超聲條件下細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵制備α-葡聚糖酶的方法

超聲條件下細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵制備α-葡聚糖酶的方法超聲條件下細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵制備α-葡聚糖酶的方法本發(fā)明公開了超聲條件下細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵制備α-葡聚糖酶的方法，其特征在于在細(xì)麗毛殼菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，采用頻率20-40KHZ，功率80-120W的超聲作用，頻率為40-80分鐘/次，每次作用時(shí)間40-80秒。出乎本領(lǐng)域技術(shù)人員的合理預(yù)期，本發(fā)明通過在低頻低功率超聲條件下，采用細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵制備α-葡聚糖酶的方法，提高了細(xì)胞的生長速率，同時(shí)葡聚糖酶的酶活提高了215%?！緦＠f明】超聲條件下細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵制備α-葡聚糖酶的方法【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明屬于微生物和生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及在超聲條件下細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵制備α-葡聚糖酶的方法?！颈尘凹夹g(shù)】[0002]葡聚糖(dextran)又稱右旋糖酐，為一種多糖，存在于某些微生物在生長過程中分泌的粘液中。葡聚糖具有較高的分子量，主要由D—葡萄吡喃糖以α，1—6鍵連接，支鏈點(diǎn)有I—2、I—3、I—4連接的。隨著微生物種類和生長條件的不同，葡聚糖結(jié)構(gòu)也有差別。精糖生產(chǎn)過程中，甘蔗夾帶的腸膜明串珠菌等微生物會分泌蔗糖轉(zhuǎn)化酶來消耗蔗糖，生成大量葡聚糖，俗稱“蔗飯”。葡聚糖的積累除造成糖分的損失外，還導(dǎo)致糖液粘度增大、旋光度偏高、結(jié)晶及過濾困難等一系列問題，給糖廠的大規(guī)模生產(chǎn)及糖品質(zhì)量提高帶來諸多不利影響。[0003]目前國內(nèi)很多學(xué)者采取多種措施來減少或者消除糖液中的葡聚糖，主要分為物理法、化學(xué)法以及生物法等。物理法使用澄清、膜過濾等方法，其技術(shù)成本較高，難以廣泛推廣?；瘜W(xué)法主要加入漂白粉等殺菌劑以及青霉素、金霉素等抗生素來抑制微生物的生長。相對而言，化學(xué)法價(jià)格低廉，不需要額外設(shè)備，但化學(xué)藥品的殘留可能會對人體造成危害，而且對已形成的葡聚糖起不到降解的作用。生物法主要是使用酶解法，采用葡聚糖酶對糖汁中所含的葡聚糖進(jìn)行降解，能夠快速高效的清除糖汁中的葡聚糖，達(dá)到提高原糖產(chǎn)率、降低糖液粘度等目的。然而，當(dāng)前食品用的安全級別來源的葡聚糖酶較為稀缺，極大的限制了生物法在制糖工業(yè)中的廣泛應(yīng)用。因此，開發(fā)一種安全來源的葡聚糖酶，成為目前制糖工業(yè)所面臨的一項(xiàng)主要問題之一。[0004]細(xì)麗毛殼菌是美國及歐盟認(rèn)可的一種食品安全性菌株，在其發(fā)酵過程中能夠分泌α-葡聚糖酶。目前國內(nèi)對于利用細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵產(chǎn)α-葡聚糖酶的研究較少，主要研究集中于利用細(xì)麗毛殼菌制備α-葡聚糖酶粗酶的方法與步驟，葡聚糖酶產(chǎn)量較低，難以達(dá)到工業(yè)化應(yīng)用水平。[0005]因此，如何提高細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵制備α-葡聚糖酶的產(chǎn)量和活性，達(dá)到工業(yè)化應(yīng)用水平是本領(lǐng)域的技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問題。【發(fā)明內(nèi)容】[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述不足，提供一種在超聲條件下細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵制備α-葡聚糖酶的方法，提高α-葡聚糖酶的產(chǎn)量和活性。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案:[0007]本發(fā)明一方面涉及超聲條件下細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵制備α-葡聚糖酶的方法，其特征在于在細(xì)麗毛殼菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，采用頻率20-40ΚΗΖ(優(yōu)選25-35ΚΗΖ)，功率80-120W(優(yōu)選為90-110W)的超聲作用，頻率為40-80分鐘/次(優(yōu)選為50-70分鐘/次)，每次作用時(shí)間40-80秒(優(yōu)選為50-70秒)。[0008]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中,所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件:1.5%葡聚糖，1.0%酵母浸膏，0.5%磷酸氫二鉀和/或磷酸二氫鉀，0.1%硫酸鎂；用lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH至6.0，滅菌，在培養(yǎng)基中加入一定量滅菌碳酸鈣，以2%的接種量將細(xì)麗毛殼菌接入到培養(yǎng)基中，于轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床中30°C恒溫培養(yǎng)3_4天。[0009]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，超聲處理之后繼續(xù)將培養(yǎng)體系放入搖床培養(yǎng)。[0010]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，在細(xì)麗毛殼菌培養(yǎng)12h之后啟動超聲。[0011]出乎本領(lǐng)域技術(shù)人員的合理預(yù)期，本發(fā)明通過在低頻低功率超聲條件下，采用細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵制備α-葡聚糖酶的方法，提高了細(xì)胞的生長速率，同時(shí)葡聚糖酶的酶活提高了215%。【專利附圖】【附圖說明】[0012]圖1超聲處理對菌體干重的影響；[0013]圖2超聲處理對菌體自絮凝現(xiàn)象的影響；[0014]圖3超聲條件處理對細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵生產(chǎn)α-葡聚糖酶酶活的影響；【具體實(shí)施方式】[0015]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明的方法作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。[0016]—、發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件:1.5%葡聚糖，1.0%酵母浸膏，0.5%磷酸氫二鉀(磷酸二氫鉀)，0.1%硫酸鎂。用lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至6.0，滅菌，在培養(yǎng)基中加入一定量碳酸鈣(滅菌)，以2%的接種量將細(xì)麗毛殼接入到25mL培養(yǎng)基中，于轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床中30°C恒溫培養(yǎng)3_4天。[0017]超聲處理?xiàng)l件:發(fā)酵12h后開始超聲處理，頻率30KHZ，功率100W，超聲作用頻率為I小時(shí)/次，每次作用時(shí)間lmin。然后放入搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。[0018]二、α-葡聚糖酶酶活的測定[0019]實(shí)驗(yàn)儀器:分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、電磁爐、移液槍、25cm比色管[0020]實(shí)驗(yàn)材料:DNS試劑、α-葡聚糖酶、2.0%葡聚糖底物[0021]葡聚糖酶活測定:取900μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的葡聚糖溶液，置于50°C恒溫水浴中保溫5min，隨即加入100μL酶液，準(zhǔn)確反應(yīng)lOmin，立即加入2mL的DNS以終止反應(yīng)，于沸水浴5min,迅速將其冷卻,用蒸懼水定容至25mL,于波長540nm處測定吸光值。從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求得相對應(yīng)的葡萄糖的量，并折算出酶活。酶活定義為:在上述條件下，每分鐘從葡聚糖底物中釋放出Iμmol還原糖所需的酶量為I個(gè)酶活單位，以U/mL表示。[0022]1.超聲處理對細(xì)麗毛殼菌菌體生長情況的影響:[0023]本發(fā)明考察了超聲處理對細(xì)麗毛殼菌菌體生長情況的影響，結(jié)果證實(shí)，低頻超聲處理能夠明顯提高菌體干重(圖1)。[0024]2.超聲處理對細(xì)麗毛殼菌自絮凝現(xiàn)象的影響:[0025]本發(fā)明考察了低頻超聲處理對細(xì)麗毛殼菌自絮凝現(xiàn)象的影響(圖2)，證實(shí)低頻超聲處理能夠有效降低菌體自絮凝現(xiàn)象。[0026]3.超聲處理對α-葡聚糖酶酶活的影響:[0027]實(shí)驗(yàn)比對了超聲條件與普通搖床培養(yǎng)時(shí)，細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵生產(chǎn)α-葡聚糖酶活性變化(圖3)。[0028]研究結(jié)果證實(shí)，在細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵過程中，使用低頻超聲技術(shù)處理發(fā)酵液，能夠顯著提高菌體分散性，降低自絮凝現(xiàn)象的發(fā)生。同時(shí)，發(fā)酵液酶活性較普通搖床培養(yǎng)提高215%。以上所述，僅為本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所限定的保護(hù)范圍為準(zhǔn)?！緳?quán)利要求】1.超聲條件下細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵制備α-葡聚糖酶的方法，其特征在于在細(xì)麗毛殼菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，采用頻率20-40ΚΗΖ(優(yōu)選25-35ΚΗΖ)，功率80-120W(優(yōu)選為90-110W)的超聲作用，頻率為40-80分鐘/次(優(yōu)選為50-70分鐘/次)，每次作用時(shí)間40-80秒(優(yōu)選為50-70秒)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件:1.5%葡聚糖，1.0