手拇指和食指抓住兩耳間的頭部皮膚，使頭部固定、眼球充分外突并固定，用眼科鍛迅速將眼球摘除。將跟眶內(nèi)流出的血液滴入離心管。A.2.2.3頸靜脈或頸動脈采血動物麻醉后，仰臥固定于固定板上，剪去采血側(cè)頸部被毛，縱向切開前頸部皮膚，分離頸靜脈或頸動脈，用注射針向心方向刺入血管，抽取所需血量。也可剪斷血管直接用容器取血。A.2.2.4斷頭取血準(zhǔn)備好裝血的容器，用剪刀剪掉嚙齒動物的頭，并立即將頸向下，提起尾部，血液即可滴入容器中。A.2.2.5左前肢腋窩下采血動物麻醉后，仰臥固定于固定板上，剪開左胸部皮膚，剝離皮膚與左前肢展開成袋狀。剪開左前肢下靜脈，用吸管或毛細取血管吸取血液。動物麻醉后，仰臥固定于固定板上，剪去胸部被毛，用75%乙醇消毒心區(qū)部。左手拇指和食指觸摸心搏動處。右手持注射器，選擇心搏動最強處間入。血液自動流入注射器。A.2.2.7腹主動脈采血動物麻醉后，仰臥固定于固定板上，沿腹正中線剪開腹壁，并用止血鉗拉向兩側(cè)，紗布拭去滲出血液，將臟器推向一側(cè)。在嚙齒動物背下橫一直徑1.0cm~1,5cm的圓棒。分離出腹主動脈(呈淺紅色有搏動感),在遠心端向心方向刺入血管，迅速抽取血液。A.2.2.8股靜脈或股動脈采血動物麻醉后，仰臥固定于固定板上，切開左或右腹股溝的皮膚，分離出股靜脈或股動脈，將注射針向心方向刺入血管抽血。A.2.2.9尾尖采血動物麻醉后仰臥固定于固定板上或不麻醉直接將啃齒動物裝入固定簡內(nèi)，露出尾巴。在需要取較多的血時，應(yīng)將嚙齒動物尾浸泡于45℃~50℃熱水中，揩干后再剪去尾尖。小型嗜齒動物尾尖剪掉1.0mm~2.0mm或大型啃齒動物尾尖剪掉5.0mm~10.0mm,然后自尾根部向尖端按摩，血液自動5(規(guī)范性附錄)顯微鏡凝集實驗B.1主要器材普通恒溫培養(yǎng)箱、實體顯微鏡、恒溫水溶箱、高速離心機、5pL～50pL和50pL～200pL微量加樣器。B.2培養(yǎng)基制備B.2.1Korthof培養(yǎng)基成分和制備蛋白胨(可用胰蛋白胨代替)氧化鈉(NaCl)氧化部(KCD碳酸氧鈉(NaHCO?)磷酸二氧鉀(KH?PO)氧化鈣《CaCl?)20mg(如高壓滅菌或煮沸后出沉淀，可省去此成分)B.2.1.2.1將以上成分溶于500mL純化水中煮沸20min并過濾，校正pH為7.2,分裝于燒瓶內(nèi)，每瓶100mL,用103.43kPa高壓滅菌30min。B.2.1.2.2兔血清56℃滅活30min。B.2.1.2.3將B.2.1,2.1液以無菌操作加入滅活兔血清，最后濃度為8%～10%。B.2.2Tepckmn培養(yǎng)基(硝酸鹽緩沖溶液)成分和制備磷酸氫二鈉溶液(Nn?HPO?·12H?O)12g,加純化水至500ml.。B.2.2.1.2磷酸緩沖液磷酸二氨鉀溶液(KH?PO?)4.5g,加純化水至500mL。B.2.2.2.1取母液80mL、磷酸緩沖液20mL,混勻，調(diào)整pH至7.2~7.4,加入純化水900mL混勻，分裝入試管，并用103.43kPa高壓滅菌30min。B.2.2.2.3將B,2.2.2.1液以無菌操作加入滅活兔血清，最后濃度為8%~10%。B.3抗原制備將各群鉤端螺旋體代表株于Korthof或Tepckmn培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)5d~7d,暗視野顯微鐿檢查，每400信視野下不少于50條，運動活潑并無自凝者可作顯凝抗原。B.4操作方法及步驟B.4.1定性試驗待檢血清56℃水溶滅活30min后備用。用生理鹽水以1150(或11100)和11500兩個稀釋度作定性試驗，兩個稀釋度血清以及作對照用的生理鹽水各取50pL,取各群代表株的培養(yǎng)液依次加入每列的三個孔中。搖勻后37℃孵育1.5h~2h.用接種環(huán)挑取反應(yīng)液及對照，故置載玻片上暗視野顯微鏡下觀察凝集情況。1:50《或1:100)和1:500稀釋血清與某一群鉤端螺旋體抗原發(fā)生凝集，進入B.4.2。未與任一群鉤端螺旋體抗原發(fā)生凝集，則直接進入B.5。B.4.2測定凝集滴度(定量試驗)B.4.2.1血清稀釋按表B.1進行。陰性血清：無鉤端螺旋體感染的嚙齒動物血清；陽性血清：定性試驗中與待檢血清發(fā)生凝集的鉤端螺旋體代表株免疫咕齒動物所獲得的血清；標(biāo)準(zhǔn)抗原：與待檢血清發(fā)生凝集的鉤端螺旋體代表株的顯凝抗原。123456789生理鹽水/ml.陰性血清/mL.B.4.2.2對照標(biāo)明10孔，11孔，12孔，第10孔加入陰性血清0.1mL,第11孔加入陽性血清0.1mL,第12孔加入生理鹽水0.1mL。B.4.2.3加入抗原將各孔加入標(biāo)準(zhǔn)抗原0.1mL,混勻，各孔血清稀釋度如表B.1所示。置37℃溫箱2h,取出后搖勻，用接種環(huán)挑取各孔中的反應(yīng)物置于藏玻片上，在暗視野下觀察結(jié)果。B.5結(jié)果判定B.5.1定性試驗結(jié)果判定待檢血清末與任一群鉤端螺旋體抗原發(fā)生凝集判定為陰性，發(fā)生凝集判為定性試驗陽性，需進一步進行定量試驗進行結(jié)果判定。B.5.2定量試驗結(jié)果判定B.5.2.1幾乎全部鉤端螺旋體呈蝌蚪狀或折光率高的團塊，或有大小不等的點狀或塊狀殘片，僅有少75%的鉤端螺旋體被凝集，大部分呈塊狀或蜘蛛狀，尚有25%菌體游離判定為+++。50%左右的鉤端螺旋體被凝集，尚有50%菌體游離判定為++。25%左右的鉤端螺旋體被凝集，尚有75%菌體游離判定為+。全體菌體正常，分散，無凝集塊，菌數(shù)與對照相同判定為一。B.5.2.2待檢血清凝集效價在1:20達到“++”或以上時，均判為陽性反應(yīng)。(規(guī)范性附錄)將各群鉤端螺旋體代表株于Korthof或Tepekmn培養(yǎng)基(培養(yǎng)基的制備同第B.2章),28℃培養(yǎng)5d~7d。生長良好的培養(yǎng)物用1000r/min離心30min,沉淀用PBS(見C.2.5)在相同條件下洗兩次。沉淀用PBS懸浮，超聲波打碎后，1000r常用以下兩類酶結(jié)合物：——辣根過氧化物酶標(biāo)記金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)。C.2.3.1陰性血清C.2.3.2陽性血清PBS(0,01mol/LpH7,4)含10%小牛血清的洗滌液。加至1000mL加至1000mL鄰苯二胺(OPD)30%過氧化氫根據(jù)滴定的最適工作濃度，將特異性抗原用包被液稀釋。每孔100pL,置37℃1h后，于4℃放置待