一種檢測炭疽芽孢桿菌的方法

一種檢測炭疽芽孢桿菌的方法專利名稱：一種檢測炭疽芽孢桿菌的方法技術(shù)領(lǐng)域：本發(fā)明涉及一種檢測炭疽芽孢桿菌的方法。背景技術(shù)：炭疽是嚴(yán)重威脅人類健康的烈性傳染病，其病原體為炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)。由于其高毒性，炭疽桿菌是一種潛在的生物武器，曾被帝國主義作為致死戰(zhàn)劑之一。目前，皮膚炭疽在我國各地還有散在發(fā)生，不應(yīng)放松警惕。因此，發(fā)展快速、靈敏的炭疽桿菌檢測方法具有重要意義。卩遼菌體裂解酶(bacteriophagelysins)是卩遼菌體在感染宿主菌末期表達(dá)的蛋白質(zhì)，它通過水解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖使子代噬菌體釋放。Y噬菌體裂解酶(PlyG)能夠特異性地殺死炭疽桿菌，同時也能夠裂解蠟樣芽孢桿菌RSVFl菌株，且RSVFl菌株是唯一對PlyG敏感的蠟樣芽孢桿菌菌株。MiriYemini等人就曾以RSVFl菌株為模型，研究了基于噬菌體的炭疽桿菌檢測方法。李曼等人也RSVFl菌株為模型進(jìn)行了殺滅試驗的相關(guān)研究。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測炭疽芽孢桿菌的方法。本發(fā)明提供了一種用于定量檢測蠟樣芽孢桿菌RSVFl的試劑盒，包括PlyG蛋白；所述試劑盒的用途為如下(a)或(b):(a)定量檢測蠟樣芽孢桿菌RSVFl；(b)定量檢測炭疽芽孢桿菌。所述PlyG蛋白為如下(I)或(2):(I)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(2)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有裂解酶活性的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。所述試劑盒還可包括Iuc蛋白。所述Iuc蛋白為如下(3)或(4):(3)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(4)將序列3的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有熒光素酶活性的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。所述試劑盒還可包括D-熒光素。所述試劑盒還可包括Profile-13560(10X)ATP微生物快速檢測系統(tǒng)。所述試劑盒還可包括記載有如下公式的載體:y=l.2587X-3.2879，x代表蠟樣芽孢桿菌RSVFl總數(shù)以10為底的對數(shù)值，y代表發(fā)光值以10為底的對數(shù)值。所述試劑盒還可包括記載有如下公式的載體:y=l.2587X-3.2879，x代表炭疽芽孢桿菌總數(shù)以10為底的對數(shù)值，y代表發(fā)光值以10為底的對數(shù)值。本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述的試劑盒在定量檢測蠟樣芽孢桿菌RSVFl中的應(yīng)用。應(yīng)用以上所述試劑盒檢測蠟樣芽孢桿菌RSVFl時，每個反應(yīng)可以采用50μID-熒光素/熒光素酶混合溶液、50μIPlyG蛋白濃度為0.09mg/ml的PlyG蛋白稀釋液和50μI待測菌液。本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述的試劑盒在定量檢測炭疽芽孢桿菌中的應(yīng)用。應(yīng)用以上所述試劑盒檢測炭疽芽孢桿菌時，每個反應(yīng)可以采用50μID-熒光素/熒光素酶混合溶液、50μIPlyG蛋白濃度為0.09mg/ml的PlyG蛋白稀釋液和50μI待測菌液。本發(fā)明還保護(hù)所述PlyG蛋白在制備定量檢測蠟樣芽孢桿菌RSVFl的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)所述PlyG蛋白在制備定量檢測炭疽芽孢桿菌的試劑盒中的應(yīng)用。目前以ATP生物發(fā)光法定量檢測細(xì)菌的研究往往采用細(xì)胞裂解液來裂解細(xì)菌從而釋放ΑΤΡ，大多不具有特異性和專一性。本發(fā)明以噬菌體裂解酶(PlyG)和熒光素酶(Iuciferase)為關(guān)鍵工具，以蠟樣芽孢桿菌RSVFl為模型，建立了熒光發(fā)光值與細(xì)菌數(shù)量之間的線性關(guān)系且二者相關(guān)性顯著(R2=0.9898)。本發(fā)明所建立的方法具備靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測快速等優(yōu)點，為特異性定量檢測炭疽桿菌的研究及試劑盒開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。對特異定量檢測炭疽桿菌的研究提供了有力的理論支持。圖1為PCR擴(kuò)增得到的PlyG、Iuc基因片段；M:BM2000DNAMarker；1=PlyG基因片段；2:luc基因片段。圖2為重組質(zhì)粒pET22b_PlyG和重組質(zhì)粒pET_luc的雙酶切鑒定結(jié)果；Ml:BM2000DNAMarker；1:重組質(zhì)粒pET22b_PlyG的雙酶切鑒定結(jié)果；2:重組質(zhì)粒pET22b_luc的雙酶切鑒定結(jié)果；M2:1kbLadderDNAMarker。圖3為SDS檢測裂解酶與熒光素酶的表達(dá)純化結(jié)果；Ml:蛋白質(zhì)Marker(低)；M2:蛋白質(zhì)Marker(寬)；1:將質(zhì)粒pET22b(+)導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)得到的對照菌進(jìn)行步驟4得到的上清液；2:重組菌甲步驟4得到的上清液；3:純化后的PlyG蛋白液；4:重組菌乙步驟4得到的上清液；5:純化后的Iuc蛋白液。圖4為裂解酶的酶活性檢測。圖5為以平板計數(shù)的細(xì)菌總數(shù)的對數(shù)值[Ig(Cfu)]為X軸，以發(fā)光值的對數(shù)值[Ig(RLU)]為Y軸，制作的X、Y散點圖描繪關(guān)系曲線。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。裂解酶(又稱PlyG蛋白)如序列表的序列I所示，其cDNA的開放閱讀框如序列表的序列2所示。熒光素酶(又稱Iuc蛋白)如序列表的序列3所示，其cDNA的開放閱讀框如序列表的序列4所示。限制性內(nèi)切酶Nde1、EcoRI_HF和T4DNA連接酶購自NEB公司。2XTransTaqHiFiPCRSuperMixII購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒購自德國QIAGEN公司；DNAMarker、ProteinMarker和質(zhì)粒提取試劑盒均購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司。BHI(BrainHeartInfusion)培養(yǎng)基購自美國BD醫(yī)療器械有限公司。蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)RSVFl=ATCC編號為4342;參考文獻(xiàn):AbacteriolyticagentthatdetectsandkillsBacillusanthracis,RaymondSchuch,DanielNelson&VincentA.Fischetti，NATURE|V0L418|22AU⑶ST2002，www.nature,com/nature,884-889。質(zhì)粒pET22b(+):購自Novagen公司，產(chǎn)品編號:69744-3。大腸桿菌BL21(DE3):北京全式金生物技術(shù)公司。突光素酶檢測試劑盒:購自Promega公司，產(chǎn)品目錄號:E1500。D-突光素(BeetleLuciferin,PotassiumSalt):購自Promega公司，產(chǎn)品目錄號為E1601。Profile-13560(10X)ATP微生物快速檢測系統(tǒng):購自北京浩正智信科技有限公司。實施例1、裂解酶和熒光素酶的制備一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建1、重組質(zhì)粒pET22b_PlyG的構(gòu)建(I)合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子，將合成的雙鏈DNA分子作為模板，用PlyG-F和PlyG-R組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1的泳道I。PIyG-F:5，-GGAATTCCATATG|CATCACCATCACCATCAC[ATGGAAATCCAA-3，；PIyG-R:5，~CGGAATTCTTATTTAACTTCATACCACCAACCTTT~3，。PlyG-F中，下劃線標(biāo)注限制性內(nèi)切酶NdeI的酶切識別序列，方框標(biāo)注His_tag的編碼序列；PlyG-R中，下劃線標(biāo)注限制性內(nèi)切酶EcoRI的酶切識別序列。PCR擴(kuò)增程序:94°C預(yù)變性5min；94°C30sec,55°C30sec,72°C45sec,35個循環(huán)；72°C延伸7min;4°C恒溫。(2)用限制性內(nèi)切酶NdeI和EcoRI雙酶切步驟(I)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(3)用限制性內(nèi)切酶NdeI和EcoRI雙酶切質(zhì)粒pET22b(+)，回收約5400bp的載體骨架。(4)將步驟(2)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pET22b-PlyG0重組質(zhì)粒pET22b_PlyG的酶切鑒定電泳圖(NdeI和EcoRI雙酶切)見圖2的泳道1，可以觀察到約5400bp和約740bp的DNA片段。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pET22b-PlyG進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在質(zhì)粒pET22b(+)的NdeI和EcoRI酶切位點之間插入了序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。2、重組質(zhì)粒pET22b_luc的構(gòu)建(I)合成序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子，將合成的雙鏈DNA分子作為模板，用Iuc-F和Iuc-R組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1的泳道2。Iuc-F:5，-GGAATTCCATATG|CATCACCATCACCATCAC(GGATCCATGGAA-3，；Iuc-R:5’-CGGAATTCTTACACGGCGATCTTTC-3’。Iuc-F中，下劃線標(biāo)注限制性內(nèi)切酶NdeI的酶切識別序列，方框標(biāo)注His_tag的編碼序列；luc-R中，下劃線標(biāo)注限制性內(nèi)切酶EcoRI的酶切識別序列。PCR擴(kuò)增程序:94°C預(yù)變性5min；94°C30sec，55°C30sec，72°CIOOsec,35個循環(huán)；72°C延伸7min;4°C恒溫。(2)用限制性內(nèi)切酶NdeI和E·coRI雙酶切步驟(I)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(3)用限制性內(nèi)切酶NdeI和EcoRI雙酶切質(zhì)粒pET22b(+)，回收約5400bp的載體骨架。(4)將步驟(2)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pET22b_luc。重組質(zhì)粒pET22b_luc的酶切鑒定電泳圖(NdeI和EcoRI雙酶切)見圖2的泳道2，可以觀察到約5400bp和約1700bp的DNA片段。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pET22b-luc進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在質(zhì)粒pET22b(+)的NdeI和EcoRI酶切位點之間插入了序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子。二、裂解酶的制備和純化1、將重組質(zhì)粒pET22b_PlyG導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組菌甲。2、挑取步驟I得到的重組菌甲的單克隆，接種至含有ΙΟΟμg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltlnm=0.6;加入IPTG(使其濃度為lmmol/L)，16°C、200rpm振蕩培養(yǎng)24h。3、取步驟2得到的培養(yǎng)體系，IOOOOg離心IOmin,收集菌體沉淀。4、用pH7.2的PBS緩沖液重懸步驟3得到的菌體，超聲波破碎處理(使用JY88-1IDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，選擇60%功率，即功率約為20kHz，處理總時間90min，周期為超聲時間5s,間隙時間8s),IOOOOg離心IOmin,收集上清液。5、將步驟4得到的上清液用0.45μm濾膜過濾后進(jìn)行鎳柱純化。鎳柱預(yù)裝柱:上海生工生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號為BSP079-3。純化過程按照鎳柱預(yù)裝柱的說明書操作，具體如下:(I)打開開關(guān)，將柱內(nèi)的乙醇沖洗干凈；(2)用5-10倍柱體積(I柱體積=5ml,Iml樹脂可結(jié)合6mg蛋白)的N1-Native-O緩沖液平衡柱子，控制流速在lml/min;(3)上樣步驟4得到的上清液，收集的液體再過柱一次，控制流速0.5-lml/min；(4)用5倍柱體積的N1-Native-O緩沖液過柱，直至在0D=280nm檢測時沒有蛋白洗出；(5)用5-10倍柱體積的N1-Native-20緩沖液過柱并收集過柱液，控制流速在Iml/min；(6)用5-10倍柱體積的N1-Native-50緩沖液過柱并收集過柱液，控制流速在Iml/min；(7)用5-10倍柱體積的N1-Native-1OO緩沖液過柱并收集過柱液，控制流速在lml/min；(8)用5-10倍柱體積的N1-Native-250緩沖液過柱并收集過柱液，控制流速在lml/min；(9)用5-10倍柱體積的N1-Native-500緩沖液過柱并收集過柱液，控制流速在lml/min；(10)用5-10倍柱體積的N1-Native-O緩沖液平衡柱子，保存在30%的乙醇中；N1-Native-O緩沖液、N1-Native-20緩沖液、N1-Native-50緩沖液、N1-Native-1OO緩沖液、N1-Native-250緩沖液和N1-Native-500緩沖液均為鎳柱預(yù)裝柱配套出售的組件。收集N1-Native-250緩沖液和N1-Native-500緩沖液過柱后的液體并合并，即為純化后的PlyG蛋白液。將質(zhì)粒pET22b(+)代替重組質(zhì)粒pET22b_PlyG進(jìn)行以上步驟1、步驟2、步驟3、步驟4和步驟5，得到的液體作為對照溶液。純化后的PlyG蛋白液的聚丙烯酰胺電泳圖見圖3的泳道3。由圖3可見:重組菌甲步驟4得到的上清液中在相對分子量27kD處具有特異條帶，與已報道的PlyG蛋白大小一致，證明PlyG蛋白實現(xiàn)了可溶性表達(dá)；進(jìn)行鎳柱純化后得到了電泳純的PlyG蛋白液。純化后的PlyG蛋白液中的蛋白濃度為0.9mg/ml。三、熒光素酶的制備和純化1、將重組質(zhì)粒pET22b_luc導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組菌乙。用重組菌乙代替重組菌甲進(jìn)行步驟二的2至5。得到純化后的Iuc蛋白液。純化后的Iuc蛋白液的聚丙烯酰胺電泳圖見圖3的泳道5。由圖3可見，重組菌甲步驟4得到的上清液中在相對分子量60kD處具有特異條帶，與已報道的Iuc蛋白大小一致，證明Iuc蛋白實現(xiàn)了可溶性表達(dá)，進(jìn)行鎳柱純化后得到了電泳純的Iuc蛋白液。純化后的PlyG蛋白液中的蛋白濃度為0.3mg/ml。四、裂解酶的酶活性檢測1、用直徑為IOcm的培養(yǎng)皿制備裝有20ml固體BHI培養(yǎng)基的平板，將半固體BHI培養(yǎng)基于55°C加熱(55°C條件為純液體狀態(tài))，取5ml半固體BHI培養(yǎng)基加入500微升對數(shù)期的蠟樣芽孢桿菌RSVFl菌液，混勻后均勻倒至固體BHI培養(yǎng)基平板上，室溫靜置lOmin，使其凝固。2、吸取1.5μI步驟二制備的純化后的PlyG蛋白液，滴加于步驟I的BHI培養(yǎng)基平板的一個點；吸取1.5μIρΗ7.2的PBS緩沖液，滴加于步驟I的BHI培養(yǎng)基平板的另一個點，30°C靜置30min，然后30°C倒置培養(yǎng)6h后拍照。照片見圖4。滴加純化后的PlyG蛋白液的區(qū)域出現(xiàn)透亮的圓形裂解斑，直徑約5mm。滴加PBS緩沖液的區(qū)域沒有裂解斑產(chǎn)生。五、熒光素酶的酶活性檢測1、用PH7.2的PBS緩沖液梯度稀釋步驟三得到的純化后的Iuc蛋白液。2、將10μI稀釋液與50μI熒光素酶檢測試劑盒中的檢測底物混合，置于熒光測定儀器(Profile-13560(IOX)ATP微生物快速檢測系統(tǒng))中測得相對發(fā)光單位(RLU)。進(jìn)行三次重復(fù)實驗，以測得數(shù)值的平均值來表征熒光素酶的相對活性。純化后的Iuc蛋白液中，Iuc蛋白作為熒光素酶的比活力為3.3X1010RLU/mgo實施例2、制備不同濃度的蠟樣芽孢桿菌RSVFl菌液將蠟樣芽孢桿菌RSVFl的單菌落接種至3mlLB液體培養(yǎng)基，30°C、200rpm振蕩培養(yǎng)12小時，得到PO菌液。用LB液體培養(yǎng)基將PO菌液稀釋至10倍體積，即為Pl菌液。用LB液體培養(yǎng)基將PO菌液稀釋至20倍體積，即為P2菌液。用LB液體培養(yǎng)基將PO菌液稀釋至100倍體積，即為P3菌液。用LB液體培養(yǎng)基將PO菌液稀釋至200倍體積，即為P4菌液。用LB液體培養(yǎng)基將PO菌液稀釋至1000倍體積，即為P5菌液。用LB液體培養(yǎng)基將PO菌液稀釋至2000倍體積，即為P6菌液。用LB液體培養(yǎng)基將PO菌液稀釋至10000倍體積，即為P7菌液。用LB液體培養(yǎng)基將PO菌液稀釋至20000倍體積，即為P8菌液。用LB液體培養(yǎng)基將PO菌液稀釋至100000倍體積，即為P9菌液。實施例3、平板計數(shù)法定量檢測蠟樣芽孢桿菌RSVFl將實施例2制備的PO菌液、Pl菌液、P2菌液、P3菌液、P4菌液、P5菌液、P6菌液、P7菌液、P8菌液或P9菌液分別作為待測菌液進(jìn)行如下步驟:吸取50μI待測菌液涂布于固體LB培養(yǎng)基平板，37°C倒置培養(yǎng)12小時；每種菌液設(shè)置三個重復(fù)處理，同時做空白對照。選取菌落數(shù)在30-300范圍內(nèi)的稀釋度作為標(biāo)準(zhǔn)計算平均值，為平板計數(shù)結(jié)果。每個待測菌液做三組重復(fù)實驗，計算平均值為最終結(jié)果。PO菌液、Pl菌液、P2菌液、P3菌液、P4菌液、P5菌液、P6菌液、P7菌液、P8菌液和P9菌液含有的蠟樣芽孢桿菌RSVFl的濃度見表I。實施例4、應(yīng)用裂解酶和熒光素酶通過ATP發(fā)光法檢測蠟樣芽孢桿菌RSVFlATP普遍存在于所有活的生物體中，當(dāng)生物體死亡后，在細(xì)胞內(nèi)酶的作用下，ATP很快被分解掉。所以通過測定樣品中的ATP濃度，即可推算出活菌數(shù)。熒光素酶以D-熒光素、ATP、O2為底物，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能，發(fā)出熒光。將實施例2制備的PO菌液、Pl菌液、P2菌液、P3菌液、P4菌液、P5菌液、P6菌液、P7菌液、P8菌液或P9菌液分別作為待測菌液進(jìn)行如下步驟:1、將D-熒光素、實施例1的步驟三制備的純化后的Iuc蛋白液和pH7.2的PBS緩沖液混合，使D-熒光素濃度為150mg/L,Iuc蛋白濃度為100mg/L,即為D-熒光素/熒光素酶混合溶液。2、用pH7.2的PBS緩沖液將實施例1的步驟二制備的純化后的PlyG蛋白液稀釋至10倍體積，得到PlyG蛋白稀釋液。3、取50μI待測菌液，加入過濾比色杯中，比色杯下鋪一層濾紙，然后滴加4滴SRA試劑(非細(xì)菌細(xì)胞釋放液)，用壓力器對準(zhǔn)比色杯頂端，按下壓力器把液體壓出至濾紙，再次滴加4滴SRA試劑，用壓力器對準(zhǔn)比色杯頂端，按下壓力器把液體壓出至濾紙。4、將步驟3得到的比色杯放入3560(10Χ)微光度計的抽屜中，加入50μI步驟2得到的PlyG蛋白稀釋液，放置2min以使細(xì)菌充分被裂解。5、吸取50μ1步驟1得到的D-熒光素/熒光素酶混合溶液加入到步驟4得到的比色杯中，吸排混勻3次，推回抽屜，記錄儀器讀數(shù)。過濾比色杯、SRA試劑和3560(IOX)微光度計均為Profile-13560(IOX)ATP微生物快速檢測系統(tǒng)的組件。每個待測菌液做三組重復(fù)實驗，計算平均值為最終結(jié)果。PO菌液、Pl菌液、P2菌液、P3菌液、P4菌液、P5菌液、P6菌液、P7菌液、P8菌液或P9菌液檢出得到的發(fā)光值(RLU,relativelightunits)見表I。表I平板計數(shù)測得的待測菌液的細(xì)菌濃度與ATP發(fā)光法檢測所得的發(fā)光值權(quán)利要求1.用于定量檢測蠟樣芽孢桿菌RSVFl的試劑盒，包括PlyG蛋白；所述試劑盒的用途為如下(a)或(b):Ca)定量檢測蠟樣芽孢桿菌RSVFl；(b)定量檢測炭疽芽孢桿菌；所述PlyG蛋白為如下(I)或(2):(O由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(2)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有裂解