海洋動物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測技術(shù)規(guī)程-地方標(biāo)準(zhǔn)編制說明

規(guī)程》(一)任務(wù)來源2020年7月，山東省市場監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會發(fā)布《關(guān)于印發(fā)2020年度地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂計劃項目的通知X魯市監(jiān)標(biāo)字【2020】249號),下達(dá)山東省地方標(biāo)準(zhǔn)《海洋生物資源遺傳多樣性監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》制定任務(wù)，由山東省海洋局提出并組織實施，山東省海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口，山東省海洋資源與環(huán)境研究院負(fù)責(zé)本項目的起草制定工作，項目編號213。(二)起草單位、起草人及任務(wù)分工接到《海洋生物資源遺傳多樣性監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》省級地方標(biāo)準(zhǔn)制定任務(wù)后，山東省海洋資源與環(huán)境研究院聯(lián)合海陽市海洋與漁業(yè)綜合服務(wù)中心，組織長期從事標(biāo)準(zhǔn)制修訂、海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān)測、資源調(diào)查評價、生物遺傳多樣性研究、海洋生物資源保護的一線工作人員，成1、起草單位項目承擔(dān)單位山東省海洋資源與環(huán)境研究院有60多年海洋與漁業(yè)科研歷史，在我省海洋資源與環(huán)境調(diào)查、開發(fā)、保護，海域海島可持續(xù)利用，海洋生物與遺傳育種等領(lǐng)域發(fā)揮了積極作用。下屬山東省海洋環(huán)境監(jiān)測中心多年來一直作為山東省海洋環(huán)境監(jiān)測和評價總牽頭單位，漁業(yè)資源研究中心主要從事海洋漁業(yè)資源調(diào)查評估、海洋生物資源修復(fù)等領(lǐng)域研究，先后承擔(dān)多項國家海洋公益性行業(yè)科研專項、農(nóng)業(yè)部生態(tài)修復(fù)項目等，已對刺參、海膽、單環(huán)刺螠、中國明對蝦、三疣梭子蟹等十余個重要經(jīng)濟海洋生物資源開展遺傳多樣性研究，具備扎實的工作基礎(chǔ)。先后制定國家、行業(yè)、地方標(biāo)準(zhǔn)20余項，具有豐富的標(biāo)準(zhǔn)使用和制修訂實踐經(jīng)驗。本項目所有參與者都是長期從事海洋環(huán)境監(jiān)測、資源調(diào)查評價、生物遺傳多樣性研究的一線工作人員，參與多項標(biāo)準(zhǔn)的制定，技術(shù)力量雄厚，可以勝任該項標(biāo)準(zhǔn)制定工作。中心現(xiàn)擁有熒光定量PCR儀、液氮冷凍研磨儀、高速冷凍離心機、凝膠成像系統(tǒng)等先進設(shè)備共計200多臺(套),儀器設(shè)備先進完備。項目合作單位海陽市海洋與漁業(yè)綜合服務(wù)中心，為全市海洋與漁業(yè)發(fā)展提供漁業(yè)技術(shù)推廣、海洋環(huán)境監(jiān)測、海洋預(yù)報、海洋減災(zāi)等綜合服務(wù)工作和海洋與漁業(yè)保護區(qū)組建、管理等服務(wù)工作。具有豐富的王瑋云：負(fù)責(zé)調(diào)查研究、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容設(shè)計、標(biāo)準(zhǔn)草案起草和修改等劉愛英：參與樣品分類、標(biāo)準(zhǔn)修改工作：(三)起草過程1、基礎(chǔ)工作標(biāo)準(zhǔn)申請前，收集相關(guān)參考文獻(xiàn)資料，包括專著、國內(nèi)外公開發(fā)布論文、科研成果和現(xiàn)有技術(shù)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，比較篩選適用的遺傳多樣性監(jiān)測方法；匯總實驗室多年來的遺傳多樣性研究結(jié)果，同時通過NCBIgenbank數(shù)據(jù)庫搜索下載海洋生物序列結(jié)果，驗證不同分子標(biāo)記作為種內(nèi)遺傳多樣性應(yīng)用的可行性，初步確定了標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)內(nèi)容。2、標(biāo)準(zhǔn)草案編寫標(biāo)準(zhǔn)立項后成立標(biāo)準(zhǔn)起草小組，明確主要起草人及任務(wù)分工。收集了多種海洋動物，根據(jù)形態(tài)學(xué)分類后開展了D-loop、COI、16SrDNA序列檢測，獲得了翔實可靠的數(shù)據(jù)，在此基礎(chǔ)上廣泛參考現(xiàn)有研究資3、征求意見稿編寫標(biāo)準(zhǔn)草案經(jīng)起草小組討論、修改，2022年6月形成標(biāo)準(zhǔn)征求意見2022年7月，標(biāo)準(zhǔn)專家征求意見稿送科研院所、高校、企業(yè)等共30家單位書面征求意見。2022年9月，共收到35位專家反饋，其中提出修改建議的專家30位，無意見專家5位，合計技術(shù)性意見和建議81條。2022年10月，標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿在山東省海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會網(wǎng)站上公示，并在海標(biāo)委的指導(dǎo)下，根據(jù)專家意見和建議完成標(biāo)準(zhǔn)文本及編制說明征求意見稿的修改工作，材料提交海標(biāo)委準(zhǔn)備參加論證會。5、標(biāo)準(zhǔn)送審稿形成2022年11月12日，山東省海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會組織在煙臺召開標(biāo)準(zhǔn)論證會，會議邀請6位專家參加，并提出修改建議，根據(jù)會上專家提出的意見和建議完成標(biāo)準(zhǔn)文本及編制說明的修改工作，形成標(biāo)6、標(biāo)準(zhǔn)報批稿形成2023年8月31日，山東省海洋局在煙臺組織召開標(biāo)準(zhǔn)專家審查會議。會議邀請9名專家組成了審查委員會。審查委員會聽取了標(biāo)準(zhǔn)編制情況匯報，對標(biāo)準(zhǔn)文本進行了逐章、逐條審查，對標(biāo)準(zhǔn)編制說明等進行了審查，共提出修改建議20條。根據(jù)專家提出的意見和建議完成標(biāo)準(zhǔn)文本及編制說明的修改工作，形成標(biāo)準(zhǔn)報批稿。7、標(biāo)準(zhǔn)名稱變更說明《海洋生物資源遺傳多樣性監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》標(biāo)準(zhǔn)草案編制過程中發(fā)現(xiàn)，由于海洋生物種類繁多，即使同樣選擇單核苷酸多樣性(SNP)分子標(biāo)記，其DNA提取方法和遺傳多樣性檢測條件差異很大，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容更側(cè)重于海洋生物資源遺傳多樣性監(jiān)測的程序與相關(guān)技術(shù)要求，因此征求意見稿標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為《海洋生物資源遺傳多樣性監(jiān)測技術(shù)規(guī)程》;多位專家反饋意見和現(xiàn)場論證專家一致認(rèn)為，海洋生物范圍太廣，不同類別生物差異巨大，應(yīng)分別制定遺傳多樣性監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)，建議該標(biāo)準(zhǔn)名稱改為《海洋動物物資源遺傳多樣性監(jiān)測技術(shù)規(guī)程》;標(biāo)準(zhǔn)審查會上，專家建議進一步明確，標(biāo)準(zhǔn)名稱最終修改為《海洋動物物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測技術(shù)規(guī)程》,報批稿名稱和內(nèi)容即按二、地方標(biāo)準(zhǔn)制定目的和意義生物多樣性是人類生存和發(fā)展、人與自然和諧共生的重要基礎(chǔ)。2011年，我國通過了《聯(lián)合國生物多樣性十年中國行動方案》,將生物多樣性保護上升為國家戰(zhàn)略?！吨袊锒鄻有员Ｗo戰(zhàn)略與行動計劃(2011-2030)》指出：海洋及海岸帶物種及其棲息地不斷喪失，海洋漁業(yè)資源減少，部分珍貴和特有魚種質(zhì)資源流失嚴(yán)重，一些地方傳統(tǒng)和稀有品種資源喪失。對已完成的大型建設(shè)項目開展生物多樣性保護措施有效性的后評估、開展生物物種資源和生態(tài)系統(tǒng)本底調(diào)查、開展生物多樣性監(jiān)測和預(yù)警為我國生物多樣性保護的優(yōu)先行動之一。生物多樣性由遺傳多樣性、物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性組成。其中遺傳多樣性是指生物體內(nèi)決定性狀的遺傳因子及其組合的多樣性，是生物多樣性的基礎(chǔ)，也是生物生存適應(yīng)和發(fā)展進化的前提。一個居群或物種遺傳多樣性越高，對環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強。遺傳多樣性也是保護生物學(xué)研究的核心之一，對保護受威脅的物種和珍稀瀕危物種保護方針和措施的制定具有重要意義。隨著社會經(jīng)濟的飛速發(fā)展，人類活動對海洋生物資源的影響越來越明顯，主要表現(xiàn)在：一、大量的圍填海和其他海洋工程擠占海洋生物的生存空間；二、工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生活污水的排放造成的污染威脅海洋生物生活環(huán)境；三、對海洋經(jīng)濟生物的過度捕撈使其資源量銳減；四、連續(xù)多年大規(guī)模的增殖放流活動對部分經(jīng)濟海洋生物資源量的補充。這些人為干預(yù)都可能對海洋生物的遺傳多樣性產(chǎn)生影響。我國目前開展的海洋生態(tài)調(diào)查工作中，以浮游動植物、底棲生物的物種多樣性為主，對海洋漁業(yè)資源調(diào)查也主要側(cè)重于生物種類、密另一方面也是因為缺少相應(yīng)的監(jiān)測方法和評價標(biāo)準(zhǔn)。為全面評價海洋生物資源狀況，為海洋資源保護工作提供技術(shù)支持，急需制定海洋生物資源遺傳多樣性監(jiān)測技術(shù)規(guī)程。本標(biāo)準(zhǔn)的制定，解決了海洋動物資源調(diào)查中遺傳多樣性監(jiān)測無標(biāo)可依的現(xiàn)狀，為海洋資源調(diào)查提供重要的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，為摸清我省的海洋動物資源遺傳多樣性現(xiàn)狀、客觀評價海洋保護工作效果提供科學(xué)依據(jù)。對科學(xué)制定海洋生物保護策略、促進海洋強省建設(shè)具有重要的(一)標(biāo)準(zhǔn)編制原則本文件按照科學(xué)性、先進性、實用性、完整性、協(xié)調(diào)統(tǒng)一性原則編寫，適用于海洋動物資源的遺傳多樣性監(jiān)測。1、科學(xué)性原則本文件中遺傳多樣性研究對象為同一物種不同個體可遺傳的變異。基于形態(tài)學(xué)、染色體、等位酶、基因等不同層次的遺傳多樣性研究各有適用的檢測和量化的科學(xué)方法，因此海洋動物遺傳多樣性監(jiān)測具有堅實的科學(xué)理論基礎(chǔ)和成熟的技術(shù)支持。遺傳多樣性監(jiān)測程序按照實際需要確立；選擇進化速度快的線粒體高變區(qū)設(shè)計篩選高特異性引物；樣品采集要求保證樣品的代表性，樣品保存與運輸有利于遺傳物質(zhì)保存完好；樣品檢測和數(shù)據(jù)分析均有大量的研究成果支持。形態(tài)學(xué)水平、細(xì)胞水平、染色體水平、生化水平、分子水平遺傳多樣性檢測方法各有利弊。鑒于現(xiàn)代分子生物學(xué)研究技術(shù)的迅速發(fā)展，選擇分子生物學(xué)方法用于遺傳多樣性進行分析，且以進化速度快的線粒體DNA(mtDNA)部分序列為目標(biāo)，選擇具有密度高、代表性強、遺傳穩(wěn)定、易自動化分析特點的單核苷酸多態(tài)性(SNP)分子標(biāo)記進行遺傳3、實用性原則由于自然條件下海洋動物資源的遺傳多樣性變化緩慢，監(jiān)測周期5~10年。根據(jù)調(diào)查需求可選擇現(xiàn)場調(diào)查采樣，也可從調(diào)查海域捕撈作業(yè)船、漁港或市場直接采集來自目標(biāo)海域的新鮮漁獲物。在充分考慮科學(xué)性的同時，做到經(jīng)濟、合理、實用，可操作性強，便于貫徹實施。廣泛開展了調(diào)查研究和必要的試驗驗證工作，全面掌握引物選擇、樣品采集、保存和運輸、樣品檢測中影響監(jiān)測結(jié)果的因素，并做出明確要求，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容完整、翔實。密切結(jié)合海洋生物資源遺傳多樣性監(jiān)測實際情況，遵循國家有關(guān)方針、政策、法規(guī)和規(guī)章，嚴(yán)格執(zhí)行強制性國家標(biāo)準(zhǔn)，參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，充分考慮國際上通用標(biāo)準(zhǔn)。在格式上按照GB/T1.1-2020和GB/T20001.6-2017的規(guī)定進行編寫，編制說明按山東省市場監(jiān)督管理局《山東省地方標(biāo)準(zhǔn)管理辦法》第三章第二十一條和山東省市場監(jiān)督管理局《關(guān)于加強地方標(biāo)準(zhǔn)管理有關(guān)事項的通知》附件要求編寫。標(biāo)準(zhǔn)的文字表達(dá)力求準(zhǔn)確、簡明、易懂，結(jié)構(gòu)合理、層次分明、邏輯嚴(yán)謹(jǐn)。標(biāo)準(zhǔn)中的術(shù)語、符號統(tǒng)一，與相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)相協(xié)調(diào)。(二)主要技術(shù)內(nèi)容和確定依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)從規(guī)范海洋動物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測方法、提供高效實用的檢測技術(shù)和可比性強的監(jiān)測數(shù)據(jù)的指導(dǎo)思想出發(fā)，主要對海洋動物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測程序、監(jiān)測方案設(shè)計、樣品采集、樣品保存與運輸、樣品檢測、質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)分析和監(jiān)測報告等進行規(guī)定。同時參考國內(nèi)現(xiàn)行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，對主要技術(shù)指標(biāo)進行試驗驗證后形成了標(biāo)準(zhǔn)的征求意見稿。1、術(shù)語和定義遺傳多樣性有廣義和狹義之分。廣義的遺傳多樣性是指地球上所有生物所攜帶的遺傳信息的總和。本文中遺傳多樣性為狹義遺傳多樣性，是指種內(nèi)的遺傳多樣性，即種內(nèi)個體之間或一個群體內(nèi)不同個體的遺傳變異總和，引自《生物多樣性研究的原理和方法》。為方便標(biāo)準(zhǔn)使用，對遺傳多樣性術(shù)語進行定義。2、遺傳多樣性標(biāo)記的選擇遺傳多樣性分析分為形態(tài)學(xué)水平、細(xì)胞水平、染色體水平、生化水平、分子水平等，不同水平的研究各有適用的檢測的方法，且各種方法各有利弊。形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)方法能快速地大致了解遺傳變異大??；等位酶分析在技術(shù)上比較成熟，且能從分子水平上對基因組遺傳變異的大小進行較為客觀的度量；DNA分析近年來迅速，應(yīng)用潛力很大，是未來發(fā)展的方向，因此本標(biāo)準(zhǔn)選擇DNA水平對遺傳多樣性進行分析。擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)、簡性(SNP)等分子標(biāo)記在物種遺傳多樣性分析中得到了廣泛的應(yīng)用。其中，ISSR以錨定的微衛(wèi)星DNA為引物來擴增簡單重復(fù)區(qū)域間的序列，具有容易操作，可重復(fù)和穩(wěn)定性及多態(tài)性檢出高等優(yōu)點，已用于多種海洋物種遺傳多樣性分析(李建輝，2000;AmitKumaretal,2014;PheravutWongsawad,2015)。SSR標(biāo)記的數(shù)量豐富，具有較多的等位性變異、是共顯性標(biāo)記、引物的通用性好、所需模板少、試驗重復(fù)性好、結(jié)果可靠等特點，在遺傳多樣性的分析中應(yīng)用十分廣泛。單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SingleNucleotidePolymorphism,SNP),是指生物基即在基因組的特定核苷酸位置上存在2個不同堿基，其中最少一種在群體中的頻率不小于1%。從理論上說，SNP是目前覆蓋了基因組所有DNA多態(tài)的唯一標(biāo)記方法。由于SNP具有密度高、富有代表性、遺傳穩(wěn)定性、易實現(xiàn)分析的自動化的特點，在遺傳多樣性研究方面應(yīng)用越線粒體DNA(mtDNA)是一種共價閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子，具有結(jié)構(gòu)簡單、無重組、多數(shù)母性遺傳、進化速度快、核苷酸替代率高、不同的區(qū)域進化速度存在差異，允許選擇不同的區(qū)域進行不同時間尺度的進化分析等特點，已成為種類鑒別、群體遺傳學(xué)以及系統(tǒng)發(fā)育等研究的有效遺傳標(biāo)記。2003年，Herbet等人提出以COI基因作為標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)區(qū)域?qū)λ形锓N進行DNA編碼，現(xiàn)已進行大量工作，充分證明COI基因用于物種鑒定，物種分類，遺傳多樣性分析、物種進化分析的可行性，有效性和準(zhǔn)確性?；贑OI基因的SNP已用于多種海洋的一段非編碼區(qū)，進化速度相對較快，是線粒體DNA序列和長度變異最大的區(qū)域，適用于群體水平的遺傳多樣性分析，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多種生物的多樣性分析。農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1898-2010畜禽線粒體DNA遺傳多樣性檢測技術(shù)規(guī)程中亦采用了D-loop分子標(biāo)記。王錦錦等(2020)分別用COI、16SrDNA、D-loop序列研究了采集自中國青島、煙臺、俄羅斯符拉迪沃斯托克、韓國浦項、韓國木浦和韓國群山共6個海域8個不同地理群體刺參，發(fā)現(xiàn)D-loop和COI序列的多態(tài)位點數(shù)、單倍型數(shù)和核苷酸多樣性均顯著高于16SrDNA序列，更適用于同一物種不同群體遺傳結(jié)構(gòu)的解析。沈朕等(2017)利用Cytb、D-loop部分序列研究大瀧六線魚舟山、大連、瑯琊臺、即墨4個群體的遺傳多樣性，認(rèn)為Cytb、D-loop均可作為檢測大瀧六線魚遺傳多樣性的有效標(biāo)記；杜景豪等(2020)用Cytb、D-loop序列對浙江舟山、福建福州、福建廈門、廣西北海和廣東湛江5個近海水域的日本囊對蝦進行分析，認(rèn)為5個日本囊對蝦群體區(qū)域分化較為明顯，具有較高的遺傳多樣性，呈現(xiàn)出較高的單倍型和核苷酸多態(tài)性；袁吉貴等基于D-loop和Cytb部分序列對東山島和泉州市養(yǎng)殖場大海馬進行了遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)D-loop序列比Cytb序列敏感，兩種分子標(biāo)記均顯示大海馬群體中變異較小，在一定程度上反映了大海馬資源稀缺的現(xiàn)象；孔杰等(2020)用Cytb、D-loop序列評估施氏鱘和西伯利亞鱘后備親魚群體的遺傳多樣性，認(rèn)為西伯利亞鱘和施氏鱘親魚群體的遺傳多樣性匱乏，尤其在利用西伯利亞鱘親魚進行繁殖育苗時要注意近交的不利影響。COI、16SrDNA、Cytb、D-loop等線粒體DNA序列都被用于不同生物的種內(nèi)遺傳多樣性研究。研究結(jié)果表明，D-loop序列適合用于多種生物的種內(nèi)遺傳多樣性分析，與其他分子標(biāo)記比較，具有更高的靈敏性。本規(guī)程選擇利用PCR技術(shù)、DNA測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù)，對海洋動物線粒體DNA中進化速度最快的部分序列，通常采用線粒體控制區(qū)(D-loop)序列，缺乏D-loop序列的物種可采用細(xì)胞色素b (Cytb)、細(xì)胞色素氧化酶I(COI)基因或其他基因序列，進行單核苷酸多態(tài)性分析，獲得群體的遺傳多樣性數(shù)據(jù)。根據(jù)監(jiān)測需要確立監(jiān)測程序，主要包括監(jiān)測方案設(shè)計、樣品采集、保存與運輸、樣品檢測、質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)分析、監(jiān)測報告等。4、監(jiān)測方案設(shè)計明確監(jiān)測海域、監(jiān)測周期、監(jiān)測時間、樣品采集、保存和運輸、樣品檢測方法、監(jiān)測指標(biāo)、質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)分析、監(jiān)測報告等。為確定野生海洋動物資源的監(jiān)測周期，利用D-loop部分序列分別對2012年和2018年威海小石島海域刺參遺傳多樣性進行分析，Hd分別為0.995和0.993,Pi分別為0.039和0.037,顯示該海域刺參遺傳多利用D-loop部分序列對2012年和2021年我省海域中國對蝦、三疣梭子蟹遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，近十年來2個物種Hd和Pi值均有小幅度的下降(圖1),山東海域三疣梭子蟹遺傳多樣性豐富，中國對蝦單倍型多樣度Hd多態(tài)位點比例%■2012年■2021年■2012年■2021年■2012年■2021年用COI序列分別對2012年和2016年萊州灣單環(huán)刺螠遺傳多樣性進行分析，Hd分別為0.600、0.951,Pi分別為0.01223、0.00835,顯示萊州灣海域單環(huán)刺螠遺傳多樣性一直比較豐富，但2016年比2012可見自然條件下海洋動物資源的線粒體DNA遺傳多樣性變化較慢，因此對調(diào)查海域海洋動物的遺傳多樣性監(jiān)測，每個物種每5年~10年開展1次即可。由于人工繁育海洋動物的遺傳多樣性狀況參差不齊，大規(guī)模的增殖放流活動可能導(dǎo)致海洋動物資源遺傳多樣性的快速變化，因此建議增殖物種遺傳多樣性每年開展1次。5、樣品采集與保存、運輸遺傳多樣性樣品可通過現(xiàn)場調(diào)查采集，也可從監(jiān)測海域捕撈作業(yè)船、漁港或市場直接采集新鮮的漁獲物。其中，現(xiàn)場調(diào)查采集按計劃在調(diào)查海域設(shè)置多個站位，站位布設(shè)按GB/T12763.6規(guī)定執(zhí)行。對海洋底棲生物、潮間帶生物進行定點采樣，對移動迅速的底棲生物可設(shè)地籠誘捕。對游泳能力強的魚類、甲殼類等進行拖網(wǎng)采樣。對非現(xiàn)場調(diào)查采樣，按GB/T18654.2規(guī)定的方法從監(jiān)測海域捕撈作業(yè)船、漁港或市場直接采集漁獲物。采樣數(shù)量及方法要求，按形態(tài)學(xué)分類后，依據(jù)GB/T18654.2規(guī)定采集同一物種30個以上獨立個體作為一批樣品。采樣通常采取海洋動物整體；對大型海洋動物實行部分采樣；對海洋保護動物、珍稀瀕危生物實行非致死性采樣。部分采樣和非致死性采樣要提前準(zhǔn)備專業(yè)采樣工具，由經(jīng)培訓(xùn)的專業(yè)人員操作。對大型海洋動物實行部分采樣，無菌操作采取肌肉組織約0.5g;對海洋保護動物、珍稀瀕危生物實行非致死性采樣：視監(jiān)測生物的具體情況，無菌操作剪取部分魚類鰭條組織約100mg,或用無菌注射器于尾靜脈處抽取血液約0.5mL;貝類無菌取小部分外套膜組織；蟹類用無菌注射器從第3步足基節(jié)關(guān)節(jié)膜處刺入抽取血淋巴0.1mL。樣品保存和運輸過程中要盡量保證每個樣本的DNA不被污染和降解。因此要求：整體采樣的個體應(yīng)保持完整；部分采樣的組織應(yīng)每個個體獨立包裝。采樣后立即冷凍或4℃~10℃冷藏，冷藏時間應(yīng)不超過24h,長時間保存應(yīng)-20℃以下冷凍，樣品運輸過程中應(yīng)保證溫度在10℃以下。體積小于1cm3的樣品或組織，可量取10倍以上體積的乙醇(95%以上)或商品化的樣品保存溶液加入，常溫保存與運輸。7、采樣記錄采樣的同時填寫表A.1采樣記錄表，詳細(xì)填寫樣品的名稱、編號、來源、數(shù)量、保存條件、狀態(tài)、采樣人員及時間等信息，以保證樣品的來源清楚、質(zhì)量符合檢測要求。8、樣品檢測8.1DNA提取DNA可用常規(guī)酚-氯仿方法提取，也可選用商品化的DNA提取試劑盒。海洋動物取肌肉或鰭條組織約100mg,液氮冷凍研磨、組織勻血液樣品用血液DNA提取試劑盒提取總DNA。用試劑盒提取DNA,操作步驟按說明書進行；酚-氯仿方法提取DNA的步驟見附錄B。提取的DNA用洗脫液或滅菌雙蒸水溶解，取5μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA質(zhì)量，電泳方法參照附錄C?；蛉∵m量DNA溶液用核酸定量分析儀測定A260/A280比值和DNA濃度。經(jīng)檢測DNA質(zhì)量良引物宜引用已公開發(fā)表學(xué)術(shù)論文或研究報告，或在基因數(shù)據(jù)庫中搜索目標(biāo)物種的線粒體DNA序列自行設(shè)計2對~3對，引物宜符合Tm值50℃~60℃、長度18bp~24bp、G+C含量在40%~60%、PCR產(chǎn)物長度400bp~600bp。為避免設(shè)計的引物個別堿基誤差，引物序列通過DNA序列比對工具與目的序列比對驗證，檢查校正無誤后合成。用合成的引物對樣品進行預(yù)實驗。按每對引物的Tm值設(shè)定退火溫度，進行PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，選擇PCR產(chǎn)物條帶單一、清晰、且長度與預(yù)期一致的引物，進行雙向測序。PCR產(chǎn)物能夠成功測序的引物作為該物種的遺傳多樣性監(jiān)測引物。條引物的Tm值不同，影響-PCR的退火溫度；PCR產(chǎn)物的長度決定延伸時間，因此規(guī)定PCR反應(yīng)程序：94℃變性3min;94℃變性30s,X℃退火30s(其中X視不同引物的具體Tm值確定),72℃延伸30~60s,35個循環(huán)；72℃延伸10min,4℃保溫。8.5PCR產(chǎn)物回收、純化與序列測定對所有樣品進行擴增后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，回收純化目的片段，交由生物科技公司測序?；騊CR產(chǎn)物直接雙向測序。因PCR方法十分靈敏，為確認(rèn)檢測過程中是否存在試劑污染、交叉污染、擴增失敗等現(xiàn)象，要求每批樣品PCR同時，用滅菌雙蒸水、其他物種DNA和檢測物種DNA分別作為空白對照、陰性對照和陽性對照。電泳時每排樣品至少加一個DNA分子量梯度標(biāo)準(zhǔn)做參照，以判斷擴增產(chǎn)物的分子量，初步確認(rèn)實驗質(zhì)量。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示空白對照、陰性對照無特征性條帶，陽性對照出現(xiàn)特征性條帶，且檢測樣品出現(xiàn)和陽性對照相同的特征性條帶，檢測樣品PCR產(chǎn)物可進行測序。遺傳距離是指不同的個體或種群之間的基因差異的程度；單倍體多樣性是指樣本中隨機抽取到兩個不同單倍型的頻率；平均核苷酸變異數(shù)是指所有個體的核苷酸變異數(shù)之和與個體數(shù)的比值；核苷酸多樣性是指平均核苷酸差異數(shù)與序列長度的比值。這幾個參數(shù)目前常用于對生物遺傳多樣性評價和分析。DNA測序結(jié)果用生物軟件進行比對、剪切，用最大合成似然法 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。DNA序列多態(tài)性分析，計算單倍體多樣性、平均核苷酸變異數(shù)、核苷酸多樣性等遺傳多樣性數(shù)據(jù)。分析結(jié)果填寫表F.1檢11、D-loop序列在遺傳多樣性分析中的應(yīng)用實驗以三疣梭子實驗所用樣品于2021年9月采自山東省海域。拖網(wǎng)采集后的樣品粒體DNA序列(登錄號：NC_005037.1),用primerpremier6.0軟件設(shè)計D-loop區(qū)序列引物3對，引物由華大基因合成，預(yù)實驗后選擇特異性強、擴增條帶長度適中的引物作為本研究用引物：總DNA提取、PCR擴增及序列測定均按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定執(zhí)行。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，三疣梭子蟹PCR產(chǎn)物為一條600bp左右主帶(圖2)。切膠回收后交給華大基因測序，其中38個個體獲得滿意結(jié)果(圖圖3三疣梭子蟹PCR產(chǎn)物雙向測序峰值圖用MEGA4.0軟件對所有測序結(jié)果進行比對，剪切去除引物序列獲得581bp序列用于下一步分析，其單倍型I的DNA序列見表1。表1三疣梭子蟹單倍型IDNA序列表ACTCTCATACAAACTTAATATAAACGCAAGGAATTAAGAAACAATCAAACTAACCCGTCAAGCGAGTATAAAATAAAGGCCTACATACAAAGAGCAACTATAAAATATAAAGGTCTTATATCTCATTCTTCACTTAGTGAAGAGTTCAAACCAATATTATATTATTTATACTCCTACATTAAGACAGCAATTAGATAGTTACTAT360CTAATCATCTTTAATAATATTTGCTCTAAATAGAGAGATGAAGAAGGAAGTGAGTTCATGTTCTCGAGAGGTTCACTTTCTTC580MEGA4.0軟件分析結(jié)果顯示，本實驗所用的581bpD-loop序列 (不包括引物)中，T、C、A、G堿基的平均含量分別為35.0%、16.0%、38.7%、10.3%其中A+T、G+C的平均含量是73.7%、26.3%,AT含量明顯高于GC含量，顯示該片段為富含AT的區(qū)域。在所分析的38個三疣梭子蟹樣品中，群體內(nèi)個體間遺傳距離為0～0.035,群體內(nèi)平均遺傳距離為0.016(表2)。46784k000bDnaSP5.0軟件分析結(jié)果表明，581bp共包含單態(tài)位點ormissingdata)8個，多態(tài)位點數(shù)(Invariablesites)58個，其中單一多態(tài)位點(Singletonvariablesites)23個，簡約信息位點38個樣品共定義了25個單倍型，單倍型多樣度(Hd)為酸差異的平均數(shù)k=9.243。顯示黃渤海三疣梭子蟹遺傳多樣性較用MEGA4.0軟件分析2021年黃渤海采集的三疣梭子蟹樣品38個、2020年采集的樣品2個和NCBIGenbank中1個(登錄號(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4),進行親緣關(guān)系圖4三疣梭子蟹D-loop序列NJ樹由圖4可知，所分析的41個樣品主要分為3支，不同站位所采集樣品聚類沒有規(guī)律，未發(fā)現(xiàn)有地域特異性?？傮w遺