臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法1

第一章總則

第一條為規(guī)范臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室治理，保證臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)質(zhì)

量，使臨床診斷和治療更為科學(xué)、合理，特制定本方法。

第二條臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)指以臨床診斷治療為目的，以擴(kuò)增檢測(cè)DN

A或RNA為方法的檢測(cè)技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、連接酶鏈反應(yīng)（L

CR）、轉(zhuǎn)錄依靠的放大系統(tǒng)（TAS）自主序列復(fù)制系統(tǒng)（3SR）和鏈替代擴(kuò)

增（SDA）等。

第三條本方法適用于開(kāi)展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)室設(shè)置在二級(jí)以上醫(yī)院。

第四條臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室必須使用經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督治理局批準(zhǔn)的

臨床檢驗(yàn)試劑開(kāi)展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目。

第五條衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心（以下簡(jiǎn)稱(chēng)衛(wèi)生部臨檢中心）和省、自治區(qū)、

直轄市臨床檢驗(yàn)中心（以下簡(jiǎn)稱(chēng)省臨檢中心）負(fù)責(zé)對(duì)所轄行政區(qū)域內(nèi)臨床

基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量監(jiān)督治理工作。

第二章實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和驗(yàn)收

第六條擬設(shè)置臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的醫(yī)療機(jī)構(gòu)按照《臨床基因擴(kuò)增檢

驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室差不多設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》（見(jiàn)附件）籌建實(shí)驗(yàn)室；籌建完成后，由法定代

表人向衛(wèi)生部臨檢中心提出技術(shù)驗(yàn)收申請(qǐng)。申請(qǐng)時(shí)需提交以下材料：

（一）《醫(yī)療機(jī)構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證》復(fù)印件；

（二）可行性研究報(bào)告；

1、擬設(shè)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室機(jī)構(gòu)的所在地醫(yī)療衛(wèi)生資源狀況、本機(jī)

構(gòu)的差不多情形、對(duì)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的需求以及臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室運(yùn)

行的推測(cè)分析；

2、擬設(shè)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置平面圖；

3、擬設(shè)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室將開(kāi)展的檢驗(yàn)項(xiàng)目、實(shí)驗(yàn)設(shè)備條件和有

關(guān)技術(shù)人員資料

第七條衛(wèi)生部臨檢中心和省臨檢中心共同組織有關(guān)專(zhuān)業(yè)的專(zhuān)家組（以下簡(jiǎn)

稱(chēng)專(zhuān)家組），按照《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室差不多設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)提出申請(qǐng)

的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行技術(shù)驗(yàn)收。驗(yàn)收完成后，在20日內(nèi)將驗(yàn)收

報(bào)告寄送至申請(qǐng)機(jī)構(gòu)。

第八條經(jīng)專(zhuān)家組技術(shù)驗(yàn)收合格的醫(yī)療機(jī)構(gòu)將本方法第六條規(guī)定的材料及

專(zhuān)家組驗(yàn)收?qǐng)?bào)告送至省級(jí)行政部備案。在將符合規(guī)定的全部材料送達(dá)省級(jí)

衛(wèi)生行政部門(mén)后15日內(nèi)未收到省級(jí)衛(wèi)生行政部門(mén)不同意的意見(jiàn)，方可開(kāi)展

專(zhuān)家組技術(shù)驗(yàn)收合格的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目。

第九條未經(jīng)專(zhuān)家組驗(yàn)收合格并報(bào)省級(jí)衛(wèi)生行政部門(mén)備案的醫(yī)療機(jī)構(gòu)不得

擅自開(kāi)展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目。

第三章實(shí)驗(yàn)室監(jiān)督治理

第十條臨床基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室必須按照《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)

范》（另發(fā)）開(kāi)展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)工作。

第十一條臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員必須進(jìn)行上崗培訓(xùn)。經(jīng)培訓(xùn)合

格者，由培訓(xùn)單位發(fā)給合格證書(shū)，并將培訓(xùn)合格人員名單報(bào)衛(wèi)生部臨檢中

心備案。獲得培訓(xùn)合格證書(shū)者方可從事臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)工作。

培訓(xùn)單位為衛(wèi)生部臨檢中心，或由省級(jí)衛(wèi)生行政部門(mén)指定并經(jīng)衛(wèi)生部臨檢

中心認(rèn)定的機(jī)構(gòu)。培訓(xùn)時(shí)使用規(guī)定的統(tǒng)一教材。

第十二條以科研為目的的基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目。不得向臨床出具檢驗(yàn)報(bào)告，

不得向病人收取任何費(fèi)用。

第十三條臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室必須按照《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)

范》開(kāi)展室內(nèi)質(zhì)量操縱，并參加衛(wèi)生部臨檢中心組織的室內(nèi)質(zhì)量評(píng)判。

第十四條衛(wèi)生部臨檢中心按照本方法和《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》

和諧、組織省臨檢中心對(duì)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

監(jiān)測(cè)結(jié)果報(bào)省級(jí)衛(wèi)生行政部門(mén)，同時(shí)抄送被監(jiān)測(cè)的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)

室所在醫(yī)療機(jī)構(gòu)。

第十五條衛(wèi)生部臨檢中心或省級(jí)臨檢中心受省級(jí)以上衛(wèi)生行政部門(mén)托付

可對(duì)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢查，現(xiàn)場(chǎng)檢查工作人員在履行職

責(zé)時(shí)應(yīng)出示證件。在進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢查時(shí)，檢查人員有權(quán)調(diào)閱有關(guān)資料，被檢

查機(jī)構(gòu)不得拒絕或隱瞞。

第十六條衛(wèi)生部臨檢中心對(duì)在室間質(zhì)量評(píng)判中不合格的臨床基因擴(kuò)增檢

驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室提出警告，對(duì)連續(xù)二次或三次中有二次發(fā)覺(jué)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)結(jié)

果不合格的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，衛(wèi)生部臨檢中心報(bào)省級(jí)以上衛(wèi)生行

政部門(mén)由省級(jí)以上衛(wèi)生行政部門(mén)責(zé)令其暫停有關(guān)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目，

限期整改。經(jīng)專(zhuān)家組進(jìn)行再次技術(shù)驗(yàn)收并合格，并報(bào)省級(jí)衛(wèi)生行政部門(mén)核

準(zhǔn)后，方可重新開(kāi)展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目。

第十七條關(guān)于未經(jīng)衛(wèi)生部臨檢中心組織的專(zhuān)家組技術(shù)驗(yàn)收合格并報(bào)省級(jí)

衛(wèi)生部門(mén)備案，擅自開(kāi)展臨床基因檢驗(yàn)項(xiàng)目的醫(yī)療機(jī)構(gòu)，由省級(jí)衛(wèi)生行政

部門(mén)依據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)治理?xiàng)l例》第四十七條和《醫(yī)療機(jī)構(gòu)治理?xiàng)l例實(shí)施細(xì)

則》第八十條予以處罰，并予以公告。公告所需費(fèi)用由被公告機(jī)構(gòu)支付。

第十八條顯現(xiàn)下列情形之一的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，由省級(jí)衛(wèi)生行政

部門(mén)責(zé)令其停止開(kāi)展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)，并對(duì)其所在醫(yī)療機(jī)構(gòu)予以公告。

公告所需費(fèi)用由被公告機(jī)構(gòu)支付：

（一）開(kāi)展超出衛(wèi)生部臨檢中心組織的技術(shù)驗(yàn)收合格并報(bào)省級(jí)衛(wèi)生行政部

門(mén)備案臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目的；

（二）使用未經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督治理局批準(zhǔn)的試劑開(kāi)展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)

的；

（三）在臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)中未開(kāi)展室內(nèi)質(zhì)量操縱的；

（四）在臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)中未參加室間質(zhì)量評(píng)判的；

（五）在臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)中弄虛作假的；

（六）以科研為目的的基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目向病人收取費(fèi)用的；

（七）使用未經(jīng)培訓(xùn)合格的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員從事臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的；

第四章附則

第十九條對(duì)采供血機(jī)構(gòu)的基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目的

治理，參照本方法執(zhí)行。

第二十條衛(wèi)生部臨檢中心組織的專(zhuān)家組對(duì)申請(qǐng)開(kāi)展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的

實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行技術(shù)驗(yàn)收所需費(fèi)用按國(guó)家有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

第二十一條本方法由衛(wèi)生部負(fù)責(zé)講明。

第二十二條本方法自公布之日起施行。

附：臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室差不多設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)

按照《臨床檢驗(yàn)擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室治理暫行方法》，制定本標(biāo)準(zhǔn)

一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置原則

（-）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置原則

1、試劑儲(chǔ)存和預(yù)備區(qū)

2、標(biāo)本制備區(qū)

3、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)

4、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

如使用全自動(dòng)分析儀，區(qū)域可適當(dāng)合并。

（二）各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，幸免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品

混用。

（三）進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即試劑儲(chǔ)存和預(yù)備區(qū)

—＞標(biāo)本制備區(qū)一＞擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)一＞擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。

（四）不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員

離開(kāi)各工作區(qū)域時(shí)，不得將工作服帶出。

二、工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標(biāo)準(zhǔn)

（一）試劑儲(chǔ)存和預(yù)備區(qū)

1、2-8C和-15C冰箱

2、混勻器

3、微量加樣器（覆蓋量加OOul）

4、移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）

5、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸

頭（帶濾心）

6、專(zhuān)用工作服和工作鞋

7、專(zhuān)用辦公用品

（二）標(biāo)本制備區(qū)

1、2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱

2、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)

3、混允器

4、水浴箱或加熱模塊

5、微量加樣器（覆蓋量lOOOul）

6、可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）

7、超凈工作臺(tái)

8、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸

頭（帶濾心）

9、專(zhuān)用工作服和工作鞋

10、專(zhuān)用辦公用品

如需處理大分子DNA,應(yīng)具有超聲波水浴儀。

（三）擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)

1、核酸擴(kuò)增儀

2、微量加樣器（覆蓋1-lOOOul）

3、可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）

4、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器

吸頭（帶濾心）

5、專(zhuān)用工作服和工作鞋

6、專(zhuān)用辦公用品

（四）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

視檢驗(yàn)方法不同而定。差不多儀器設(shè)備如下：

1、微量加樣器（覆蓋1-lOOOul）

2、可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）

3、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭（帶濾心）

4、專(zhuān)用工作服和工作鞋

5、專(zhuān)用辦公用品

如何迎接臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)驗(yàn)收

《2003年華東區(qū)臨床檢驗(yàn)中心協(xié)作組臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量治理及新技術(shù)應(yīng)

用高級(jí)研討會(huì)》

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室要緊應(yīng)用把PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)應(yīng)用

于疾病的診斷與治療監(jiān)測(cè)。PCR技術(shù)發(fā)明是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)革命性創(chuàng)

舉，具有深遠(yuǎn)歷史意義，但在上世紀(jì)九十年代中國(guó)，在我國(guó)由于部分醫(yī)部

機(jī)構(gòu)受利益的驅(qū)動(dòng)，在缺乏技術(shù)、設(shè)備以及規(guī)范化治理的情形下，PCR技

術(shù)臨床應(yīng)用泛濫，顯現(xiàn)大量假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，甚至顯現(xiàn)虛假檢測(cè)報(bào)告，

造成檢驗(yàn)結(jié)果和臨床意義應(yīng)用十分紛亂，嚴(yán)峻擾亂正常醫(yī)療秩序，專(zhuān)門(mén)在

性病基因檢測(cè)方面，甚至還帶來(lái)一系列道德倫理、家庭糾紛以及社會(huì)和法

律咨詢(xún)題。PCR技術(shù)臨床應(yīng)用所顯現(xiàn)的一系列咨詢(xún)題引起衛(wèi)生部治理層高

度重視，衛(wèi)生部醫(yī)政司于1988年下發(fā)了衛(wèi)醫(yī)發(fā)[1998]9號(hào)文件宣布PCR技

術(shù)暫停應(yīng)用于臨床診斷。通過(guò)近四年反復(fù)論證，衛(wèi)生部2002年1月140

公布“臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室治理暫行方法”，同年2月20日衛(wèi)生部臨

床檢驗(yàn)中心公布“臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范”。兩個(gè)文件宣布了PCR

技術(shù)臨床應(yīng)用解凍，明確規(guī)定臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展PCR技術(shù)必需

具備的差不多條件：①規(guī)范的PCR實(shí)驗(yàn)室②編寫(xiě)適合本實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量手冊(cè)

③經(jīng)PCR專(zhuān)業(yè)知識(shí)培訓(xùn)的技術(shù)人員(PCR上崗證)④使用有生產(chǎn)批文的P

CR試劑。具備條件的二級(jí)以上醫(yī)院可向衛(wèi)生部或省臨床檢驗(yàn)中心申請(qǐng)技術(shù)

驗(yàn)收。

質(zhì)量治理的歷史

1950年代臨床實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始質(zhì)量操縱(QualityControl,QC);1980年代

參照工業(yè)的GMP治理思路建立良好實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐準(zhǔn)則(GoodLaboratoryPr

actice,GLP)；進(jìn)入質(zhì)量保證(Qualityassurance,QA)；1990年代實(shí)驗(yàn)室引入

質(zhì)量體系認(rèn)證及實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可制度，實(shí)現(xiàn)全面質(zhì)量治理(TQM,TotalQualit

yManagement)o質(zhì)量體系認(rèn)證——IS09000(2000版)；實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可——I

SO/IEC標(biāo)準(zhǔn)17025-2000《校準(zhǔn)和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室資格的通用要求》；ISO/DIS標(biāo)

準(zhǔn)15189-1999“醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量治理?！?/p>

2美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證

?發(fā)證機(jī)構(gòu)：HCFA(HealthGareFinancingAdministrations)，衛(wèi)生保健署

?認(rèn)證依據(jù)，CLOA38,行業(yè)認(rèn)可，強(qiáng)制，體系+能力

,認(rèn)證中介機(jī)構(gòu)：

*JCAHO(JointCommissiononAccreditationofHealthcareOrganizations)

衛(wèi)生氣構(gòu)認(rèn)可聯(lián)合委員會(huì)

*CAP(CollegeofAmericanPathologist)

美國(guó)病理家學(xué)會(huì)

*COLA(CommissiononOfficeLaboratoryAccred-

itation)

大夫?qū)嶒?yàn)室認(rèn)可委員會(huì)

3我國(guó)實(shí)驗(yàn)室合格評(píng)定

?認(rèn)可

*依據(jù)：ISO/IEC17025,15189

*國(guó)家評(píng)審，自愿，體系+能力

,認(rèn)證

*依據(jù)：ISO9000：2000版

*中介機(jī)構(gòu)，自愿，體系

?行業(yè)技術(shù)驗(yàn)收

*《臨床實(shí)驗(yàn)室治理方法》，《江蘇省醫(yī)院檢驗(yàn)科建設(shè)與治理規(guī)范》

*省、市臨床檢驗(yàn)中心，強(qiáng)制，體系+能力

4PCR驗(yàn)收意義及驗(yàn)收依據(jù)

2002年開(kāi)始的PCR實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收工作開(kāi)創(chuàng)臨床檢驗(yàn)技術(shù)準(zhǔn)入的先河、

推動(dòng)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)、規(guī)范檢測(cè)市場(chǎng)、建立醫(yī)療事故預(yù)防機(jī)制。其

依據(jù)為：

《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室治理暫行方法》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號(hào)

《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》衛(wèi)檢字[2002]8號(hào)

《關(guān)于成立臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)專(zhuān)家組的通知》蘇衛(wèi)醫(yī)[2002]42號(hào)

5規(guī)定應(yīng)具有的SOP(13個(gè))

儀器設(shè)備的愛(ài)護(hù)保養(yǎng)程序、儀器設(shè)備的校準(zhǔn)程序、儀器設(shè)備的操作程

序、臨床標(biāo)本收集程序、臨床標(biāo)本的處理(核酸純化)程序、臨床標(biāo)本的

儲(chǔ)存程序、試劑的質(zhì)檢操作程序、消耗品購(gòu)置驗(yàn)收和儲(chǔ)存程序、廢棄物的

處理程序、內(nèi)務(wù)治理程序、室內(nèi)質(zhì)量操縱程序、核酸擴(kuò)增及產(chǎn)物分析檢測(cè)

的操作程序、埋怨處理程序。

6質(zhì)量治理體系

6.1定義在質(zhì)量方面指揮和操縱組織的治理體系。（QualityManageme

ntSystem）治理體系是指建立方針和目標(biāo)并實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)的體系。實(shí)驗(yàn)室

通過(guò)把組織機(jī)構(gòu)、職責(zé)、工作程序、質(zhì)量活動(dòng)過(guò)程和各類(lèi)資源、信息等和

諧統(tǒng)一起來(lái)所形成的有機(jī)整體即為實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量體系。

6.2質(zhì)量體系的文件構(gòu)成第一層：質(zhì)量手冊(cè)（綱領(lǐng)性文件）；第二層：程

序性文件（體系要素的規(guī)定）；第三層：作業(yè)指導(dǎo)書(shū)（具體項(xiàng)目的操作指導(dǎo)）;

第四層：記錄包括表格、簽名、原始記錄、報(bào)告等質(zhì)量記錄和技術(shù)記錄。

6.3質(zhì)量手冊(cè)定義

GB/T6583定義：質(zhì)量手冊(cè)是闡明一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量方針，并描述

質(zhì)量體系的文件。它既是質(zhì)量體系的表征形式，又是質(zhì)量體系建立和運(yùn)行

的綱領(lǐng)。它對(duì)實(shí)驗(yàn)室的組織結(jié)構(gòu)（含職責(zé)）、程序、活動(dòng)能力（過(guò)程）和資

源作出規(guī)定，是實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期遵循的文件。

6.4質(zhì)量手冊(cè)的分類(lèi)

按照手冊(cè)的內(nèi)容和用途分為二類(lèi)：質(zhì)量保證手冊(cè)一一用于證明，供

客戶(hù)使用，質(zhì)量治理手冊(cè)一一用于運(yùn)行，供實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部使用。

6.5質(zhì)量手冊(cè)的作用

編寫(xiě)質(zhì)量手冊(cè)的健全和完善質(zhì)量體系的首要環(huán)節(jié)。按照實(shí)驗(yàn)室的內(nèi)

外因素合理調(diào)整、選擇體系要素，分配和落實(shí)質(zhì)量職責(zé)，理順治理關(guān)系，

明確治理責(zé)任，合理安排各類(lèi)文件的層次，把實(shí)驗(yàn)室積存的體會(huì)變成法規(guī)

性文件。和諧各工作環(huán)節(jié)的準(zhǔn)則。

內(nèi)部質(zhì)量審核的依據(jù)；對(duì)外證實(shí)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量保證能力，提升客戶(hù)

的信任度。

6.6質(zhì)量手冊(cè)的特點(diǎn)

?以客戶(hù)為關(guān)注焦點(diǎn)：以病人為中心，為臨床服務(wù)

?領(lǐng)導(dǎo)作用：制造使職員能夠充分參與實(shí)現(xiàn)目標(biāo)的環(huán)境

,全員參與：各負(fù)其責(zé)

?過(guò)程方法：將資源和活動(dòng)作為過(guò)程進(jìn)行有效治理

?治理的系統(tǒng)方法：各個(gè)過(guò)程的有效連接

?連續(xù)改進(jìn)：按照實(shí)際持續(xù)完善

?基于事實(shí)的決策方法：遵循科學(xué)，實(shí)事求是出報(bào)告

?與供方互利的關(guān)系：相互協(xié)作，共同獲利

6.7質(zhì)量手冊(cè)的結(jié)構(gòu)

?封面

?批準(zhǔn)頁(yè)：包括實(shí)驗(yàn)室名稱(chēng)、標(biāo)志，發(fā)行版次，生效日期，批準(zhǔn)人簽名，

手冊(cè)編號(hào)，受控狀態(tài)。

?實(shí)驗(yàn)室公平性聲明

?修訂頁(yè)：以表格描述修訂序號(hào)、修訂的章節(jié)條款和簡(jiǎn)要內(nèi)容、批準(zhǔn)人及

日期。

?名目：各章節(jié)條款的名稱(chēng)及頁(yè)碼

?前言：介紹實(shí)驗(yàn)室的一樣情形和手冊(cè)的適用范疇以及手冊(cè)中術(shù)語(yǔ)或縮略

語(yǔ)的定義

?手冊(cè)的治理：對(duì)手冊(cè)的儲(chǔ)存、分發(fā)、評(píng)審、修訂以及保密作出規(guī)定

?質(zhì)量方針及目標(biāo)

?組織結(jié)構(gòu)及人員責(zé)權(quán)益關(guān)系

?要素描述：由系列SOP文件對(duì)溯源、人、機(jī)、料、樣、法、測(cè)等質(zhì)量諸

要素的陳述

?支持性文件：包括實(shí)驗(yàn)室平面圖、人員一覽表、儀器設(shè)備一覽表、引用

標(biāo)準(zhǔn)及參考文獻(xiàn)等

6.8標(biāo)準(zhǔn)操作程序

StandardOperationalProcedure,簡(jiǎn)稱(chēng)SOP。程序的定義為：為進(jìn)行某項(xiàng)活動(dòng)

所規(guī)定的途徑。SOP是臨床實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部以文件的形式對(duì)質(zhì)量活動(dòng)用規(guī)定的

方法進(jìn)行連續(xù)而恰當(dāng)?shù)牟倏v。實(shí)驗(yàn)室的SOP應(yīng)涵蓋所有的質(zhì)量活動(dòng)，包括

檢測(cè)或校準(zhǔn)打算、治理性程序、技術(shù)性程序、項(xiàng)目操作程序和記錄表格等。

由于阻礙每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量活動(dòng)的條件和因素不一樣，一個(gè)SOP只在某個(gè)

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)有效，而不一定適用于其他實(shí)驗(yàn)室。

6.9標(biāo)準(zhǔn)操作程序的一樣要求

?對(duì)完成各項(xiàng)質(zhì)量活動(dòng)的方法作出規(guī)定，每個(gè)SOP都應(yīng)對(duì)一個(gè)或一組相互

關(guān)系的活動(dòng)進(jìn)行描述；

?每個(gè)SOP應(yīng)講明該項(xiàng)質(zhì)量各環(huán)節(jié)的輸入、轉(zhuǎn)換和輸出所需的文件、物資、

人員、記錄以及它們與有關(guān)活動(dòng)的接口關(guān)系；

?規(guī)定開(kāi)展質(zhì)量活動(dòng)的各個(gè)環(huán)節(jié)的物資、人員、信息和環(huán)境等方面應(yīng)具備

的條件；

?明確每個(gè)環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)換過(guò)程中各項(xiàng)因素的要求，即由誰(shuí)做、做什么、做到什

么程序、達(dá)到什么要求，如何操縱、形成什么記錄和報(bào)告，以及相應(yīng)的審

批手續(xù)；

?規(guī)定在質(zhì)量活動(dòng)中需要注意的例外或?qū)ｉT(mén)情形的糾正措施；

?SOP應(yīng)簡(jiǎn)練、明確和易懂同時(shí)工作人員熟練把握和嚴(yán)格遵守。

6.10舉薦PCR實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量手冊(cè)名目

1.質(zhì)量方針和宗旨

2.工作制度

2.1實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置、布局及組織結(jié)構(gòu)

2.2實(shí)驗(yàn)室內(nèi)務(wù)治理制度

2.3實(shí)驗(yàn)室的人員配置及治理制度

2.4生物防護(hù)與安全制度

2.5實(shí)驗(yàn)室廢棄物處理制度

2.6實(shí)驗(yàn)室清潔消毒制度

2.7儀器設(shè)備的治理制度

2.8儀器、試劑、耗材購(gòu)置程序及治理制度

2.9臨床標(biāo)本的治理制度

2.10實(shí)驗(yàn)室記錄的治理制度

2.11質(zhì)量操縱工作治理制度

2.12結(jié)果報(bào)告治理制度

2.13崗位責(zé)任制

2.14埋怨制度

3.操作指導(dǎo)書(shū)(SOP)

3.1消毒標(biāo)準(zhǔn)操作程序

3.2超凈工作臺(tái)使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序

3.3超凈工作臺(tái)愛(ài)護(hù)和保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序

3.4PCR儀使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序

3.5PCR儀愛(ài)護(hù)和保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序

3.6臺(tái)式離心機(jī)使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序

3.7高速冷凍離心操作標(biāo)準(zhǔn)操作程序

3.8移液器使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序

3.9加樣器校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序

3.10冰箱愛(ài)護(hù)和保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序

3.11電熱恒溫水浴箱操作程序

3.12電子天平使用和校正操作程序

3.13可移動(dòng)紫外消毒車(chē)使用操作程序

3.14溫度計(jì)校準(zhǔn)程序

3.15試劑的質(zhì)檢操作程序

3.16標(biāo)本唯獨(dú)標(biāo)識(shí)編號(hào)編制規(guī)則

3.17臨床標(biāo)本的采集及處理操作程序

3.18臨床標(biāo)本的儲(chǔ)存程序

3.19乙肝病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序

3.20室內(nèi)質(zhì)量操縱標(biāo)準(zhǔn)操作程序

3.21室間質(zhì)評(píng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序

4.引用圖表

4.1實(shí)驗(yàn)室組織結(jié)構(gòu)圖

4.2實(shí)驗(yàn)室工作人員一覽表

4.3人員培訓(xùn)打算及培訓(xùn)記錄表

4.4要緊儀器設(shè)備一覽表

4.5臨床送檢標(biāo)本流程圖

4.6PCR擴(kuò)增可同意標(biāo)本記錄表

4.7PCR擴(kuò)增拒收標(biāo)本記錄表

4.8室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果記錄表

4.9室間質(zhì)控記錄表

4.10消耗性材料驗(yàn)收記錄表

4.11試劑驗(yàn)收記錄表

4.12故障處理表

4.13儀器設(shè)備使用記錄表

4.14儀器設(shè)備愛(ài)護(hù)保養(yǎng)記錄表

4.15實(shí)驗(yàn)室清潔消毒記錄表

4.16工作區(qū)溫度、濕度記錄表

4.17埋怨記錄表

4.18標(biāo)本超低溫儲(chǔ)存記錄表

4.19應(yīng)急處理記錄表

4.20垃圾處理記錄表

4.21冰箱溫度記錄表

4.22水浴箱溫度記錄表

4.23移動(dòng)紫外消毒車(chē)記錄表

4.24設(shè)備校正記錄表

4.25檢測(cè)結(jié)果報(bào)告流程

4.26報(bào)告單樣張

6.11文件格式

一目的

二范疇

三職責(zé)

四工作流程

五引用文件及表格

6.12寫(xiě)作技巧

?目的：WHY,什么原因要開(kāi)展這項(xiàng)活動(dòng)

?范疇：WHAT,活動(dòng)涉及的方面

?職責(zé)：WHO+WHAT,誰(shuí)做，誰(shuí)負(fù)責(zé)

?工作流程：列出活動(dòng)順序和細(xì)節(jié)，明確各環(huán)節(jié)“輸入一一轉(zhuǎn)換一一輸出”,

即做何事（WHAT）、何人做（WHO）、何時(shí)做（WHEN）、何地做（WHE

RE）、如何做（HOW）

?引用文件和表格：

開(kāi)展此項(xiàng)活動(dòng)涉及的文件、標(biāo)準(zhǔn)以及使用的表格、證明文件和記錄儲(chǔ)存期

7評(píng)審中常見(jiàn)咨詢(xún)題

7.1手冊(cè)

文件不全，無(wú)系統(tǒng)性；質(zhì)量要素描述不全；格式不對(duì)；與實(shí)際工作

脫節(jié)；無(wú)現(xiàn)行有效性（無(wú)手簽，各區(qū)無(wú)相應(yīng)手冊(cè)）；記錄不全、不規(guī)范

7.2人員

人員檔案：每人一個(gè)檔案袋，有關(guān)資格證書(shū)（如上崗證）、培訓(xùn)、

技能和經(jīng)歷等。

培訓(xùn)打算及實(shí)施記錄：每人有年度、季度、月的培訓(xùn)內(nèi)容及實(shí)施記錄；內(nèi)

容包括外出學(xué)習(xí)、進(jìn)修，內(nèi)部質(zhì)量手冊(cè)學(xué)習(xí)、業(yè)務(wù)學(xué)習(xí)、新項(xiàng)目引進(jìn)等。

7.3設(shè)施與環(huán)境

通風(fēng)、紫外、清潔、消毒的程序及記錄、生物安全防護(hù)的程序及記

錄、生物垃圾的處理。

7.4儀器設(shè)備

采購(gòu)程序及驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)；校準(zhǔn)程序及狀態(tài)標(biāo)識(shí)，使用、愛(ài)護(hù)、保養(yǎng)的

程序及記錄；檔案：每個(gè)與檢測(cè)質(zhì)量有關(guān)的設(shè)備均應(yīng)建檔，內(nèi)容包括：設(shè)

備的名稱(chēng)；制造商名稱(chēng)、型號(hào)、序號(hào)或其它唯獨(dú)性標(biāo)識(shí)；接收日期和啟用

日期；）目前放置地點(diǎn)；接收時(shí)的狀態(tài)（例如全新的、經(jīng)改裝的）；儀器使

用講明書(shū)或其復(fù)印件；校準(zhǔn)和/或檢測(cè)的日期和結(jié)果以及下次校準(zhǔn)和/或檢測(cè)

的日期；迄今所進(jìn)行的愛(ài)護(hù)和今后愛(ài)護(hù)打算的細(xì)節(jié)；損壞、故障、改裝或

修理的歷史。

7.4料（試劑、耗品）

采購(gòu)程序及領(lǐng)用記錄，質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)、程序及記錄，應(yīng)急程序；缺貨、

試劑變質(zhì)；室內(nèi)質(zhì)控品。

7.5樣（品）

標(biāo)本唯獨(dú)編號(hào)，年月日項(xiàng)目順序號(hào)；標(biāo)本采集標(biāo)準(zhǔn)操作程序；標(biāo)本

同意（拒收）標(biāo)準(zhǔn)、交接記錄；標(biāo)本儲(chǔ)存、銷(xiāo)毀的程序及記錄；標(biāo)本處理

標(biāo)準(zhǔn)操作程序

7.6（方）法

方法學(xué)的有效性一一依據(jù)；SOP的合理性一一生搬硬套；分區(qū)操作

的協(xié)作一一流程合理；質(zhì)控點(diǎn)的安排一一提取效率、擴(kuò)增效率；基線(xiàn)的調(diào)

整——CT值、本底熒光值。

7.7（檢）測(cè)

?室內(nèi)質(zhì)控的SOP：耗品質(zhì)檢，試劑質(zhì)檢，質(zhì)控方法（糾錯(cuò)措施），質(zhì)控圖。

-室間質(zhì)評(píng)的SOP：糾偏措施

7.8報(bào)告

,發(fā)放范疇：門(mén)診、病區(qū)、外單位

?發(fā)放方式：保密、電子、郵件

?報(bào)告單的格式：唯獨(dú)編號(hào)、檢測(cè)下限、實(shí)驗(yàn)室申明

?審核、標(biāo)準(zhǔn)、不合格報(bào)告的處理

7.9埋怨

?實(shí)驗(yàn)室服務(wù)、質(zhì)量改進(jìn)的依據(jù)

?對(duì)象：病人、大夫、工作人員。SOP應(yīng)明確方式、職責(zé)、反饋、記錄。

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室治理暫行方法

如何迎接臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)驗(yàn)收

設(shè)計(jì)與驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范

為使基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)有效地應(yīng)用于臨床，更好地為疾病的預(yù)防、診

斷和治療服務(wù)，保證檢驗(yàn)質(zhì)量，特制定本規(guī)范。

一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置及其治理

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置詳見(jiàn)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室治

理暫行方法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號(hào)文）附件《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室差不多

設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》。為幸免污染，必須嚴(yán)格遵循《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置標(biāo)

準(zhǔn)》設(shè)置臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室。

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室四個(gè)隔開(kāi)的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專(zhuān)用的儀

器設(shè)備。各區(qū)域都必須有明確的標(biāo)記，以幸免設(shè)備物品如加樣器或試劑等

從其各自的區(qū)域內(nèi)移出從而造成不同的工作區(qū)域間設(shè)備物品發(fā)生混淆。進(jìn)

入各個(gè)工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和預(yù)備區(qū)、

標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)（簡(jiǎn)稱(chēng)擴(kuò)增區(qū)）至產(chǎn)物分析區(qū)，幸

免發(fā)生交叉污染。在不同的工作區(qū)域應(yīng)使用不同顏色或有明顯區(qū)別標(biāo)志的

工作服，以便于鑒別。此外，當(dāng)工作者離開(kāi)工作區(qū)時(shí)，不得將各區(qū)特定的

工作服帶出。

清潔方法不當(dāng)也是污染發(fā)生的一個(gè)要緊緣故，因此實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)按試劑

貯存和預(yù)備區(qū)至擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)有其各自

的清潔用具以防止交叉污染。

（一）試劑貯存和預(yù)備區(qū)

下述操作在該區(qū)進(jìn)行：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制

備。

貯存試劑和用于標(biāo)本制備的材料應(yīng)直截了當(dāng)運(yùn)送至試劑貯存和預(yù)備區(qū)，不

能通過(guò)產(chǎn)物分析區(qū)。在打開(kāi)含有反應(yīng)混合液的離心管或試管前，應(yīng)將其快

速離心數(shù)秒。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯

存試劑。當(dāng)貯存試劑溶液經(jīng)檢查可用后，應(yīng)將其分裝貯存?zhèn)溆?，幸免由?/p>

經(jīng)常打開(kāi)反應(yīng)管吸液而造成污染。

含反應(yīng)混合液的離心管或試管在冰凍前都應(yīng)快速離心數(shù)秒。大多數(shù)用于擴(kuò)

增的試劑都應(yīng)冰凍貯存。為幸免因單次反應(yīng)取液而頻繁的凍融主貯存試劑，

應(yīng)分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積按照通常在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一次

測(cè)定所需的擴(kuò)增反應(yīng)數(shù)來(lái)決定。

主反應(yīng)混合液的組成成份專(zhuān)門(mén)是聚合酶的適用性和穩(wěn)固性通過(guò)預(yù)試驗(yàn)來(lái)檢

查，評(píng)判結(jié)果必須有書(shū)面報(bào)告。關(guān)于"熱啟動(dòng)"技術(shù)（在第一個(gè)高溫變性步驟

后加入酶），聚合酶也可不包含在主反應(yīng)混合液中。

在整個(gè)本區(qū)的實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，

操作中使用一次性帽子也是一個(gè)有效地防止污染的措施。

嚴(yán)禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓處理。

工作終止后必須趕忙對(duì)工作區(qū)進(jìn)行清潔。本工作區(qū)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面應(yīng)可耐受

諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面的紫外照耀應(yīng)方便

有效。由于紫外照耀的距離和能量對(duì)去污染的成效專(zhuān)門(mén)關(guān)鍵，因此可使用

可移動(dòng)紫外燈（254nm波長(zhǎng)），在工作完成后調(diào)至實(shí)驗(yàn)臺(tái)上60?90cm內(nèi)照耀。

由于擴(kuò)增產(chǎn)物僅幾百bp,對(duì)紫外線(xiàn)損害不敏銳，因此紫外照耀擴(kuò)增片段必

須延長(zhǎng)照耀時(shí)刻，最好是照耀過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)室及其設(shè)備的使用必須有日常記

錄。

（二）標(biāo)本制備區(qū)

下述操作在該區(qū)進(jìn)行：臨床標(biāo)本的儲(chǔ)存，核酸（RNA、DNA）提取、貯存及

其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA時(shí)cDNA的合成。

要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會(huì)發(fā)動(dòng)氣溶膠所致的污染，因

此應(yīng)幸免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)?？赏ㄟ^(guò)在本區(qū)內(nèi)設(shè)置正壓條件幸免從鄰

近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。為幸免樣本間的交叉污染，加入待測(cè)核酸后,

必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對(duì)具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，必須有

明確的樣本處理和滅活程序。

用過(guò)的加樣器吸頭必須放入專(zhuān)門(mén)的消毒（例如含次氯酸鈉溶液）容器內(nèi)。實(shí)驗(yàn)

室桌椅表面每次工作后都要清潔，實(shí)驗(yàn)材料（原始血標(biāo)本、血清標(biāo)本、提取

中的標(biāo)本與試劑的混合液等）如顯現(xiàn)外濺，則必須分別處理并作出記錄。

對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)適當(dāng)?shù)淖贤庹找?54nm波長(zhǎng)，與工作臺(tái)面近距離）適合于滅活去污

染?？梢苿?dòng)紫外線(xiàn)管燈可用來(lái)確保工作后對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面的充分照耀。

樣本處理對(duì)核酸擴(kuò)增有專(zhuān)門(mén)大阻礙，必須使用有效的核酸提取方法，可在

開(kāi)展臨床標(biāo)本檢測(cè)前對(duì)提取方法進(jìn)行評(píng)判。

用于RNA擴(kuò)增檢測(cè)的樣本制備好以后，應(yīng)趕忙進(jìn)行cDNA合成，因?yàn)閏D

NA鏈較RNA穩(wěn)固，儲(chǔ)存相對(duì)容易。為保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的需要，應(yīng)在標(biāo)本

制備區(qū)設(shè)置一個(gè)以上的溫育裝置。

cDNA合成的理想溫度依所使用的酶而定，傾向于使用一步法：即使用在擴(kuò)

增反應(yīng)緩沖液條件下具有逆轉(zhuǎn)錄活性的熱穩(wěn)固的DNA聚合酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，

其較cDNA合成后再開(kāi)蓋以調(diào)劑緩沖液或加入聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增發(fā)生污染的

可能性降低。

待測(cè)RNA的cDNA拷貝須儲(chǔ)存在標(biāo)本制備區(qū)，不得在本區(qū)對(duì)樣本進(jìn)行PC

R擴(kuò)增。

（三）擴(kuò)增區(qū)

下述工作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：DNA或cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板

和合成的cDNA（來(lái)自樣本制備區(qū)）的加入和主反應(yīng)混合液（來(lái)自試劑貯存和

制備區(qū)）制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測(cè)定中，通常

在第一輪擴(kuò)增后必須打開(kāi)反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性，第

二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。

不能從本區(qū)再進(jìn)入任何"上游"區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以幸免氣溶膠從本區(qū)

漏出。

為幸免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動(dòng)。如有加樣則應(yīng)在

超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。打開(kāi)預(yù)處理過(guò)的反應(yīng)混合液時(shí)必須防止液體濺出，專(zhuān)門(mén)是

在巢式擴(kuò)增步驟之間。一個(gè)簡(jiǎn)單的方法是在打開(kāi)反應(yīng)管前快速離心數(shù)秒。

可使用體積較小的離心機(jī)，因其所占實(shí)驗(yàn)臺(tái)面小，易于用一只手操作，適

合于大多數(shù)超凈臺(tái)。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防污染作用，但

必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種連續(xù)性的污染源。用過(guò)的加樣

器必須注意清潔消毒。

完成操作及每天工作后都必須對(duì)實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面進(jìn)行清潔和消毒，紫外照耀方

法與前面區(qū)域相同。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄。

（四）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

下述操作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：擴(kuò)增片段的測(cè)定。

核酸擴(kuò)增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板上探針雜交方法（同

位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記）、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Sout

hern轉(zhuǎn)移、核酸測(cè)序方法等。目前國(guó)內(nèi)的商品試劑盒絕大部分均采納非同

位素標(biāo)記的微孔板上探針雜交方法，即PCR-ELISA方法，也有膜上探針雜

交方法。

本區(qū)是最要緊的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源，因此必須注意幸免通過(guò)本區(qū)的物品及

工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，必須使

用洗板機(jī)洗板，廢液必須收集至lmol/LHC1中，同時(shí)不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傾倒,

而應(yīng)至遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室的地點(diǎn)棄掉。用過(guò)的吸頭也必須放至lmol/LHC1

中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。

由于本區(qū)有可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如謨化乙錠、丙烯酰

胺、甲醛或同位素等，故應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。

本區(qū)的清潔消毒和紫外照耀方法同前面區(qū)域。本區(qū)如采納負(fù)壓條件或減壓

情形下（如安裝排風(fēng)扇）可減少擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至前面區(qū)域的可能性。

二、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證涉及到整個(gè)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的所有時(shí)期，

即測(cè)定分析前的標(biāo)本采集處理、測(cè)定中的核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析以及

測(cè)定后的結(jié)果報(bào)告等。

（一）標(biāo)本的采集

常用于基因擴(kuò)增檢測(cè)的臨床標(biāo)本包括EDTA或枸檬酸鈉抗凝全血或骨髓、

血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時(shí)，應(yīng)使用一次

性密閉容器，如真空采血管。當(dāng)使用非密閉采樣系統(tǒng)時(shí)，如尿、分泌物和

骨髓的采樣，必須注意防止來(lái)自采樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣時(shí)必

須戴一次性手套。

玻璃器皿在使用前應(yīng)高壓處理，因?yàn)椴Ａ髅蟪：胁灰资Щ畹腞NA酶。

最好是熱滅菌，250（烘烤4小時(shí)以上可使RNA酶永久性失活。

全血和骨髓標(biāo)本必須進(jìn)行抗凝處理。EDTA和枸椽酸鹽是首選的抗凝劑。不

能使用肝素抗凝，因?yàn)楦嗡厥荰aq酶的強(qiáng)抑制劑，而且在其后的核酸提取

步驟中專(zhuān)門(mén)難去除。

臨床用于RNA（如HCVRNA）擴(kuò)增檢測(cè)的血標(biāo)本建議進(jìn)行抗凝處理，并盡

快（3小時(shí)以?xún)?nèi)）分離血漿，以幸免RNA的降解。如未作抗凝處理，則抽血

后，必須在1小時(shí)內(nèi)分離血清。

（二）標(biāo)本的穩(wěn)固化處理

用于DNA擴(kuò)增檢測(cè)的標(biāo)本，采集后一樣不需要專(zhuān)門(mén)的穩(wěn)固化處理，但標(biāo)本

應(yīng)及時(shí)送至實(shí)驗(yàn)室。

由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA測(cè)定的標(biāo)本有時(shí)必須進(jìn)行穩(wěn)

固化處理，如流行病學(xué)調(diào)查的現(xiàn)場(chǎng)采樣。異硫氟酸艦i鹽（Guanidinethiocyan

ate,GITC）可使DNA酶和RNA酶趕忙失活，因此在采集標(biāo)本時(shí)，可將標(biāo)本

材料如血清或血漿按1:4的比例加至含有5mol/LGITC的試管中，從而使

血清（漿）中的RNA酶不可逆失活。經(jīng)上述穩(wěn)固化處理后，標(biāo)本一樣不需要

冷藏即可郵寄。關(guān)于特定的檢測(cè)項(xiàng)目，上述穩(wěn)固化處理方法的成效怎么講

如何，要使用相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)定方法來(lái)評(píng)判。

（三）標(biāo)本的運(yùn)送

標(biāo)本采集后必須盡快送至實(shí)驗(yàn)室。通過(guò)適當(dāng)穩(wěn)固化處理的標(biāo)本可在常溫下

通過(guò)郵寄運(yùn)送。如用于DNA擴(kuò)增檢測(cè)的EDTA抗凝全血標(biāo)本及用于RNA

擴(kuò)增檢測(cè)的經(jīng)GITC穩(wěn)固化處理的標(biāo)本。通常在運(yùn)送時(shí)，應(yīng)采納不易破裂的

容器裝載標(biāo)本。用于RNA檢測(cè)的標(biāo)本，如果未經(jīng)穩(wěn)固化處理，則必須速凍

后，放在干冰中運(yùn)送。

（四）標(biāo)本的貯存

臨床體液標(biāo)本如血清/血漿等可于-7CTC下長(zhǎng)時(shí)刻貯存。用于DNA測(cè)定的已

純化核酸樣本可在10mmol/LTris-1mmol/LEDTA緩沖液（pH7.5-8.0）中

4（儲(chǔ)存。用于RNA測(cè)定的已純化核酸樣本應(yīng)在緩沖液中-8（TC或液氮中貯

存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在-20C即可。用GITC處理的RNA標(biāo)本在

室溫可儲(chǔ)存7天。

（五）標(biāo)本的處理（核酸提取）

標(biāo)本處理即核酸提取純化是決定擴(kuò)增檢測(cè)成敗的關(guān)鍵性步驟，在使用商品

核酸提取試劑提取臨床標(biāo)本中的核酸模板前，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行充分評(píng)判以驗(yàn)證

其提取的有效性。通常，核酸制備質(zhì)量不高是由于抑制物去除不完全所致,

抑制物可能來(lái)源于標(biāo)本本身（如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物）或核酸提取過(guò)

程中殘留的有機(jī)溶劑（如酚、氯仿等），這些物質(zhì)對(duì)其后的Taq酶擴(kuò)增反應(yīng)步

驟具有強(qiáng)烈的抑制作用，從而阻礙靶核酸的擴(kuò)增測(cè)定。當(dāng)標(biāo)本為痰時(shí)，則

必須先進(jìn)行液化處理，再提取核酸。需注意的是，液化時(shí)不能加熱，液化

時(shí)刻不能過(guò)長(zhǎng)。此外，當(dāng)靶核酸為RNA時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)定失敗的常見(jiàn)

緣故是標(biāo)本在運(yùn)送前未經(jīng)充分的穩(wěn)固化處理及核酸提取試劑的RNA酶的污

染。關(guān)于前者，要核查測(cè)定分析前的步驟，如果發(fā)覺(jué)有RNA降解的證據(jù)，

實(shí)驗(yàn)室則應(yīng)拒絕同意標(biāo)本，要求重新采取標(biāo)本，并對(duì)運(yùn)送者給以詳細(xì)的指

導(dǎo)。關(guān)于后者，建議使用高質(zhì)量的商品核酸提取試劑。

（六）靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和擴(kuò)增

1、靶RNA的逆轉(zhuǎn)錄

cDNA合成為逆轉(zhuǎn)錄PCR中的第一個(gè)酶反應(yīng)步驟，所產(chǎn)生的cDNA為靶R

NA的反向互補(bǔ)鏈，為后面擴(kuò)增的模板。下述因素通常阻礙cDNA合成的效

率：（1）逆轉(zhuǎn)錄效率的降低或完全缺乏。其可能的緣故有逆轉(zhuǎn)錄酶質(zhì)量不高、

試劑降解變質(zhì)或加樣錯(cuò)誤等；（2）用于逆轉(zhuǎn)錄的標(biāo)本中存在逆轉(zhuǎn)錄或Taq酶

的抑制物（如酚、氯仿、血紅素等）；（3）RNA酶的存在導(dǎo)致RNA的降解。

2、核酸的擴(kuò)增

有多種因素可引起核酸擴(kuò)增檢測(cè)的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，如擴(kuò)增靶核酸中

抑制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不對(duì)、Mg++濃度不佳、患者標(biāo)本或試

劑受污染等。擴(kuò)增儀孔中熱傳導(dǎo)的均一性極為重要，必須定期對(duì)擴(kuò)增儀的

溫度操縱和加熱模塊中熱傳導(dǎo)的一致性進(jìn)行檢查，以幸免假陰性結(jié)果。

（七）污染

在實(shí)際工作中，常見(jiàn)有以下幾種污染類(lèi)型：擴(kuò)增片段的污染（產(chǎn)物污染）；天

然基因組DNA的污染、試劑污染（貯存液或工作液）以及標(biāo)本間交叉污染（如

氣溶膠從一個(gè)陽(yáng)性標(biāo)本擴(kuò)散到原本陰性的標(biāo)本）。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室

中污染的最要緊來(lái)源是擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。

由于一旦發(fā)生污染后，再?lài)@實(shí)驗(yàn)室來(lái)查找污染源不僅耗時(shí)而且還專(zhuān)門(mén)繁

瑣，因此防止污染重在預(yù)防。但如果發(fā)生了污染，實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到

發(fā)覺(jué)了污染源為止，同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢。

1、測(cè)定分析前的污染源

測(cè)定分析前實(shí)驗(yàn)材料的污染要緊來(lái)自非病人標(biāo)本來(lái)源的核酸。

2、測(cè)定分析時(shí)期的污染源

通常，測(cè)定分析時(shí)期的每一步都可能發(fā)生對(duì)樣本的污染。反應(yīng)混合液的任

何成分及核酸的制備和反應(yīng)建立時(shí)期所涉及到的實(shí)驗(yàn)設(shè)備的任何部位差不

多上可能的污染源。如受污染的試劑（例如牛血清白蛋白，明膠或礦物油）、

商品酶制劑、消耗品（如反應(yīng)管，吸頭）和實(shí)驗(yàn)設(shè)備（如加樣器、離心機(jī)）等。

在前面三個(gè)工作區(qū)中，不當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作會(huì)引起所使用的試劑、消耗品或?qū)?/p>

驗(yàn)設(shè)備的污染。而在產(chǎn)物分析區(qū)，當(dāng)吸取擴(kuò)增產(chǎn)物用于檢測(cè)時(shí)，專(zhuān)門(mén)容易

引起污染，因此必須制定標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）,并嚴(yán)格執(zhí)行。

3、污染的幸免

要幸免污染，第一應(yīng)是預(yù)防而不是排除污染，前面所述對(duì)工作區(qū)的嚴(yán)格劃

分的目的即是為了預(yù)防污染。

為幸免往常測(cè)定中所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，可設(shè)法將其破壞掉。如在擴(kuò)

增反應(yīng)中用dUTP取代部分dTTP,使得產(chǎn)生的特異擴(kuò)增片段含有尿喀唳，

如此擴(kuò)增前在反應(yīng)混合液中加入尿喀哽糖昔酶（UNG）,可破壞來(lái)自往常測(cè)定

的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而幸免其對(duì)以后要進(jìn)行的擴(kuò)增測(cè)定的污染。另外一種方法

是連續(xù)的長(zhǎng)波紫外燈照耀，通過(guò)異補(bǔ)骨脂素光化學(xué)產(chǎn)生DNA加合物，由于

DNA加合物對(duì)擴(kuò)增沒(méi)有反應(yīng)但又不阻礙PCR后雜交過(guò)程，因此這種方法也

能防止污染。

上述防污染方法只在一定程度上有效，因此不能用其來(lái)替代嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室

設(shè)置和治理，專(zhuān)門(mén)是這些方法不能防止外來(lái)非擴(kuò)增的天然DNA的污染。

4、去除污染的措施

工作完后必須定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室采取有效的去污染措施，結(jié)合各種不同的方法

可達(dá)到最佳成效。去污染措施包括但不僅限下面幾種：（1）用10%（v/v）次氯

酸鈉清潔表面；（2）試驗(yàn)后長(zhǎng)時(shí)刻的紫外照耀實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)面和其他表面；（3）

實(shí)驗(yàn)設(shè)備如加樣器的高壓消毒。

（八）擴(kuò)增產(chǎn)物的分析

擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)定有各種方法，如電泳、限制性酶切、斑點(diǎn)印跡、探針雜交、

測(cè)序、分光光度法定量等，但臨床PCR檢驗(yàn)項(xiàng)目差不多上都使用探針雜交

方法。

雜交結(jié)果不充分的緣故可能是基因探針不合適、標(biāo)記方法不對(duì)、對(duì)探針的

標(biāo)記不夠、雜交或洗滌方法不合適等。

最常使用的基因探針有：DNA片段、合成的寡核甘酸和體外轉(zhuǎn)錄的反義R

NA探針。探針的標(biāo)記物常用的有生物素、地高辛、熒光素和同位素等。

在擴(kuò)增后的雜交檢測(cè)中，應(yīng)該嚴(yán)格遵守商品試劑盒確定的雜交程序和雜交

條件。溫度太低或離子強(qiáng)度太高都會(huì)降低雜交的嚴(yán)格性，還會(huì)給檢測(cè)信號(hào)

的特異性帶來(lái)負(fù)面阻礙。相反，提升溫度和/或降低離子強(qiáng)度會(huì)增加雜交的

嚴(yán)格性。因此，嚴(yán)密操縱溫度和試劑的離子強(qiáng)度是幸免假陽(yáng)性和假陰性結(jié)

果的先決條件。要注意的是，溫度和離子強(qiáng)度不能同時(shí)改變。

（九）質(zhì)量操縱

質(zhì)量操縱包括兩個(gè)方面，即室內(nèi)質(zhì)量操縱（以下簡(jiǎn)稱(chēng)質(zhì)控）和室間質(zhì)量評(píng)判。

1、室內(nèi)質(zhì)量操縱

必須對(duì)DNA和RNA分析的各步進(jìn)行質(zhì)量操縱，以幸免假陽(yáng)性和假陰性，

保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。由于核酸擴(kuò)增測(cè)定的高敏銳性，因此標(biāo)

本制備、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增本身和產(chǎn)物分析中的每一步都要求有質(zhì)控措施。

⑴標(biāo)本制備：常用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)DNA提取成效，以判定所提取

的DNA是否發(fā)生降解。用常規(guī)的手工提取方法制備的DNA的平均長(zhǎng)度一

樣為?lOOkb,用適合PCR的DNA提取試劑盒制備的DNA的長(zhǎng)度平均范疇

為30-40kbo明顯顯現(xiàn)降解的DNA（在1和lOkb的低分子量范疇內(nèi)）在經(jīng)瓊

脂糖凝膠電泳分離和用溟化乙錠染色后也可見(jiàn)強(qiáng)的熒光信號(hào)。用對(duì)甲基化

不敏銳的限制性?xún)?nèi)切酶（