焦磷酸測序法檢測k-ras基因多態(tài)性的試劑盒及方法

焦磷酸測序法檢測k-ras基因多態(tài)性的試劑盒及方法專利名稱：焦磷酸測序法檢測k-ras基因多態(tài)性的試劑盒及方法技術領域：本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體涉及焦磷酸測序法檢測K-RAS基因多態(tài)性的試劑盒及方法。背景技術：抗表皮生長因子受體的單克隆抗體(如西妥昔單抗、尼妥珠單抗、帕尼單抗等)可與表達于正常細胞和多種癌細胞表面的EGF受體特異性結合，并競爭性阻斷EGF和其他配體，如a轉化生長因子(TGF-a)的結合。分別是針對EGF受體的IgGl和IgG2單克隆抗體，兩者特異性結合后，通過對與EGF受體結合的酪氨酸激酶(TK)的抑制作用，阻斷細胞內信號轉導途徑，從而抑制癌細胞的增殖，誘導癌細胞的凋亡，減少基質金屬蛋白酶和血管內皮生長因子的產生。吉非替尼是一種選擇性表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑，該酶通常表達于上皮來源的實體瘤。對于EGFR酪氨酸激酶活性的抑制可妨礙腫瘤的生長，轉移和血管生成，并增加腫瘤細胞的凋亡。K-ras基因定位于人類染色體12p，編碼一種具有GTP酶活性的小G蛋白，是表皮生長因子受體(EGFR)功能信號的下游分子，在膜受體到腺苷環(huán)化酶信號傳導中起重要作用。現(xiàn)有的研究顯示，90%的K-ras基因突變位于2號外顯子的第12和13密碼子位點，其中第12位密碼子(約82%)是結直腸癌中最常見的突變位點，這種K-ras基因催化活性區(qū)的突變，導致Ras蛋白不依賴EGFR/HER受體激活而持續(xù)活化。此時EGFR抑制劑或單克隆抗體雖然阻滯EGFR激活信號的下傳，但是KRAS突變不依賴上游EGFR信號的持續(xù)激活，使得下游信號仍處于激活狀態(tài)，腫瘤細胞表現(xiàn)對EGFR抑制劑或單克隆抗體的拮抗作用，即不敏感。根據上述遺傳藥理學的研究發(fā)現(xiàn)，美國食品及藥品監(jiān)督管理局(FDA)在2009年修改靶向藥物的使用說明，其中明確闡述了抗表皮生長因子受體的單克隆抗體藥效與K-RAS基因密切相關性，并要求使用該類藥物前進行K-RAS基因突變檢測以幫助醫(yī)生判斷適用人群。而我國食品及藥品監(jiān)督管理局(SFDA)也于同年召開靶向藥物基因檢測聽證會，且于2010年發(fā)布的《結直腸癌診療規(guī)范》中明確指出K-ras基因檢測的必要性。綜上所述，對K-RAS基因第2號外顯子第12號密碼子以及13號密碼子多態(tài)性進行分型檢測可預測患者對抗表皮生長因子受體的單克隆抗體的反應性，為臨床醫(yī)生給結直腸癌制定藥物治療方案提供依據。開發(fā)快速、高效、準確、便捷、經濟的檢測K-RAS基因多態(tài)性的試劑盒將為抗表皮生長因子受體的單克隆抗體的臨床個體化治療起到積極的推動作用。焦磷酸測序(Pyrosequencing)技術是新一代DNA序列分析技術,該技術無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，是一種通用型技術平臺。該技術具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準確、高通量等特點，符合臨床大樣本檢測要求。發(fā)明內容K-RAS基因(SEQIDNO.I)多態(tài)性是影響抗表皮生長因子受體的單克隆抗體能否使用的最主要因素。本發(fā)明提供一種臨床檢測使用抗表皮生長因子受體的單克隆抗體生物標志物的用藥基因K-RAS多態(tài)性的試劑盒及方法，以實現(xiàn)快速、簡便、準確、高效、實用、經濟的檢測抗表皮生長因子受體的單克隆抗體個體化用藥相關基因多態(tài)性。為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術方案為所述焦磷酸測序法檢測K-RAS基因多態(tài)性的試劑盒，包括如下引物(1)擴增引物K-RAS第2號外顯子12號密碼子、13號密碼子上游引物5’-TGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTG-3’(SEQIDNO.2)；K-RAS第2號外顯子12號密碼子、13號密碼子下游引物5’-TCGTCCACAAAATGATTCTGAA-3’(SEQIDNO.3)；其中，下游引物的5’進行生物素標記；(2)測序引物K-RAS第2號外顯子12號密碼子、13號密碼子測序引物5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCT-3’(SEQIDNO.4)；在實際應用中，可以對上述引物作適當改變，只要保證設計的引物與上述引物同源性達95%以上即可；試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規(guī)試劑。所述應用上述試劑盒檢測K-RAS基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟(1)DNA提取；(2)聚合酶鏈反應配制50illPCR擴增體系，包含10XPCRbuffer5uI,dNTP3.0yl，上游引物Iyl，下游引物IU1，rTaqlyl，水37.0yl，模板2.0iU;按照下面的循環(huán)參數(shù)設置擴增儀95V5min預變性；然后依次在95°C30S,50°C30S,72°C30S，進行40個循環(huán)；再在72°C保持7min,最終保持在4V，得擴增產物；(3)焦磷酸測序單鏈樣本純化；(4)焦磷酸測序及結果分析。本發(fā)明試劑盒對K-ras基因檢測的第2號外顯子12號密碼子、13號密碼子目標序列:野生型GGTGGCGT(SEQIDNO.5)和突變型NNNNCGT(SEQIDNO.6);擴增出的片段長為91bp。由于設計了特異性高的引物，并且選擇了合適的方法，本發(fā)明的試劑盒適用于對抗表皮生長因子受體的單克隆抗體個體化用藥基因進行快速檢測，可廣泛應用于臨床上抗表皮生長因子受體的單克隆抗體個體化用藥方案制定的基因檢測。與現(xiàn)有技術相比，其應用焦磷酸測序技術可以快速、準確地進行短DNA序列分析，便于構建標準化操作流程；具有高通量、低成本等特點；PCR產物即可直接用于測序，不需進行產物純化等二次處理，操作極為簡便，所需樣品量小。圖I為本發(fā)明K-RAS第2號外顯子12號、13號密碼子均為野生型焦磷酸測序結果；圖2為本發(fā)明K-RAS第2號外顯子12號密碼子為突變型、13號密碼子為野生型焦磷酸測序結果。具體實施例方式下面結合實施例對上述試劑盒及檢測方法進行詳細描述。實施例I:K-RAS第2號外顯子12號密碼子、13號密碼子上游引物5’-TGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTG-3’(SEQIDNO.2)；K-RAS第2號外顯子12號密碼子、13號密碼子下游引物5’-TCGTCCACAAAATGATTCTGAA-3’(SEQIDNO.3)；其中，下游引物的5’進行生物素標記；K-RAS第2號外顯子12號密碼子、13號密碼子測序引物5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCT-3’(SEQIDNO.4)；I.DNA提取I.I實驗前試劑材料準備與檢查工作如下(I)檢查試劑盒保質期以及確保WashBufferI和2中已添加乙醇，并在瓶上相應標識處打勾V;(2)異丙醇(如無，可用無水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高壓滅菌有效期內的I.5mLEppendorf管和各類移液槍頭。I.2從4°C冰箱中取出裝有全血的EDTA抗凝管，上下顛倒數(shù)次混勻；I.3在I.5mLEppendorf管對應標本唯一性標識做好標記；I.4分別移取900uLCellLysisSolution加至滅菌的I.5mLEppendorf管；I.5小心移取300uL全血轉移至上述加有CellLysisSolution的I.5mLEP管；I.6蓋上Eppendorf管蓋，室溫孵育IOmin；I.713,OOOrpm室溫離心20秒；I.8取出Eppendorf管,觀察白色沉淀；I.9開Eppendorf管蓋，手持管底部，傾斜EP管口棄去部分紅色上清，盡量將紅色上清吸盡；I.10蓋上Eppendorf管,用手指彈擊EP管底部,使白色沉淀重懸；1.11移取30011]^NucleiLysisSolution入上述Eppendorf管中，蓋上管，上下顛倒數(shù)次混勻；I.12打開Eppendorf管，移取IOOuLProteinPrecipitationSolution入上述Eppendorf管中，蓋上管管，振蕩器上劇烈振蕩20秒；13，OOOrpm室溫離心3min；I.13移取上清轉移到新的已滅菌I.5mLEppendorf管；I.14移取300uL異丙醇入EP管，蓋上管蓋，上下顛倒數(shù)次混勻，可見白色絮狀gDNA析出；I.1513,OOOrpm室溫離心Imin；I.16打開Eppendorf管，手捏管底部，傾斜管口棄去上清；I.17移取300uL75%乙醇加入Eppendorf管，蓋上管蓋，輕柔上下顛倒洗滌沉淀；I.1813,OOOrpm室溫離心Imin；I.19打開Eppendorf管，手持管底部，傾斜管口棄去上清；I.20在實驗臺上放置新濾紙,倒扣Eppendorf管，吸干液體,將Eppendorf管開蓋側放風干；I.21目測沉淀大小，加入50IOOulDNARehydrationSolution至沉淀；1.22過夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度計進行核酸濃度測定，核酸濃度大于50ng/ul視為合格，如濃度不夠，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加適量的DNARehydrationSolution溶解DNA。I.23在管壁和管蓋上再次標清樣本唯一性編號，并用透明膠帶纏繞保護；1.24保存核酸標本至4°C冰箱；2.聚合酶鏈反應2.I在試劑準備區(qū)配制50UlPCR擴增體系(模板添加除外)，各組分及添加量如下表IOxPCRbiiffer5鄭I權利要求1.一種焦磷酸測序法檢測K-ras基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如下引物(1)擴增引物上游引物5’-TGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTG-3’；下游引物5’-TCGTCCACAAAATGATTCTGAA-3，；其中，下游引物的5’進行生物素標記；(2)測序引物:5，-CTTGTGGTAGTTGGAGCT-3’。2.一種應用權利要求I所述的試劑盒檢測K-RAS基因多態(tài)性多態(tài)性的方法，包括如下步驟(1)DNA提??；(2)聚合酶鏈反應配制50illPCR擴增體系，包含10XPCRbuffer5uI,dNTP3.0yl，上游引物Iyl，下游引物Iu1，1^&(11111，水37111，模板2.0111;按照下面的循環(huán)參數(shù)設置擴增儀95V5min預變性；然后依次在95°C30S,50°C30S,72°C30S，進行40個循環(huán)；再在72°C保持7min,最終保持在4°C，得擴增產物