實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)和分離

關(guān)于實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)和分離微生物包括哪五類：病毒細(xì)菌放線菌真菌原生生物特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,形體微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu).且體內(nèi)一般不含有葉綠素.不能進(jìn)行光合作用.

原核生物界

原生生物界真菌界病毒界一、基礎(chǔ)知識(shí)：

(一)微生物第2頁,共78頁，2024年2月25日，星期天大腸桿菌（E.coli）分布：人和哺乳動(dòng)物腸道，此外還廣泛分布于水、污水、土壤、谷類、乳制品等當(dāng)中。大腸桿菌在人體的_____中一般對(duì)人體無害，但任何大腸桿菌如果進(jìn)入__________都會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。大腸桿菌是_______工程中被廣泛采用的工具。腸道泌尿系統(tǒng)基因革蘭氏______（填陰或陽）性菌陰代謝類型：異養(yǎng)，兼性厭氧型生長適宜溫度：質(zhì)粒、EcoRⅠ限制酶、E.coli-DNA連接酶、受體細(xì)胞37℃左右第3頁,共78頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌的代謝類型自養(yǎng)型細(xì)菌異養(yǎng)型細(xì)菌:光合自養(yǎng)型:化能自養(yǎng)型:大部分腐生菌和寄生菌如藍(lán)細(xì)菌如硝化細(xì)菌1、同化作用類型2、異化作用類型需氧型細(xì)菌厭氧型細(xì)菌兼性厭氧型細(xì)菌大多數(shù)細(xì)菌如破傷風(fēng)桿菌如酵母菌、大腸桿菌。大腸桿菌屬于異養(yǎng)、兼性厭氧型細(xì)菌第4頁,共78頁，2024年2月25日，星期天大腸桿菌酵母菌放線菌霉菌菌落：?jiǎn)蝹€(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量生長繁殖時(shí)，所形成的肉眼可見的具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體。不同微生物形成的菌落具有不同的特征，是鑒定菌種的重要依據(jù)。如菌落的大小、形狀、邊緣、光澤度、顏色、透明度等。菌落的概念白色或乳白色，光滑大腸桿菌菌落：第5頁,共78頁，2024年2月25日，星期天芽孢

有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時(shí)以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時(shí)候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個(gè)細(xì)菌.第6頁,共78頁，2024年2月25日，星期天一、基礎(chǔ)知識(shí)：（二）培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。（1）按物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。（2）按功能分：選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。（3）按成分分：天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。1.培養(yǎng)基的類型和用途第7頁,共78頁，2024年2月25日，星期天液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長第8頁,共78頁，2024年2月25日，星期天固體培養(yǎng)基：菌落，菌苔第9頁,共78頁，2024年2月25日，星期天半固體培養(yǎng)基：無動(dòng)力有動(dòng)力(彌散)(是否運(yùn)動(dòng))

第10頁,共78頁，2024年2月25日，星期天選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基:

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:

分離固氮菌

不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基:

分離自養(yǎng)型微生物

加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基:

分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基:

分離雜交瘤細(xì)胞第11頁,共78頁，2024年2月25日，星期天天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來源受限;成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析;易發(fā)生支原體污染;

根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。

優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定;成本低缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。合成培養(yǎng)基:天然培養(yǎng)基：第12頁,共78頁，2024年2月25日，星期天血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子；③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分

人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。第13頁,共78頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基的用途液體培養(yǎng)基：增菌，常用于發(fā)酵工業(yè)固體培養(yǎng)基：增菌，菌種保存及分離純化、鑒定菌落、活菌計(jì)數(shù)等半固體培養(yǎng)基：動(dòng)力檢測(cè)，保種第14頁,共78頁，2024年2月25日，星期天不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方調(diào)節(jié)pH2、成分水、碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子(生長因子即細(xì)菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)真菌：5～6細(xì)菌：6.5～

7.5有時(shí)會(huì)加一定量的氯化鈉以維持一定的滲透壓第15頁,共78頁，2024年2月25日，星期天1.無菌操作的概念

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止________污染的方法。四、無菌操作_________必須無菌、_________也必須要無菌、___________時(shí)不能帶入其他雜菌主要包括：雜菌2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別

消毒：使用較溫和理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部的一部分對(duì)人體有害的微生物的過程。不能殺死芽孢和孢子。滅菌：使用強(qiáng)烈的理化因素消滅物體內(nèi)外所有微生物，包括芽孢和孢子。各種器具培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移菌種第16頁,共78頁，2024年2月25日，星期天比較消毒與滅菌較為溫和部分生活狀態(tài)的微生物不能能全部微生物強(qiáng)烈第17頁,共78頁，2024年2月25日，星期天高壓蒸汽滅菌（濕熱滅菌）灑精燈灼燒滅菌干熱滅菌（1）滅菌方法：3、常用的滅菌和消毒的方法培養(yǎng)基、無菌水、各種耐高溫的玻璃金屬器具100kPa、121℃下維持15-30min需要保持干燥耐高溫的玻璃金屬器皿160-170℃下加熱1-2h接種環(huán)等金屬器具第18頁,共78頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共78頁，2024年2月25日，星期天1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學(xué)藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒……(2)消毒的方法：3.常用的消毒與滅菌的方法第20頁,共78頁，2024年2月25日，星期天請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。第21頁,共78頁，2024年2月25日，星期天（一）制備LB培養(yǎng)基（通用的細(xì)菌培養(yǎng)基）1、配方：蛋白胨0.5克，酵母提取物0.25克，氯化鈉0.5克，水50ml（配固體培養(yǎng)基再加瓊脂1克）溶解計(jì)算稱量調(diào)pH分裝加塞，包扎2、流程二操作步驟滅菌倒平板第22頁,共78頁，2024年2月25日，星期天①分裝：注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，因此在將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到三角瓶或試管中時(shí)必須用__________。②加塞：試管用塑料蓋或________；三角瓶口用_______或_________封口,再用_________或報(bào)紙封口。③包扎：用________或報(bào)紙三角漏斗棉花塞封口膜6層紗布牛皮紙牛皮紙高壓蒸氣滅菌法④滅菌1）加水：2）裝鍋：向外層鍋內(nèi)加入適量的水，加水的要求是_________.物品放置的要求______________________：加蓋：將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的_______內(nèi)。再以________方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。不觸及內(nèi)膽整齊、穩(wěn)定、留出空隙排氣槽兩兩對(duì)稱第23頁,共78頁，2024年2月25日，星期天3）加熱排氣：4）保溫保壓：5）出鍋：

打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的_______。_________________后，關(guān)上排氣閥。

當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到_______kg/cm2時(shí)，控制熱源，維持壓力至______min。

切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力降至____時(shí)，打開________，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。冷空氣待冷空氣完全排盡0115排氣閥否則會(huì)因鍋內(nèi)壓力較高，打開氣閥后造成的壓力差可能使容器內(nèi)的培養(yǎng)基噴濺造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染，甚至使容器爆炸。滅菌后，通常將實(shí)驗(yàn)用具放入60℃~80℃_____中烘干，以除去滅菌時(shí)的水分，避免引起_____。烘箱污染第24頁,共78頁，2024年2月25日，星期天倒平板：待培養(yǎng)基冷卻至_____℃時(shí)，將每只培養(yǎng)皿倒入_________ml未凝固的固體培養(yǎng)基，置于_____位置上，輕輕晃動(dòng)使其均勻鋪滿平皿底部，待凝，使之形成平面。_______備用。制斜面：將未凝固的固體培養(yǎng)基的試管____放，冷卻待凝使即成為斜面。６０10～12水平倒置斜⑤倒平板、制斜面操作平臺(tái)：滅菌好的培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)器具置于超凈臺(tái)上打開_________和___________，滅菌30min.過濾風(fēng)紫外線超凈臺(tái)第25頁,共78頁，2024年2月25日，星期天思考題：A、操作過程中避免帶入雜菌的方法有哪些？1、滅菌后的培養(yǎng)基、器具置于超凈臺(tái)上，并打開超凈臺(tái)的紫外燈和過濾風(fēng)，滅菌30分鐘。2、用鑷子夾出灑精棉球擦拭桌面和實(shí)驗(yàn)者雙手。3、整個(gè)操作在酒精燈火焰旁進(jìn)行4、打開后或加塞前試管口、三角瓶口灼燒滅菌。B、培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60后才倒平板，你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度呢？可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。第26頁,共78頁，2024年2月25日，星期天思考題C、為何要將平板倒置？平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落培養(yǎng)基，造成污染。

D、在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。E、如何檢查培養(yǎng)基是否受雜菌的污染？將未接種的培養(yǎng)基放在恒溫箱中培養(yǎng)，若無菌落產(chǎn)生則未受雜菌污染。第27頁,共78頁，2024年2月25日，星期天（二）液體培養(yǎng)基接種培養(yǎng)主要器具：操作方法：先將接種環(huán)進(jìn)行_____滅菌,______后的接種環(huán)挑取少量菌種，放入三角瓶的液體培養(yǎng)基中，加塞。置于____℃搖床振蕩培養(yǎng)１２小時(shí)。無菌操作：略搖床思考：如何冷卻接種環(huán)？可通過接觸試管內(nèi)壁或未長菌的培養(yǎng)基達(dá)到冷卻的目的。接種環(huán)、搖床等３７灼燒冷卻第28頁,共78頁，2024年2月25日，星期天（三）平板劃線分離法主要器具：操作過程：注意：無菌操作方法：同前。將培養(yǎng)皿______（蓋在下），放于_____℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)__________小時(shí)。在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，要從上一次劃線的開始________劃線。接種環(huán)、思考：若如上圖所示進(jìn)行劃線分離，則接種環(huán)總共進(jìn)行幾次灼燒滅菌？恒溫培養(yǎng)箱。每次劃線前接種環(huán)都要灼燒滅菌，再冷卻。末端１２～２４倒置３７第29頁,共78頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共78頁，2024年2月25日，星期天

平板劃線的操作方法交叉劃線法連續(xù)劃線法

第31頁,共78頁，2024年2月25日，星期天

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？

操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到單個(gè)菌落。2、在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。第32頁,共78頁，2024年2月25日，星期天3.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。4.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。5、如何判斷接種操作是否符合無菌要求？如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達(dá)到要求。第33頁,共78頁，2024年2月25日，星期天（四）稀釋涂布平板法主要器具：玻璃三角刮刀、移液管或吸管操作過程：先將培養(yǎng)菌液稀釋（10-5~10-7倍）用移液管或吸管取0.1ml稀釋度不同的菌液，加在平板上，用無菌玻璃三角刮刀均勻涂布在培養(yǎng)基平面上。在適當(dāng)稀釋度下，可培養(yǎng)得到相互分開的的菌落。將培養(yǎng)皿倒置（蓋在下），放于３７℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)１２～２４小時(shí)。劃線分離方法簡(jiǎn)單；涂布分離，易形成單菌落，但操作復(fù)雜些。第34頁,共78頁，2024年2月25日，星期天10g土樣從土壤中分離微生物稀釋涂布法第35頁,共78頁，2024年2月25日，星期天（五）斜面接種及菌種保存主要器具：操作過程：在無菌操作下，用接種環(huán)挑取___菌落，再用劃線法（自斜面底部向上輕輕劃直線）接種在_____上，_____℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)____小時(shí)后，____℃冰箱保存。無菌操作：同前試管斜面培養(yǎng)基密閉效果比平面的好很多,不容易進(jìn)入雜菌，同時(shí)能用來做純細(xì)菌的長期保存。思考：菌種保存為何采用斜面而不是平板？接種環(huán)、恒溫箱、冰箱單斜面３７２４４第36頁,共78頁，2024年2月25日，星期天菌種的保存1、臨時(shí)保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。

2、長期保存：甘油冷凍管藏法第37頁,共78頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實(shí)驗(yàn)步驟：一配制LB培養(yǎng)基溶解計(jì)算稱量調(diào)pH分裝加塞，包扎滅菌二倒平板、制斜面三大腸桿菌的培養(yǎng)三大腸桿菌的分離平板劃線分離法（或稀釋涂布平板法）使所需細(xì)菌大量繁殖獲得單菌落，純化菌株四斜面接種培養(yǎng)目的菌株的純培養(yǎng)和菌種保存第38頁,共78頁，2024年2月25日，星期天類型一培養(yǎng)基及無菌技術(shù)【典例1】(2015·紹興模擬)請(qǐng)回答下列與大腸桿菌有關(guān)的問題。(1)從生態(tài)系統(tǒng)的成分上看，大腸桿菌屬于

。第39頁,共78頁，2024年2月25日，星期天(2)下表是某公司研發(fā)的一種培養(yǎng)大腸桿菌菌群的培養(yǎng)基配方。第40頁,共78頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)物理狀態(tài)劃分，該培養(yǎng)基屬于

(固體、液體)培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基中的碳源是

。(3)在微生物培養(yǎng)操作過程中，為防止雜菌污染，需對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿進(jìn)行

(填“消毒”或“滅菌”)；操作者的雙手需要進(jìn)行清洗和

?？諝庵械募?xì)菌可用紫外線殺滅，其原因是紫外線能使蛋白質(zhì)變性，還能

。第41頁,共78頁，2024年2月25日，星期天(4)將配制好的培養(yǎng)基分裝到試管中，加棉塞后若干支試管一捆，包上牛皮紙并用皮筋勒緊放入

中滅菌，溫度為

，時(shí)間為

。滅菌完畢拔掉電源，待鍋內(nèi)壓力自然降到大氣壓時(shí)，將試管取出。如果棉塞上沾有培養(yǎng)基，此試管應(yīng)

。(5)使用高壓蒸汽滅菌鍋時(shí)注意，先向鍋內(nèi)倒入

。把鍋內(nèi)水加熱煮沸并將其中原有冷空氣徹底排出后，將鍋密閉。若在滅菌前，沒有排盡鍋內(nèi)的冷空氣會(huì)導(dǎo)致

。

第42頁,共78頁，2024年2月25日，星期天(6)從一支試管向另一支試管接種時(shí)注意，接種環(huán)要在酒精燈

(選填“內(nèi)焰”或“外焰”)滅菌，并且待接種環(huán)

后蘸取菌種，試管口不能離開酒精燈火焰附近，將接種的試管在適宜溫度下培養(yǎng)，長成菌落后放入

冰箱中保存。第43頁,共78頁，2024年2月25日，星期天【解題指南】解答本題需明確以下兩點(diǎn)：(1)根據(jù)表中提供的信息分析培養(yǎng)基的類型。(2)根據(jù)題干信息總結(jié)無菌操作應(yīng)注意的問題。第44頁,共78頁，2024年2月25日，星期天【解析】(1)大腸桿菌營腐生生活，從生態(tài)系統(tǒng)的成分來看，大腸桿菌屬于分解者。(2)表中的培養(yǎng)基配方中含有瓊脂，是固體培養(yǎng)基，其中能為大腸桿菌提供碳元素的物質(zhì)有蛋白胨、乳糖和蔗糖。(3)微生物培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿要進(jìn)行滅菌，操作者的雙手要進(jìn)行消毒；紫外線殺菌的原理是紫外線不僅能使蛋白質(zhì)變性，還能損傷DNA的結(jié)構(gòu)。第45頁,共78頁，2024年2月25日，星期天(4)培養(yǎng)基的滅菌應(yīng)用高壓蒸汽滅菌鍋，在壓力為1kg/cm2、溫度為121℃條件下，滅菌15min。若棉塞上沾有培養(yǎng)基，易被雜菌污染，應(yīng)廢棄。(5)使用高壓蒸汽滅菌鍋時(shí)要先加入適量水，否則沒有高壓蒸汽，還有可能損壞設(shè)備。(6)酒精燈外焰溫度高，滅菌效果好。灼燒后待冷卻后再蘸取菌種，否則會(huì)殺死菌種造成實(shí)驗(yàn)失敗。第46頁,共78頁，2024年2月25日，星期天答案：(1)分解者(2)固體乳糖、蔗糖、蛋白胨(3)滅菌消毒損傷DNA的結(jié)構(gòu)(4)高壓蒸汽滅菌鍋121℃

15min廢棄(5)適量水鍋內(nèi)溫度上升不到應(yīng)有度數(shù)，使滅菌不徹底(6)外焰冷卻4℃第47頁,共78頁，2024年2月25日，星期天【互動(dòng)探究】(1)培養(yǎng)大腸桿菌除用題中所給培養(yǎng)基外，還可用何種培養(yǎng)基？提示：LB液體培養(yǎng)基。(2)表中的培養(yǎng)基在配制時(shí)應(yīng)如何操作？提示：表中的培養(yǎng)基中含有瓊脂成分，配制時(shí)要不斷攪拌，否則易引起瓊脂糊底而使燒杯炸裂。第48頁,共78頁，2024年2月25日，星期天【加固訓(xùn)練】(2015·嘉興模擬)下面是肺炎雙球菌離體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的主要步驟：第49頁,共78頁，2024年2月25日，星期天(1)實(shí)驗(yàn)用的器皿必須是無菌的，常用

法滅菌。用此法對(duì)培養(yǎng)基滅菌時(shí)，常將培養(yǎng)基裝在

(器皿)中進(jìn)行。(2)實(shí)驗(yàn)操作需在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。工作臺(tái)上，實(shí)驗(yàn)前一段時(shí)間需打開，而實(shí)驗(yàn)中需關(guān)閉的是

。A.酒精燈B.照明燈C.過濾風(fēng)D.紫外燈(3)平面培養(yǎng)基與懸浮培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基相比，應(yīng)增加的成分是

。

第50頁,共78頁，2024年2月25日，星期天(4)常用涂布法給平面培養(yǎng)基接種。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)A.接種的目的是使細(xì)菌相互分離B.接種需過濾除去雜菌后進(jìn)行C.接種工具需灼燒后使用D.接種需在酒精燈火焰旁進(jìn)行(5)在37℃恒溫箱中培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)皿需

，主要目的是避免水滴影響

的形成。(6)培養(yǎng)后，如果觀察到菌落重疊，則在涂布法接種之前需進(jìn)行

操作。第51頁,共78頁，2024年2月25日，星期天【解析】(1)微生物培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中的各種器皿常采用高壓蒸汽滅菌法進(jìn)行滅菌，培養(yǎng)基則裝在三角瓶中再進(jìn)行滅菌。(2)在超凈工作臺(tái)上操作時(shí)應(yīng)關(guān)閉紫外燈，避免對(duì)實(shí)驗(yàn)者造成傷害。(3)平面培養(yǎng)基因含有瓊脂而呈固體或半固體狀態(tài)。(4)接種的目的是為了得到所需要的細(xì)菌，在無菌條件下進(jìn)行，雜菌和肺炎雙球菌大小差不多，所以用過濾的方法是不能除去雜菌的。(5)培養(yǎng)皿在培養(yǎng)箱中應(yīng)倒置，防止水滴滴落污染培養(yǎng)基，影響單菌落的形成。(6)如果菌落重疊，說明菌液濃度過高，需要稀釋。第52頁,共78頁，2024年2月25日，星期天答案：(1)高壓蒸汽滅菌三角瓶(2)D

(3)瓊脂(4)B(5)倒置單菌落(6)稀釋菌液第53頁,共78頁，2024年2月25日，星期天類型二大腸桿菌的培養(yǎng)和分離【典例2】大腸桿菌是生存在人體腸道中的正常菌群，每克糞便中含有109個(gè)，且能夠與致病菌混雜生長。如果食品和飲用水中出現(xiàn)大腸桿菌，就意味著食物可能被糞便污染而帶上致病菌，因而常將大腸桿菌的數(shù)量作為食品衛(wèi)生的檢測(cè)指標(biāo)之一。請(qǐng)據(jù)此回答下列問題：第54頁,共78頁，2024年2月25日，星期天(1)測(cè)定街邊出售的奶茶中大腸桿菌的數(shù)目，常用涂布分離法進(jìn)行測(cè)定。該方法首先配制LB

培養(yǎng)基，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌后冷卻至60℃，在

旁倒在培養(yǎng)皿中形成平板；對(duì)奶茶樣品進(jìn)行一定倍數(shù)的稀釋，取0.1mL奶茶稀釋液，加在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上，用

涂布在培養(yǎng)基平面上，然后進(jìn)行培養(yǎng)；觀察統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)皿中

數(shù)目；該數(shù)據(jù)比實(shí)際數(shù)值要

(填“高”或“低”)，原因是

。實(shí)驗(yàn)完成后需要對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行

處理，然后才能倒掉。

第55頁,共78頁，2024年2月25日，星期天(2)若要對(duì)上述培養(yǎng)基中的菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，則需配制LB

培養(yǎng)基，滅菌后，將

在酒精燈火焰上燒紅后冷卻，然后蘸取單菌落中的菌體接種到新的培養(yǎng)基中，在適宜環(huán)境中培養(yǎng)

h即可。第56頁,共78頁，2024年2月25日，星期天【解析】(1)微生物的分離通常用固體培養(yǎng)基。為防止雜菌污染，要在酒精燈火焰旁倒平板。在用涂布分離法分離細(xì)菌時(shí)，為了使細(xì)菌均勻涂布在固體培養(yǎng)基上，常用玻璃刮刀把菌液涂布在培養(yǎng)基上。通過觀察菌落數(shù)推算細(xì)菌數(shù)目。培養(yǎng)基中可能有兩個(gè)或多個(gè)細(xì)菌緊挨在一起，共同形成一個(gè)菌落，因此觀察到的菌落數(shù)可能比實(shí)際菌落數(shù)低。為了防止實(shí)驗(yàn)菌污染環(huán)境，實(shí)驗(yàn)完成后需要對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌處理，然后才能倒掉。第57頁,共78頁，2024年2月25日，星期天(2)對(duì)微生物進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，通常使用液體培養(yǎng)基。一般用接種環(huán)轉(zhuǎn)移帶菌的培養(yǎng)物。接種時(shí)，先將接種環(huán)在明火上燒紅后冷卻，然后蘸取帶菌的培養(yǎng)物，接種到新的培養(yǎng)基中。在液體培養(yǎng)基中，只要接種培養(yǎng)12h，每毫升培養(yǎng)基中就有幾億個(gè)細(xì)菌。答案：(1)固體酒精燈火焰玻璃刮刀(涂布棒)菌落低培養(yǎng)基中可能有兩個(gè)或多個(gè)細(xì)菌緊挨在一起，共同形成一個(gè)菌落滅菌(2)液體接種環(huán)12第58頁,共78頁，2024年2月25日，星期天【加固訓(xùn)練】(2015·杭州模擬)大腸桿菌是生活在人和高等動(dòng)物體內(nèi)的一種常見細(xì)菌，在飲用水的檢測(cè)中常用它作為水源是否受到污染的指示菌，在遺傳學(xué)上常作為實(shí)驗(yàn)材料，在基因工程中常用它作為受體細(xì)胞，為人類的健康和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展作出了許多貢獻(xiàn)。請(qǐng)回答下列有關(guān)大腸桿菌的問題：(1)在大腸桿菌培養(yǎng)過程中，除考慮營養(yǎng)條件外，還要考慮

、

和滲透壓等條件。由于該細(xì)菌具有體積小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易培養(yǎng)、

等優(yōu)點(diǎn)，因此常作為遺傳學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)材料。第59頁,共78頁，2024年2月25日，星期天(2)分離大腸桿菌時(shí)常用的接種方法是

法和

法。前者操作簡(jiǎn)單，后者

更易分開，但操作復(fù)雜些。(3)培養(yǎng)大腸桿菌時(shí)，在接種前需要檢測(cè)培養(yǎng)基是否被污染。對(duì)于固體培養(yǎng)基應(yīng)采用的檢測(cè)方法是將未接種的培養(yǎng)基在適宜的溫度下放置適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，觀察

。第60頁,共78頁，2024年2月25日，星期天(4)若用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)大腸桿菌活菌的個(gè)數(shù)，要想使所得估計(jì)值更接近實(shí)際值，下列對(duì)操作過程說法不妥的是(

)A.嚴(yán)格操作、多次重復(fù)B.保證待測(cè)樣品稀釋的濃度比較合適C.倒平板培養(yǎng)D.計(jì)數(shù)所有菌落，取其平均值(5)通常對(duì)獲得的純菌種還可以依據(jù)菌落的形狀、大小、硬度和顏色等

對(duì)細(xì)菌進(jìn)行初步的鑒定(或分類)。第61頁,共78頁，2024年2月25日，星期天【解題指南】解答本題的關(guān)鍵有兩個(gè)方面：(1)在微生物培養(yǎng)操作過程中需要滅菌，不同的對(duì)象采用的滅菌方法不同。比較各種滅菌方法，并說明各種方法能消滅細(xì)菌的原因。(2)菌種的鑒定通常使用固體培養(yǎng)基，根據(jù)菌落的特征鑒定菌種，不能用單個(gè)的細(xì)菌進(jìn)行菌種鑒定。第62頁,共78頁，2024年2月25日，星期天【解析】(1)大腸桿菌的培養(yǎng)除需要合適的營養(yǎng)條件外，還需要適宜的溫度、酸堿度(pH)和滲透壓。由于大腸桿菌變異類型容易選擇、繁殖速度快，常作為遺傳學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)材料。(2)分離微生物常用的接種方法有劃線分離法和涂布分離法。前者方法簡(jiǎn)單；后者單菌落更易分開，但操作復(fù)雜些。第63頁,共78頁，2024年2月25日，星期天(3)培養(yǎng)大腸桿菌時(shí)，在接種前需要檢測(cè)培養(yǎng)基是否被污染。對(duì)于固體培養(yǎng)基應(yīng)采用的檢測(cè)方法是將未接種的培養(yǎng)基在適宜的溫度下放置適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，觀察培養(yǎng)基上是否有菌落產(chǎn)生。若固體培養(yǎng)基被細(xì)菌污染，在適宜條件下培養(yǎng)一段時(shí)間，細(xì)菌會(huì)大量繁殖，形成菌落，可根據(jù)菌落數(shù)量的多少判斷污染程度。第64頁,共78頁，2024年2月25日，星期天(4)若用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)大腸桿菌活菌的個(gè)數(shù)，要想使所得估計(jì)值更接近實(shí)際值，應(yīng)該采用倒平板培養(yǎng)，并且嚴(yán)格操作、多次重復(fù)；保證待測(cè)樣品稀釋的濃度比較合適。(5)對(duì)獲得的純菌種還可以依據(jù)菌落的形狀、大小等菌落特征對(duì)細(xì)菌進(jìn)行初步的鑒定。第65頁,共78頁，2024年2月25日，星期天答案：(1)溫度酸堿度(pH)生活周期短(或繁殖快)(2)劃線分離涂布分離單菌落(3)培養(yǎng)基上是否有菌落產(chǎn)生(4)D

(5)菌落特征第66頁,共78頁，2024年2月25日，星期天類型三分離以尿素為氮源的微生物【典例3】(2012·浙江高考)幽門螺桿菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因素。在患者體內(nèi)采集樣本并制成菌液后，進(jìn)行分離培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)基本步驟如下：第67頁,共78頁，2024年2月25日，星期天請(qǐng)回答：(1)在配制培養(yǎng)基時(shí)，要加入尿素和酚紅指示劑，這是因?yàn)镠p含有

，它能以尿素作為氮源；若有Hp，則菌落周圍會(huì)出現(xiàn)

色環(huán)帶。(2)下列對(duì)尿素溶液進(jìn)行滅菌的最適方法是

滅菌。A.高壓蒸汽B.紫外燈照射C.70%酒精浸泡D.過濾第68頁,共78頁，2024年2月25日，星期天(3)步驟X表示

。在無菌條件下操作時(shí)，先將菌液稀釋，然后將菌液

到培養(yǎng)基平面上。菌液稀釋的目的是為了獲得

菌落。(4)在培養(yǎng)時(shí)，需將培養(yǎng)皿倒置并放在

中。若不倒置培養(yǎng)，將導(dǎo)致

。(5)臨床上用14C呼氣實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人體是否感染Hp，其基本原理是Hp能將14C標(biāo)記的

分解為NH3和14CO2。

第69頁,共78頁，2024年2月25日，星期天【解題指南】解答本題需注意兩個(gè)方面：(1)細(xì)菌和真菌的培養(yǎng)步驟一般為配制培養(yǎng)基、高溫滅菌、冷卻倒平板、接種、適宜條件下進(jìn)行培養(yǎng)，依據(jù)這一步驟推測(cè)X的名稱。(2)檢測(cè)尿素是否分解依據(jù)其分解產(chǎn)物呈堿性，用酸堿指示劑酚紅檢測(cè)。